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Article de méthode

Analyses morphométriques de la forme : la boîte à outils logicielle d’analyse pour la quantification de la forme craniofaciale chez le poisson-zèbre

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DOI :

10.3791/70345

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27 février 2026

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Genetics, Alcohol Research Center, University of Louisville, 2Department of Pediatrics, Section of Developmental Biology, University of Colorado School of Medicine, Anschutz Medical Campus

Dans cet article

Résumé

Ce travail décrit un protocole pour quantifier la forme du cartilage craniofacial à l’aide de logiciels libres (tpsDigs2, MorphoJ et PAST) pour mesurer les changements de structure faciale chez les larves de poisson-zèbre.

Résumé

Les troubles du spectre de l’alcoolisme fœtal (TSAF) se caractérisent par un ensemble variable de troubles physiques, cognitifs et comportementaux causés par l’exposition prénatale à l’éthanol, y compris ceux affectant le squelette facial. Les loci génétiques sensibles à l’éthanol contribuent à ce haut degré de variation du FASD, ce qui complique les analyses de la forme du visage. Nous avons déjà montré que nous pouvons analyser ces changements de forme faciale issus des interactions gène-éthanol chez le poisson-zèbre. Le poisson-zèbre est un modèle idéal pour analyser cette variation pour plusieurs raisons ; (i) 70 % des gènes sont des orthologues entre humains et poissons-zèbres ; (ii) la fertilisation externe permet aux chercheurs de contrôler le moment et la posologie des traitements à l’éthanol ; (iii) la structure de leur squelette faciale est conservée par des vertébrés ; (iv) Les larves translucides permettent de voir directement les changements de la structure squelettique cranio-faciale au cours du développement. Cependant, analyser la forme du squelette craniofacial peut être difficile à évaluer pleinement par des mesures linéaires simples, car celles-ci ne capturent pas les changements globaux de forme. De plus, les changements de taille de tête peuvent compliquer l’interprétation des données. Pour y remédier, nous avons adopté une approche morphométrique, analysant la forme globale du visage à travers des analyses de composants principaux via un logiciel gratuit, tpsDigs2, MorphoJ et PAST. La combinaison de ce logiciel permet de comparer par paires la morphologie faciale globale. Ici, nous exposons notre approche et notre analyse de la forme faciale chez des mutants poisson-zèbre traités à l’éthanol, en utilisant ces programmes pour réaliser une série d’analyses statistiques multivariées complémentaires.

Introduction

Les troubles du spectre de l’alcool fœtal (TSAF) se caractérisent par un large éventail de troubles du développement, notamment comportementaux, neurologiques etphysiques 1,2. Parmi ces défauts physiques figurent des défauts craniofaciaux, tels que l’hypoplasie de lamâchoire 3,4,5,6. Bien que le moment et la posologie de l’exposition à l’éthanol contribuent à l’étiologie complexe du TSAF, la contribution génétique joue un rôle important dans l’étiologie duTSAF 6,7,8,9,10,11,12. Cette combinaison de facteurs rend l’étude des défauts faciaux dans les cohortes humaines difficile. Pour étudier l’impact de l’exposition prénatale à l’éthanol sur le développement, nous utilisons le modèle du poisson-zèbre. Le poisson-zèbre constitue un modèle solide pour le FASD, car ils partagent 70 % d’orthologues géniques avec l’humain, 82 % des gènes responsables demaladies connus 13, 14, 15, 16. En plus de la conservation génétique, les poissons-zèbres : (i) ont une forte fécondité, permettant la production simultanée de larves de poisson-zèbre, (ii) subissent une fécondation externe, ce qui permet l’étude directe des processus de développement sensibles à l’éthanol, (iii) ont un développement craniofacial des vertébrés hautement conservé et stéréotypé, et (iv) sont des embryons/larves translucides permettant la visualisation des structuressquelettiques 17. Nous avons déjà montré que des mutations dans de nombreux gènes différents du poisson-zèbre sensibilisent les embryons aux défauts faciaux induits par l’éthanol, et ces défauts peuvent être subtils et difficiles à identifier à l’œil10,18. De plus, nous avons observé que les larves sauvages traitées à l’éthanol présentent également de légères modifications de la région cranio-faciale par rapport aux larves sauvages non traitées, bien que ces changements soient encore difficiles à identifier àl’œil 10. Bien que ces changements passent inaperçus visuellement, nous avons pu montrer ces changements de forme faciale induits par l’éthanol grâce aux analyses morphométriques disponibles sur des images 2D du viscérocrâne10.

