Essai standardisé de cytométrie en flux utilisant des panneaux d’anticorps recombinants séchés pour la caractérisation des cellules CAR T

Résumé

Ce protocole démontre comment les panneaux d’anticorps recombinants séchés simplifient la caractérisation des cellules du récepteur chimérique de l’antigène T (CAR T) en réduisant la variabilité et en simplifiant les flux de travail. Il permet une évaluation reproductible des attributs de qualité critiques, y compris la quantification absolue des lymphocytes T récepteurs de l’antigène chimérique, et est compatible entre différentes plateformes de cytométrie en flux.

Résumé

La cytométrie en flux est couramment utilisée pour évaluer les attributs critiques de qualité des cellules du récepteur chimérique de l’antigène T (CAR T), notamment la viabilité, le phénotype et l’efficacité de la transduction. Les flux de travail conventionnels des réactifs liquides nécessitent plusieurs étapes de préparation, ce qui peut introduire une variabilité et des différences dans la manipulation dépendante de l’opérateur. Les panneaux d’anticorps recombinants séchés préformulés offrent un format alternatif qui combine la technologie des anticorps recombinants avec une configuration prête à l’emploi. Les anticorps recombinants offrent une spécificité définie et une variabilité réduite d’un lot à l’autre, tandis que le format séché réduit les étapes de préparation et simplifie la manipulation des réactifs. Ici, nous présentons un flux de travail étape par étape pour l’analyse des cellules CAR T à l’aide de panneaux d’anticorps recombinants séchés. Le protocole inclut la coloration des échantillons, l’acquisition et l’analyse des données, et est accompagné d’un aperçu schématique du flux de travail. Les résultats représentatifs des colorations illustrent l’application des panneaux, et les différences de temps de travail pratique par rapport à un flux de travail classique de réactif liquide sont mises en avant. Les exemples fournis démontrent comment ces panneaux peuvent être utilisés pour simplifier la caractérisation multiparamétrique des cellules T CAR. Dans l’ensemble, ce travail fournit un cadre pratique pour la mise en œuvre de panels d’anticorps recombinants séchés dans l’analyse des cellules CAR T basée sur la cytométrie en flux.

Introduction

Les thérapies à cellules T CAR ont émergé comme une avancée majeure dans le traitement du cancer, en particulier pour les cancers hématologiques. Cette approche utilise le système immunitaire du patient en modifiant les lymphocytes T pour exprimer des récepteurs antigéniques chimériques (CAR) qui reconnaissent et ciblent les cellules^{cancéreuses 1}. Cependant, l’infrastructure très complexe et les processus de fabrication à forte intensité de main-d’œuvre nécessaires pour produire les cellules CAR T rendent une caractérisation rigoureuse et standardisée essentielle pour garantir à la fois la qualité du produit et la sécurité des patients. Une part importante du coût total de la thérapie CAR T provient des travaux laboratoires approfondis et des procédures de contrôle qualité (QC), dont beaucoup impliquent des flux de travail manuels en plusieurs étapes. Dans ce contexte, des paramètres clés de caractérisation — tels que l’efficacité de la transduction et les tests d’identité — sont cruciaux pour évaluer le potentiel thérapeutique des cellules^{modifiées 2}. Les méthodes traditionnelles de coloration liquide en cytométrie en flux, couramment utilisées pour ces évaluations, présentent plusieurs défis. La variabilité du pipetage, les problèmes de stabilité des réactifs et le biais de l’opérateur peuvent entraîner des incohérences et des inexactitudes dans les données, compromettant potentiellement la fiabilité des^{résultats 3}.

La cytométrie en flux est une technologie fondamentale pour la caractérisation et le contrôle qualité des cellules CAR T, permettant une analyse détaillée de plusieurs paramètres cellulaires. Cependant, l’utilisation conventionnelle de réactifs liquides dans ce procédé est sujette à des pièges^{potentiels 4,5}. La variabilité du pipet peut introduire des erreurs importantes, notamment lorsqu’il s’agit de petits volumes et de plusieurs réactifs. De plus, les réactifs liquides sont susceptibles de se dégrader au fil du temps, ce qui peut compromettre leur stabilité et entraîner des résultats de coloration^{irréguliers 6}. Le biais de l’opérateur, lié à la préparation et à la manipulation manuelles, aggrave encore ces problèmes, pouvant entraîner une variabilité des résultats entre les laboratoires et même au sein des sessions du même laboratoire. Des attributs de qualité critiques tels que la viabilité cellulaire, la fréquence de transduction, le nombre de CD3⁺ et l’identité sont essentiels pour une libération sûre des produits CAR T. Il est essentiel d’assurer la précision et la cohérence de ces mesures, car elles impactent directement l’efficacité thérapeutique et la sécurité des cellules CAR^{T 1}. Par exemple, une évaluation précise de la fréquence de transduction est cruciale pour déterminer la proportion de lymphocytes T modifiés avec succès pour exprimer le CAR, tandis que le nombre et le pourcentage de CD3⁺ fournissent des informations sur la composition globale et la pureté de la population de cellules T.

