Le mécanisme de la poudre d’ermiao dans le traitement de la prostatite : une étude basée sur la pharmacologie en réseau et la vérification expérimentale

Résumé

En utilisant une approche de pharmacologie en réseau, cette étude a révélé que la poudre d’Ermiao exerce ses effets thérapeutiques contre la prostatite en inhibant les facteurs inflammatoires et les voies de signalisation associées. Des expériences in vitro ultérieures ont également démontré que son extrait aqueux a significativement supprimé l’expression de cytokines inflammatoires clés dans un modèle induit par le LPS de cellules épithéliales prostatales.

Résumé

Ce protocole propose une approche combinée de pharmacologie en réseau et de validation expérimentale pour étudier le mécanisme d’action de la poudre d’Ermiao (EMP) dans le traitement de la prostatite. Le flux de travail suit une conception par étapes : (i) criblage piloté par une base de données des composés actifs et cibles, (ii) construction et analyse de réseaux d’interaction, et (iii) validation expérimentale in vitro . Premièrement, les principes actifs de l’EMP et leurs cibles correspondantes ont été extraits de la base de données TCMSP, tandis que les cibles liées à la prostatite ont été obtenues à partir de la base de données GeneCards. L’intersection des cibles EMP et des cibles de maladies a été utilisée pour identifier les cibles thérapeutiques clés. Deuxièmement, un réseau « Médicament–Ingrédient actif–Cible–Maladie » a été construit à l’aide de Cytoscape. Une analyse d’interaction protéine-protéine (IPP) et l’enrichissement des voies de l’encyclopédie Kyoto encyclopédie des gènes et génomes (KEGG) ont été réalisés sur les cibles clés, révélant que des facteurs inflammatoires tels que IL6 et TNF servaient de cibles centrales, et que des voies telles que PI3K/AKT et MAPK étaient significativement enrichies. Enfin, la validation in vitro a été réalisée à l’aide d’un modèle inflammatoire induit par le LPS des cellules épithéliales de la prostate. Le traitement par EMP a significativement réduit la libération des facteurs pro-inflammatoires IL-6 et TNF-α par rapport au groupe traité par LPS (p < 0,05), confirmant l’efficacité anti-inflammatoire de l’EMP. Cette approche intégrative fournit un cadre reproductible pouvant être adapté pour étudier d’autres systèmes thérapeutiques multicomposants. En conclusion, cette étude éclaire de manière préliminaire que la EMP exerce ses effets anti-prostatite via un mécanisme multi-composants, multi-cibles et multi-voies, étroitement associé à la suppression des réponses inflammatoires, offrant ainsi une base scientifique à son application clinique.

Introduction

La prostatite, en particulier la prostatite chronique non bactérienne, représente un trouble urologique répandu caractérisé par une étiologie complexe et un manque de thérapies très efficaces, imposant un fardeau important à la qualité de vie des^{patients 1,2,3}. La prise en charge clinique actuelle de la prostatite utilise une approche intégrée incluant antibiotiques, bloqueurs de récepteurs α et anti-inflammatoires non stéroïdiens ^4,5,6. Les principaux défis incluent l’absence de thérapies spécifiques à chaque étiologie et l’interaction complexe entre facteurs psychologiques et symptômes physiques, qui contribuent collectivement à des résultats de traitement insatisfaisants et à une récidive^{fréquente 7}. Ces dernières années, les approches de la médecine intégrative, telles que l’acupuncture et la phytothérapie, ont été largement appliquées dans la prise en charge de la prostatite et ont montré une efficacité prometteuse. La sécurité et l’efficacité de ces approches thérapeutiques ont été confirmées par une série de preuves de recherche de haute qualité 8,9,10,11,12.