La face est une structure 3D complexe difficile à mesurer avec des mesures linéaires conventionnelles. Ces mesures linéaires uniques ne tiennent pas compte de la position relative de chaque structure mesurée par rapport aux autres structures mesurées de la face. Les analyses morphométriques corrigent ces lacunes en utilisant des configurations de forme via des repères qui tiennent compte de la position relative de toutes les structures mesurées, allant même jusqu’à contrôler les différences globales de taille18, 19, 20. Cette approche aboutit à des données plus précises, avec une résolution plus élevée et beaucoup plus faciles à visualiser, ce qui peut donner des résultats qui ne seraient pas forcément observés avec les mesures linéairesconventionnelles 18, 19, 20. De plus, les approches morphométriques peuvent effectuer des comparaisons directes entre et au sein des groupes à l’aide de méthodes statistiques multivariées. Nous décrivons ici l’utilisation du logiciel morphométrique gratuit tpsUtil, tpsDigs221, MorphoJ20 et Paleontological Statistics (PAST)22, en combinaison avec des images 2D du viscérocrâne dans des hétérozygotes sauvages et larvas non traitées et traitées à l’éthanol pour le gène de la protéine morphogénétique osseuse (Bmp) bmp7a. Bien que ces programmes aient été principalement utilisés dans des domaines axés sur la paléontologie et l’écologie, lorsqu’ils sont utilisés ensemble, ils offrent une analyse approfondie de la forme du visage. En fin de compte, dans ce protocole, nous montrons comment utiliser ces applications logicielles gratuitement disponibles pour quantifier les changements de forme du cartilage craniofacial dans le modèle du poisson-zèbre.

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Protocole

Toutes les larves de poisson-zèbre utilisées dans cette procédure ont été élevées et reproduites selon les protocoles établis de l’IACUC approuvés par l’Université deLouisville 23.

REMARQUE : La souche de poisson-zèbre bmp7aty68a24 et des frères et sœurs de type sauvage (tous en arrière-plan AB) ont été utilisées dans cette étude, les poissons adultes étant maintenus à 28,5 °C avec un cycle clair/sombre de 14/10 h. Utilisez les lignes appropriées selon les résultats expérimentaux souhaités. Utilisez de l’eau stérilisée par osmose inverse. Le sexe en tant que variable biologique ne s’applique pas aux stades de développement étudiés, car le sexe est détectable pour la première fois chez le poisson-zèbre environ 20 à 25 jours après la fécondation (dpf)25, après toutes les analyses.

1. Traitement à l’éthanol

  1. Prélever des œufs à partir de croisements hétérozygotes et stader les embryons morphologiquement commedécrit 23.
  2. Trier les embryons en groupes d’échantillons de 100 et les élever à 28,5 °C selon les points de développement souhaités. Incuber tous les groupes dans des milieux embryonnaires (EM)10,18.
  3. 6 heures après la fécondation (hpf), changez la EM pour une EM fraîche ou contenant 1 % d’éthanol (v/v). À 24 hpf, laver l’EM contenant de l’éthanol avec trois changements fraisd’EM 10,18.

2. Taches faciales et imagerie

  1. Fixez les larves de poisson-zèbre à 5 dpf et colorez avec du bleu d’Alcian, en marquant le cartilage (Figure 1) comme décritprécédemment 26.
  2. Prenez des images de montage complet, vue ventrale, champ clair du viscérocranium, montage des larves comme décritprécédemment 27.
  3. En résumé, montez les poissons, surface ventrale vers le haut, dans la solution à 50 % de glycérol à la fin de la coloration Alcian Blue.
    REMARQUE : Les réglages des microscopes à base composée peuvent varier ; Utilisez des réglages adaptés aux structures d’image souhaitées. Un microscope composé Olympus BX53 a été utilisé dans cette étude pour générer toutes les images analysées. Les images ont été prises à un grossissement de 10x.