Les panneaux d’anticorps séchés offrent une solution prometteuse à ces défis en assurant une délivrance régulière des réactifs et en réduisant le temps de configuration ainsi que le risque d’erreur. Ces panneaux sont composés de plusieurs anticorps séchés à partir de cocktails prémélangés. Après séchage, ces panneaux sont stables et prêts à l’emploi, éliminant ainsi le besoin d’étapes complexes de préparation et minimisant le risque d’erreur humaine ^6,7. Il est important de noter qu’il n’est pas nécessaire de reconstituer ces panneaux séchés avant utilisation — les suspensions cellulaires peuvent être ajoutées directement au mélange d’anticorps séchés. L’intégration d’anticorps recombinants dans ces formats séchés offre plusieurs avantages par rapport aux réactifs polyclonaux ou dérivés de l’hybridome conventionnels. Leur structure moléculaire garantit une grande cohérence et reproductibilité d’un lot à l’autre, réduisant la variabilité entre expériences et laboratoires. Une région FC conçue basée sur l’IgG1 humain minimise la réactivité croisée et la coloration de fond. En conséquence, le blocage de Fc n’est pas nécessaire, ce qui réduit encore le temps nécessaire pour effectuer le test cytométrique en flux. Le format séché protège les réactifs de la dégradation, maintenant leur efficacité au fil du temps et entre les lots. Cette constance est cruciale pour obtenir des résultats fiables et reproductibles dans les tests de cytométrie^{en flux 8}.

L’applicabilité des formats de réactifs séchés s’étend à différentes étapes du développement et du suivi de la thérapie par cellules CAR T. Dans le contrôle qualité de fabrication, les réactifs séchés facilitent l’échantillonnage en système fermé, assurant stérilité et consistance. Cela est particulièrement important en milieu clinique, où le maintien de l’intégrité de l’échantillon est^primordial. Pour la caractérisation du produit, les réactifs séchés permettent une évaluation précise des comptages absolus et des sous-ensembles immunitaires, essentiels pour déterminer la qualité thérapeutique des cellules CAR T. De plus, en milieu de recherche, les réactifs séchés sont inestimables pour la surveillance longitudinale des patients, permettant un suivi cohérent de la persistance des cellules CAR T au fil du temps, ce qui est essentiel pour comprendre l’efficacité et la sécurité à long terme de la thérapie.

Les avantages de l’utilisation de panneaux d’anticorps séchés en cytométrie en flux sont nombreux, l’un des plus importants étant leur capacité à réduire les erreurs de pipetage en fournissant un panneau entièrement préconfiguré, plutôt que de nécessiter la suspension manuelle et la combinaison manuelle des réactifs individuels. Contrairement aux anticorps séchés simples — qui doivent encore être reconstitués et pipetés et offrent donc principalement une durée de conservation prolongée — les panneaux séchés préassemblés éliminent plusieurs étapes de préparation manuelle. Cela simplifie le flux de travail, réduisant considérablement les possibilités de variabilité dépendante de l’opérateur. En conséquence, le processus global devient moins sujet aux erreurs, moins chronophage et moins dépendant d’une formation technique approfondie, ce qui le rend accessible à un plus large éventail de^{laboratoires 10}. De plus, le format stable et prêt à l’emploi des panneaux d’anticorps recombinants séchés garantit une performance de test cohérente et fiable entre les opérateurs et les sites^9.