3. Génotypage

  1. Retirer les queues de 5 larves de dpf après la coloration du cartilage Alcian Blue comme décritprécédemment 18.
  2. Séparez les têtes et les queues des larves. Gardez les têtes en stockage à 50 % de glycérol pour une imagerie ultérieure.
  3. Lyse les queues avec 5 μL de protéinase K (10 mg/mL) pour extraire l’ADNg.
  4. Effectuer la PCR sur l’ADNg de chaque échantillon à l’aide d’amorces ciblant le gène d’intérêt pour amplifier les régions contenant le SNP.
  5. Digérez le produit PCR en utilisant une digestion de l’ADN basée sur des endonucléases de restriction pour différencier les allèles mutants des de type sauvage à partir du SNP afin d’identifier le SNP. Divisez les échantillons par génotype en groupes regroupés et imagez pour analyse.
    REMARQUE : Pour ce travail, le SNP a été amplifié en bmp7a et génotypé à l’aide de BslI (NEB).

4. Logiciels utilisés pour l’analyse de formes

  1. Utilisez tpsUtil et tpsDig221, et MorphoJ20 (https://sbmorphometrics.org) pour l’analyse morphométrique des larves colorées à l’alcien, ainsi que le logiciel MorphoJ et Paleontological Statistics Software Package for Education and Data Analysis (PAST)22 (https://www.nhm.uio.no/english/research/resources/past/) pour toutes les analyses statistiques.
    REMARQUE : Le logiciel tpsUtil se trouve sous le lien « Programmes utilitaires », le logiciel tpsDig2 sous le lien « acquisition de données », et MorphoJ sous le lien « Programmes complets » sur https://sbmorphometrics.org. Le dépannage de chaque logiciel est facilement disponible aussi bien en ligne, sur plusieurs plateformes que dans le logiciel. L’analyse des composantes principales (PCA), l’analyse des variables canoniques (CVA), l’ANOVA de Procrustes et les graphiques filaires de la variation faciale ont été générés à l’aide de MorphoJ, et un test multivarié de normalité ainsi qu’une analyse multivariée de la variance (MANOVA) ont été réalisés à l’aide de PAST.

5. Imager de manière cohérente le squelette facial pour tous les échantillons à analyser

  1. Assurez-vous que les images du squelette facial sont prises avec des réglages de microscope identiques et enregistrées sous forme de fichiers .tif.
    REMARQUE : Les réglages du microscope varient selon la configuration et la fonctionnalité du microscope ainsi que des échantillons/tissus à imager. L’essentiel est un installation cohérente du microscope et une préparation de l’échantillon.
  2. Sauvegarder les fichiers dans un seul dossier intitulé pour identifier complètement l’expérience.

6. Préparation des images avec le logiciel tps

  1. Ouvre le Bloc-notes et sélectionne Enregistrer sous . À partir d’ici, cliquez sur tous les fichiers en bas. Enregistrez le fichier sous le nom de l’expérience.tps et enregistrez-le dans le dossier contenant toutes les images à analyser.

7. Saisie d’images dans le logiciel tps

  1. Ouvre le logiciel tpsUtil. Ensuite, faites basculer Opération et sélectionnez le fichier Build tps dans l’onglet images .
  2. Depuis cet onglet, cliquez sur input et ouvrez le fichier contenant les images. Cliquez sur la première image du fichier et sélectionnez Ouvrir.
  3. Sélectionnez l’onglet de sortie , suivi du fichier tps Notepad, et enregistrez. Lorsque vous êtes invité à remplacer le fichier, sélectionnez oui.
  4. Ensuite, cliquez sur l’onglet « configurer » et créez. Allez dans le fichier pour voir si les images ont été ajoutées.