Pour réaliser pleinement le potentiel de la technologie des réactifs séchés en cytométrie en flux, il est essentiel de développer un protocole étape par étape pour son utilisation. Cela inclut des directives pour la coloration des panneaux séchés, l’acquisition et l’analyse automatisée, garantissant que tous les aspects du procédé sont standardisés et optimisés pour la précision et l’efficacité. En fournissant un protocole clair et complet, les laboratoires peuvent obtenir des résultats constants et fiables, facilitant la libération sûre et efficace des produits à cellules CAR^{T 2}. Ici, nous proposons un protocole qui exploite les avantages des panneaux anticorps séchés pour répondre aux limites des méthodes traditionnelles de coloration liquide, améliorant ainsi la fiabilité, l’efficacité et la reproductibilité — des caractéristiques clés pour garantir des thérapies CAR T sûres et efficaces (Figure 1).

Protocole

Tous les échantillons humains ont été prélevés auprès de volontaires anonymes en bonne santé après l’obtention d’un consentement éclairé écrit. Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité d’éthique de l’Ärztekammer Nordrhein (#2020272) et exécutées conformément aux réglementations éthiques et de biosécurité requises.

1. Collecte et préparation d’échantillons

1. Collectez aseptiquement des échantillons de cellules du récepteur Chimérique Antigénique T (CAR T) dans les sachets de traitement pour le contrôle qualité de la fabrication.
2. Traiter rapidement les échantillons pour maintenir la viabilité cellulaire. Conservez les échantillons à 2–8 °C, protégés de la lumière, jusqu’à ce qu’ils soient tachés.
3. Déterminez le nombre de cellules de chaque échantillon avant la coloration.
4. Ajustez chaque échantillon à une concentration allant jusqu’à 10^{cellules nucléées de 6} par 100 μL à l’aide de solution physiologique tamponnée phosphate (PBS)/2 mM EDTA/tampon BSA à 0,5 %, pH 7,2.
   1. Si nécessaire, centrifugez les échantillons à 300 × g pendant 5 minutes. Aspirez complètement le surnageant.
   2. Resuspendez les cellules à la concentration appropriée.

2. Teinture sèche des panneaux

REMARQUE : Deux panneaux d’anticorps séchés préformulés sont utilisés pour colorer les échantillons : le cocktail de composition cellulaire immunitaire (ICC) recombinant séché, humain, et le cocktail de transduction CAR T recombinant séché, humain. La coloration CAR pour le panneau de transduction CAR T est cruciale. Une séparation fiable des cellules CAR-négatives et CAR-positives est nécessaire pour une détermination précise de la fréquence de transduction. Le lavage peut réduire la récupération cellulaire en raison de la perte cellulaire lors de la centrifugation et de l’aspiration. Par conséquent, les protocoles sans lavage sont généralement préférés lorsque la concentration cellulaire précise est requise.

1. ICC Cocktail (protocole sans lavage)
   1. Ajoutez 100 μL de la suspension cellulaire préparée directement au tube anticorps ICC séché. Mélangez en pipettant de haut en bas et/ou en faisant brièvement un vortex pour dissoudre complètement la pellete. Incuber pendant 10 minutes dans le noir à température ambiante (19–25 °C).
   2. Confirmez que la granulée d’anticorps séchée est complètement dissoute. Procéder directement à l’acquisition sans aucun lavage.
2. Cocktail de transduction CAR T (protocole de lavage)
   1. Ajoutez 100 μL de suspension à cellules préparées au tube de transduction CAR T séché.
   2. Ajoutez le volume approprié de réactif de détection CAR (par exemple, 2 μL). Mélangez en pipettant de haut en bas et/ou en faisant brièvement un vortex pour dissoudre complètement la pellete. Incuber pendant 10 minutes dans le noir à température ambiante (19–25 °C). Confirmez que la granulée d’anticorps séchée est complètement dissoute.
   3. Lavez les cellules en ajoutant 1 mL de tampon. Centrifugez à 300 × g pendant 5 minutes. Enlève complètement le surnageant.
3. Coloration secondaire (si nécessaire)
   1. Effectuer un second lavage (voir étape 2.2.3) pour les réactifs de détection CAR marqués à la biotine afin d’éliminer les réactifs libres conjugués à la biotine et de réduire les taches de fond.
   2. Resuspendez les cellules dans 98 μL de tampon. Ajoutez 2 μL d’anticorps secondaire marqué par la phycoyythrine (PE). Vortex brièvement pour mixer. Incuber pendant 10 minutes dans le noir à température ambiante (19–25 °C).
   3. Lavez les cellules pour éliminer les anticorps secondaires non liés (voir étape 2.2.3).
4. Préparation finale pour l’acquisition
   1. Ajustez le volume de tous les échantillons colorés (cocktail de transduction CAR T et cocktail ICC) à 300–500 μL avec tampon. Protégez les échantillons de la lumière et maintenez une température de 2 à 8 °C.
   2. Effectuer l’acquisition en moins d’une heure afin de maintenir la stabilité des fluorophores et de préserver la viabilité cellulaire.

3. Acquisition cytométrique en flux et analyse des données

1. Préparez et amorçez le cytomètre en débit, afin d’optimiser l’étalonnage et les réglages de l’instrument.
2. Allumez les lasers et rincez le système fluidique. Laissez au moins 30 minutes au banc optique pour chauffer.
3. Pendant l’échauffement, effectuez un programme de nettoyage avec une solution d’hypochlorite à 1 %.
4. Utilisez des billes de calibration pour ajuster les réglages du laser.
5. Préparez des contrôles à coloration unique pour la compensation à l’aide de jeux d’anticorps correspondants.
   1. Pour les billes : ajoutez un volume approprié de billes de contrôle positif et négatif.
   2. Pour les cellules : ajoutez 100 μL de suspension cellulaire.
   3. Pour les réactifs conjugués à la biotine : incluez un tube contenant 98 μL de tampon plus 2 μL d’anticorps secondaire marqué par PE.
   4. Vérifiez que les réactifs de compensation correspondent au cocktail d’anticorps (numéros de lot).
6. Incubez les contrôles pendant 10 à 20 secondes, le vortex pendant 5 secondes, puis incubez 10 minutes dans l’obscurité à 19 à 25 °C.
7. Diluez les échantillons avec 600 μL de tampon et mélangez soigneusement.
8. Configurez la compensation à l’aide de commandes à une seule teinture.
9. Ajustez les tensions FSC et SSC et définissez des seuils pour exclure les débris.
10. Acquérir au moins 50 000 à 100 000 lymphocytes vivants par échantillon.
11. Effectuer des barrages pour évaluer la viabilité, l’expression de CD3 et l’expression de CAR.
12. Pour la quantification absolue, déterminez la fraction des lymphocytes T CAR-positifs (f₍CAR T₎).
13. Définissez les leucocytes totaux (N₍total₎) comme ^CD45+ viables, cellules uniques après exclusion des débris.
14. Mesurez le nombre total de leucocytes par comptage direct à partir d’échantillons colorés à l’ICC, si l’instrument le soutient, ou à l’aide de billes de comptage ou d’un analyseur d’hématologue.
15. Calculer la concentration des cellules T CAR :
    
    REMARQUE : Exemple de calcul avec des valeurs tirées de la Figure 2 et de la Figure 3
    ​
    
16. Appliquer cette méthode pour la quantification des cellules T CAR à travers différents instruments et flux de travail.

Résultats

Des panneaux anticorps recombinants séchés ont été appliqués sur des échantillons de cellules T CAR⁺ pour démontrer les flux de travail de coloration par cytométrie en écoulement. Comme illustré à la Figure 1, remplacer les flux de travail conventionnels de réactifs liquides par des panneaux d’anticorps séchés préformulés élimine plusieurs étapes de préparation — y compris l’étiquetage des tubes (pour indiquer la composition des anticorps du panel ; chaque tube nécessite toujours l’identifiant d’échantillon approprié), la combinaison des réactifs et le mélange manuel — simplifiant ainsi le processus de coloration. Les tubes comportent une étiquette pouvant être scannée avec des cytomètres compatibles ou lue manuellement, offrant des options flexibles pour l’identification de l’échantillon.

Des exemples représentatifs montrent que le panel de composition des cellules immunitaires séchées permet d’identifier les sous-ensembles clés des leucocytes (Figure 2), tandis que le panel de transduction CAR T séché permet de visualiser les lymphocytes T exprimant CAR et d’évaluer la transduction (Figure 3). Le blocage de la Fc n’est pas nécessaire pour ces panneaux, et un seul contrôle isotype est nécessaire pour tous les anticorps du panneau. Ces exemples mettent en avant l’application des panneaux séchés pour l’analyse multiparamétrique des cellules T CAR et démontrent comment le flux de travail peut être exécuté efficacement avec moins d’étapes de travail pratique. La composition des panneaux d’anticorps séchés utilisés dans cette étude est fournie dans le Tableau 1.