8. Ajout de points de repère aux images

  1. Ouvrez tpsDigs2 et ouvrez les onglets suivants dans l’ordre : Source d’entrée, fichier, puis le fichier sauvegarde tps Notepad.
  2. Ensuite, cliquez sur les options pour visualiser l’option Outils d’image . Ici, assurez-vous de régler la longueur de référence à 100 μm. Appuyez sur définir l’échelle.
    REMARQUE : Ne pas mettre à l’échelle par rapport à l’échelle sur l’image.
  3. Lorsque vous réglez l’échelle, appuyez sur ok pour définir les paramètres, puis quittez les outils d’image.
  4. À ce stade, ajoutez des repères à chaque image à analyser pour une analyse morphologique appropriée en cliquant sur le symbole de visée.
  5. Assurez-vous que les points de repère sont placés dans le même ordre pour chaque image. Des repères ont été placés sur les articulations suivantes entre les éléments cartilagineux (voir Figure 1E, E') :
    1. Articulation médiane entre les cartilages de Meckel (Landmark #1, Figure 1E, E').
    2. Les articulations bilatérales entre les cartilages de Meckel et les cartilages palatoquadratiques (Landmarks #2, Figure 1E, E').
    3. Articulation médiane entre les cartilages cératohyyaux (Landmark #3, Figure 1E, E').
    4. Les articulations bilatérales entre les cartilages palatoquadrate et cératohyyaux (Points de repère #4, Figure 1E, E').
    5. L’extrémité distale des cartilages hyomandibulaires (Monuments #5, Figure 1E, E').
  6. Après avoir placé des points de repère sur une image, cliquez sur les fichiers pour accéder au menu déroulant. Suivez ce chemin pour sauvegarder les données puis écraser.
  7. Quittez tpsDigs2.

9. Utilisation de MorphoJ pour analyser la forme par l’ANOVA de Procrustes

  1. Ouvre le logiciel MorphoJ.
  2. Dans la section préliminaires, créez et nommez le jeu de données. Sélectionnez créer un nouveau jeu de données et nommez le jeu de données. Ensuite, cliquez sur tps et sélectionnez le bloc-notes avec les nouveaux points de données ajoutés à l’étape 8.4. Créez le jeu de données.
  3. Les images sont prêtes à être consultées statistiquement en utilisant l’ajustement de Procruste. Sélectionnez l’onglet qui lit l’arbre du projet et cliquez sur le jeu de données. Sélectionnez les boutons suivants dans cette voie : préliminaires, nouvel ajustement de Procrustes, Aligner par axes principaux, et Effectuer l’ajustement de Procrustes.
  4. Select génère une matrice de covariance sous préliminaires ; le logiciel indiquera les coordonnées de Procruste. Exécutez la fonction quand on vous le demande.
  5. Sélectionnez créer ou modifier un fil de fil sous préliminaires et relier les points sur les images. Ensuite, sélectionnez les points de liaison et acceptez ou créez l’image. Éditer les classificateurs.
  6. Ouvrez un tableau Excel tout en gardant MorphoJ ouvert. Ajoutez toutes les informations nécessaires, par exemple : Génotype, Traitement, Génotype et Traitement, Expérience, etc. Enregistrez le tableau Excel en fichier CSV.
  7. Dans MorphoJ, cliquez sur fichier et importez les variables du classificateur pour sélectionner le fichier CSV. Après avoir ouvert le fichier, retournez dans l’arbre de projet et cliquez sur le jeu de données.
  8. Une fois le jeu de données ouvert, cliquez sur les préliminaires et modifiez les classificateurs. Cela garantira que toutes les images soient ajoutées.
  9. Ensuite, cliquez sur arbre de projet, Covmatrix, puis sur Variation en haut.
  10. Sélectionnez Analyse des composantes principales pour voir les scores PC. Cliquez sur les scores PC pour voir le graphique généré.
  11. Pour ajouter des couleurs au graphique, faites un clic droit et appuyez sur l’ellipse de confiance pour ajouter le classificateur désiré. Appuyez sur les points de données de couleur pour ajouter les couleurs, et d’accord pour accepter ces changements.
    REMARQUE : Une fois l’onglet de score PC fermé et rouvert en suivant les instructions de l’étape 9.10, les couleurs doivent être mises à jour.
  12. Pour changer les couleurs du fil, allez dans Préliminaires. Cliquez sur définir les options pour le graphique de formes, situé en bas de l’écran. Sélectionnez des graphiques filaires pour changer les couleurs de la forme cible, de la forme de départ et des chiffres.
  13. Sélectionnez Variante, puis Procrustes ANOVA.
  14. Exportez les résultats de l’ANOVA de Procrustes vers le fichier tableur à partir de l’étape 9.7.