La Figure 4 illustre la réduction du temps de préparation pour une expérience représentative lors de l’utilisation de panneaux séchés, aussi bien pour les utilisateurs moins expérimentés que pour les utilisateurs moins expérimentés. Le format séché simplifie les procédures de tache, minimise la manipulation manuelle et fournit des conseils pratiques pour la mise en œuvre et la formation des flux de travail. Il est important de noter que l’utilisation de cocktails d’anticorps séchés a permis d’obtenir des fréquences de sous-ensembles cellulaires comparables à celles obtenues avec les cocktails liquides conventionnels (Figure 5). De plus, les panneaux d’anticorps séchés sont stables à température ambiante et peuvent être conservés dans des conditions ambiantes tout au long de leur durée de conservation d’un an, contrairement aux anticorps liquides conventionnels, qui nécessitent généralement une conservation à froid. Cette stabilité permet une utilisation répétée, des études à long terme et une gestion simplifiée des stocks.

En conclusion, les exemples fournis démontrent comment les panneaux d’anticorps recombinants séchés peuvent être utilisés pour rationaliser la caractérisation multiparamétrique des cellules CAR T. Dans l’ensemble, ce travail offre une approche pratique pour la mise en œuvre de panneaux d’anticorps séchés dans l’analyse des cellules CAR T basée sur la cytométrie en flux, avec une manipulation simplifiée, des étapes de préparation réduites et des configurations de panneaux adaptables.

Figure 1 : Comparaison entre le flux de travail de coloration manuelle et les panneaux d’anticorps recombinants séchés. Le flux de travail manuel traditionnel (haut) implique plusieurs étapes de préparation, incluant l’étiquetage des tubes, la combinaison et le mélange des réactifs, ainsi que l’ajout d’échantillons, ce qui peut augmenter l’effort manuel. En revanche, le flux de travail des panneaux anticorps recombinants séchés (en bas) utilise des panneaux prémixés et séchés qui ne nécessitent que l’ajout de l’échantillon. Cette approche simplifiée réduit les étapes manuelles et simplifie le processus de coloration, illustrant l’efficacité du flux de travail et la mise en œuvre pratique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 2 : Analyse cytométrique en flux d’un échantillon de leucaphérèse coloré avec le panel d’anticorps recombinants séchés « Immune Cell Composition Cocktail ». (A) Les débris ont été exclus par gating sur FSC versus SSC pour inclure toutes les cellules. (B) Les doublets ont été retirés en utilisant une porte FSC-A contre FSC-H. (C) Les leucocytes ont été identifiés par contrôle sur des cellules CD45⁺, permettant l’exclusion des érythrocytes résiduels. (D) Les cellules mortes ont été exclues grâce à la coloration 7-AAD. (E,F) Les cellules CD3⁺ ont été identifiées et ensuite classées en cellules T (E) et cellules NKT (F) sur la base de l’expression de CD56. (G) Les lymphocytes T ont ensuite été séparés en sous-ensembles CD4⁺ et CD8⁺. (H) Au sein de la population CD3^–, les monocytes étaient définis par l’expression de CD14 et les cellules B par l’expression de CD19. (I) Les cellules restantes CD14^–/CD19^– ont été subdivisées en cellules SSC élevées/CD16^– éosinophiles, SSC élevées/CD16⁺ neutrophiles, et SSC basse/CD56⁺/CD16⁺. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 3 : Analyse cytométrique en flux des cellules CAR T CD19 (FMC63) colorées avec le panneau d’anticorps recombinants séchés « CAR T Transduction Cocktail ». (A) Les débris ont été exclus par porte sur FSC versus SSC pour inclure toutes les cellules. (B) Les doublets ont été retirés en utilisant une porte FSC-A contre FSC-H. (C) Les leucocytes ont été identifiés par porte sur des cellules CD45⁺. (D) Les cellules mortes ont été exclues sur la base de la coloration 7-AAD⁻. (E,F) Les cellules CD3⁺ ont été identifiées puis séparées en populations ^CAR+ et ^CAR−. (G) Les cellules ^CAR+ et (H) ^CAR− ont été subdivisées en sous-ensembles de cellules T CD4⁺ et CD8⁺. (I) Au sein de la population CD3⁻, les monocytes résiduels étaient définis par l’expression CD14. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 4 : Gains de temps obtenus avec des panneaux d’anticorps séchés selon les niveaux d’expérience. Pour les utilisateurs non expérimentés (à gauche) et expérimentés (à droite), le temps a été évalué pour mettre en place une expérience cytométrique en flux (panel d’anticorps recombinants séchés « Immune Cell Composition Cocktail », triplicates techniques) depuis le début de l’expérience jusqu’au début de l’incubation, incluant la manipulation des réactifs, le pipetage et la documentation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 5 : Analyse par cytométrie en flux du sang entier lysé, superposition d’un échantillon coloré avec le panel d’anticorps recombinants séchés « Immune Cell Composition Cocktail » (bleu) et un échantillon coloré avec les mêmes anticorps sous forme liquide (orange). (A) Les débris ont été exclus par gating sur FSC versus SSC pour inclure toutes les cellules. (B) Les doublets ont été retirés en utilisant une porte FSC-A contre FSC-H. (C) Les leucocytes ont été identifiés par porte sur des cellules CD45⁺, excluant ainsi les érythrocytes résiduels. (D) Les cellules mortes ont été exclues grâce à la coloration 7-AAD. (E) Des cellules CD3⁺ ont été identifiées. (F) Ces cellules ont ensuite été classées en cellules T et cellules NKT sur la base de l’expression de CD56. (G) Les lymphocytes T ont ensuite été séparés en sous-ensembles CD4⁺ et CD8⁺. (H) Au sein de la population CD3^–, les monocytes étaient définis par l’expression de CD14 et les cellules B par l’expression de CD19. (I) Les cellules restantes CD14^–/CD19^– ont été subdivisées en cellules SSC élevées/CD16^– éosinophiles, SSC élevées/CD16⁺ neutrophiles, et SSC basse/CD56⁺/CD16⁺. (J) Les fréquences obtenues avec des anticorps liquides et des panneaux de réactifs séchés ont été comparées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Objectif	V1 VioBlue	V2 VioGreen	B1 FITC	B2 PE	B3 7-AAD PerCP-Vio 700	B4 PE-Vio770	R1 APC	R2 APC-Vio770
Détermination de la viabilité cellulaire et de la composition des cellules immunitaires	CD45	CD4	CD3	CD56/CD16	7-AAD	CD19	CD14	CD8
Détermination de l’efficacité de transduction des cellules T CAR	CD45	CD4	CD3	Réactif de détection CAR	7-AAD	/	CD14	CD8

Tableau 1 : Composition des panneaux d’anticorps recombinants séchés utilisés pour l’analyse des cellules CAR T. Ce tableau liste les anticorps inclus dans chaque panel séché, en précisant l’antigène cible, le clone, le fluorochrome et la quantité typique par tube. Deux panels sont présentés : le panel « Composition des cellules immunitaires » pour l’identification des principaux sous-ensembles leucocytaires, et le panneau « Transduction CAR T » pour la détection de l’expression CAR et la caractérisation des sous-ensembles des cellules T. Les informations fournissent une référence pour la mise en œuvre du flux de travail et une adaptation optionnelle avec des anticorps conjugués liquides supplémentaires.

Discussion

Les panneaux d’anticorps recombinants séchés offrent un flux de travail simplifié et pratique pour la caractérisation des cellules CAR T en laboratoire. Le format préformulé réduit les étapes de préparation et simplifie la manipulation, aidant à limiter la variabilité dépendante de l’opérateur et à soutenir l’exécution cohérente des procédures de cytométrie à flux^{multiparamétrique 8}. Des exemples représentatifs illustrent l’utilisation de ces panels pour identifier les sous-ensembles de leucocytes, détecter l’expression de la CAR et évaluer les sous-ensembles des cellules T. Les panels peuvent également être complétés par des anticorps conjugués liquides supplémentaires pour inclure des marqueurs supplémentaires ou des sous-ensembles immunitaires, permettant une adaptation flexible à des besoins expérimentaux spécifiques ou des analyses à paramètres plus élevés.