10. Analyse des variables canoniques de l’ensemble de données

  1. Dans MorphoJ, sélectionnez le jeu de données ou projet original. Pour commencer l’analyse des variations canoniques (ACV), sélectionnez Comparaison suivie d’Analyse des variations canoniques. Sélectionnez la ou les variables du classificateur - sélectionnez Génotype & Traitement et exécutez la fonction.
  2. Pour exporter le CVA, cliquez sur l’onglet résultats et faites un clic droit sur la page des résultats désormais ouverte. Sélectionnez Exporter dans le fichier et enregistrez les informations.
  3. Cliquez sur Arbre de projets et sélectionnez CVA, puis Scores. En haut à gauche de la page, sélectionnez Fichier. Une fois l’onglet Fichier ouvert, choisissez Exporter un ensemble de données et sélectionnez le type de données ainsi que Génotype & Traitement. Enregistrez les scores CVA sous forme de fichier .txt.
  4. Pour préparer le fichier pour le logiciel PAST, ouvrez les scores CVA enregistrés dans Notepad ou un logiciel équivalent. Changez l’ID en haut à gauche pour Étiquette afin de ne pas confondre les logiciels PASSÉS. Enregistrez les scores CVA modifiés ou équivalents.

11. MANOVA dans le logiciel PAST

  1. Pour importer les scores CVA dans PAST, sélectionnez Fichier, puis Ouvrir pour accéder aux scores CVA enregistrés depuis Notepad ou équivalent. Lorsque la fenêtre Importer un fichier texte s’ouvre, sélectionnez Noms, Données pour ligne et colonne, et tab pour un séparateur. Sélectionnez Importer.
  2. Dans l’onglet Afficher , sélectionnez Attributs de colonne. À côté du bouton Type , ouvrez le menu déroulant et sélectionnez Groupe pour la première colonne qui devrait contenir la ou les variables du classificateur.
  3. Mettez en surbrillance les données du PC ou du CV. Sélectionnez Multivarié, Tests et Normalité Multivariée pour effectuer le test de normalité. Faites ce test séparément sur PC et CV.
  4. Cliquez sur la cellule grise vide en haut à gauche, au-dessus de taper, pour sélectionner l’ensemble du jeu de données. Sélectionnez Multivarié, Tests et MANOVA pour traiter le MANOVA. Exportez les résultats MANOVA vers le fichier de tableau Excel à partir de l’étape 9.7.
    REMARQUE : Les résultats résumés et pair-à-pair seront tous deux fournis par le logiciel. Exportez ou enregistrez les deux.

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Résultats

Pour identifier les changements de forme faciale induits par l’éthanol chez le poisson-zèbre, nous avons combiné des logiciels librement disponibles pour générer et quantifier les données morphologiques du squelette facial. Des embryons de poissons porteurs adultes hétérozygotes de bmp7a ont été générés et traités avec de l’éthanol de 6 à 24 hpf. Les larves de ces croisements étaient fixées à 5 dpf, et les cartilages faciaux étaient colorés d’Alcian Blue. Des images du viscérocr...

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Discussion

Le FASD se caractérise par un large éventail de défauts du développement, y compris des défauts craniofaciaux tels que l’hypoplasie de la mâchoire. Le poisson-zèbre est un modèle solide pour le TSAF en raison de leur conservation génétique chez l’humain, de leur forte fécondité, de larves translucides et de la fécondation externe. Les poissons-zèbres sont utilisés depuis des décennies pour étudier à la fois la formation du squelette craniofacial et l’impact de l’éthanol sur le développem...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

La recherche présentée dans cet article a été soutenue par une subvention des National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse (NIH/NIAAA) R01AA031043 à C.B.L.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
tpsUtil, tpsDig2, MorphoJhttps://sbmorphometrics.orgLogiciel gratuit - peut nécessiter des autorisations administratives pour le téléchargement
PASSÉhttps://www.nhm.uio.no/english/research/resources/past/Logiciel gratuit - peut nécessiter des autorisations administratives pour le téléchargement
Microscope à champ clair composéOlympeBX53

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