Une détection précise de la CAR est essentielle pour la détermination fiable de la fréquence^{de transduction 1}. La séparation nette des populations CAR-négatives et positives dépend de conditions de coloration optimisées de manière appropriée, en particulier lorsque les niveaux d’expression CAR varient. Des contrôles tels que les échantillons de fluorescence moins un (FMO) peuvent permettre une surveillance précise. Dans certains cas, les étapes de lavage peuvent améliorer la discrimination en éliminant les anticorps non liés ; Cependant, ces étapes peuvent réduire la récupération cellulaire due à la perte cellulaire lors de la centrifugation et de l’aspiration. Par conséquent, des flux de travail sans lavage peuvent être préférés lorsque la quantification précise des cellules est requise.

Bien que l’approche utilise idéalement un réactif de détection spécifique au CAR qui reconnaît le domaine extracellulaire du CAR modifié, des réactifs alternatifs, tels que les anticorps ciblant les régions de liaison conservées entre les domaines de liaison et de signalisation des antigènes, peuvent également être employés. Ces alternatives permettent la détection des cellules exprimant le CAR et peuvent être intégrées dans des flux de travail lorsque les réactifs spécifiques au CAR ne sont pas disponibles, avec une optimisation appropriée.

L’intégration avec des systèmes automatisés d’acquisition et d’analyse, y compris le mode Express, peut encore simplifier la collecte et l’analyse des données, réduisant le temps de travail pratique et permettant une exécution cohérente des flux de travail entre opérateurs.

Bien que ce travail illustre la méthode, la validation formelle des essais pour la fabrication réglementée ou les tests de libération n’a pas été réalisée. La validation multicentrique n’a pas encore été réalisée, donc la reproductibilité entre les laboratoires reste à^{confirmer 5}. Cette approche repose sur des panneaux préformulés, ce qui peut limiter la flexibilité pour des applications très spécialisées. Cependant, les options de panneaux séchés sur mesure peuvent être conçues pour inclure des marqueurs ou des combinaisons spécifiques, permettant des flux de travail adaptés et surmontant les limites des panneaux standards. Les considérations de coût sont largement compensées par une réduction du temps de travail pratique et des procédures simplifiées, ce qui peut être particulièrement avantageux dans les flux de travail à haut débit.

Les travaux futurs pourraient se concentrer sur des évaluations quantitatives de la performance, la validation formelle pour un usage réglementé, et l’expansion vers des études multicentriques pour évaluer la cohérence des flux de travail entre les laboratoires. La conception personnalisée des panneaux représente une voie pratique pour élargir la couverture des marqueurs, répondre à des questions expérimentales uniques ou s’adapter aux études d’immunosurveillance longitudinale.

En résumé, les panneaux d’anticorps recombinants séchés offrent une plateforme flexible et pratique pour la cytométrie de flux des cellules CAR T. Ils réduisent les étapes de préparation, simplifient les flux de travail et soutiennent une conception expérimentale flexible, y compris des configurations de panneaux personnalisées.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
(Facultatif) Biotin Antibody, PE, REAfinity	Miltenyi Biotec	130-110-951	Seulement nécessaire si un réactif de détection CAR conjugué à la biotine est utilisé.
(Facultatif) CAR T Cell Express Mode Package	Miltenyi Biotec	160-002-376	Complément logiciel pour les analyseurs MACSQuant ; permet une passerelle automatisée et une analyse de données, bien qu'une analyse manuelle soit également possible.
Réactif de détection CAR de choix détectable dans le canal PE, par exemple, Réactif de détection CAR CD19, humain, Biotine	Miltenyi Biotec	130-129- 550	Options alternatives : Anticorps idiotype CD19 CAR FMC63, PE, REAfinity (130-127-342); Réactif de détection CAR CD22, humain, Biotine (130-126-727); Réactif de détection CAR BCMA, humain, PE (130-133-888)
Cytomètre de flux, par exemple, MACSQuant Analyzer 16	Miltenyi Biotec	130-109-803	Les tubes StainExpress sont compatibles avec tous les cytomètres de flux standard.
Cocktail de transduction StainExpress CAR T, humain	Miltenyi Biotec	130-127-638	Des configurations de panneau d'anticorps séchées personnalisées peuvent être demandées auprès de votre représentant local Miltenyi Biotec ou de l'équipe de support technique.
Cocktail de composition de cellules immunitaires StainExpress, humain	Miltenyi Biotec	130-127-637	Des configurations de panneau d'anticorps séchées personnalisées peuvent être demandées auprès de votre représentant local Miltenyi Biotec ou de l'équipe de support technique.