Dans ce contexte, les formulations de la médecine traditionnelle chinoise (MTC) comme la poudre d’ermiao (EMP), reconnues pour leurs propriétés anti-inflammatoires et détoxifiantes, offrent une approche thérapeutique alternative^prometteuse 13,14,15. Cependant, les mécanismes pharmacologiques précis sous-jacents à l’efficacité de la EMP contre la prostatite restent incomplètement élucidés, principalement en raison de sa nature multicomposante. L’avènement de la pharmacologie des réseaux offre un outil puissant pour déchiffrer le mode d’action complexe « multi-composants, multi-cibles, multi-voies » caractéristique des formules^{MTC 16,17}. Notre stratégie consistait à identifier les composantes actives de l’EMP et ses cibles potentielles, suivie d’une analyse de réseau pour identifier les cibles et voies clés. Des expériences ultérieures ont été menées pour valider biologiquement les effets anti-inflammatoires et les mécanismes fondamentaux, visant à établir une base scientifique pour l’application de la EMP. Cette étude introduit un cadre combiné de validation en réseau pharmacologique-expérimental qui enrichit l’interprétation mécaniste des thérapies multi-composants

Protocole

Aucune approbation éthique n’était requise pour cette étude, car elle n’impliquait ni participants humains ni échantillons cliniques. Toutes les procédures impliquant des lignées cellulaires ont été menées conformément aux directives et réglementations institutionnelles en matière de biosécurité. La lignée cellulaire épithéliale de la prostate utilisée dans cette étude a été obtenue auprès d’un fournisseur commercial certifié.

REMARQUE : Tous les réactifs, instruments et logiciels utilisés dans cette étude sont listés dans le tableau des matériaux. Le diagramme de cette étude est présenté à la Figure 1.

1. Criblage des ingrédients actifs

1. Accédez à la base de données TCMSP.
2. Sélectionnez « Nom d’herbe » dans la barre de recherche, tapez « Huangbo », puis cliquez sur « Rechercher ».
3. Cliquez sur le filtre « OB », réglez « ≥30 », et appliquez.
4. Cliquez sur le filtre « DL », définissez « ≥0.18 », et appliquez.
5. Copiez les résultats filtrés dans un tableau Excel.
6. Appliquer la même méthode de dépistage pour obtenir les ingrédients actifs de « Cangzhu ».
7. Retirez les principes actifs en double en important tous les jeux de données dans Microsoft Excel (version 2019) et en fusionnant les listes composées au format Excel.
8. Éliminez les principes actifs en double en standardisant les noms de composés et en identifiant des entrées identiques. Lorsque plusieurs enregistrements correspondaient au même composé, une seule entrée représentative était conservée.
9. Établir des associations entre « Huangbo », « Cangzhu » et les ingrédients actifs.

2. Obtenir les cibles correspondant aux ingrédients actifs

1. Accédez à la base de données TCMSP.
2. Sélectionnez « Nom du produit chimique » dans la barre de recherche, entrez les ingrédients actifs, puis cliquez sur « Rechercher ».
3. Copiez le nom cible correspondant à chaque ingrédient actif.
4. Supprimez les noms de cibles en double et établissez des associations entre les ingrédients actifs et les noms de cibles.
5. Accédez à la base de données UniProt (https://www.uniprot.org/)¹⁸, récupérez les symboles officiels de gènes pour chaque nom de cible, et remplacez-les systématiquement.

3. Acquisition de cibles de maladies

1. Accédez à la base de données GeneCards (https://www.genecards.org)¹⁹.
2. Saisissez « Prostatite » dans le champ de recherche et appuyez sur l’icône de recherche pour obtenir la liste de gènes correspondante.
3. Triez les gènes par ordre décroissant selon le score de pertinence.
4. Exportez les gènes pertinents au format Excel.
5. Les cibles avec un score ≥1 ont été sélectionnées comme cibles liées à la prostatite.

4. Préparation à la construction d’un réseau de régulation des principes actifs, des maladies cibles et des médicaments

1. Obtenir l’intersection entre les cibles liées aux principes actifs et celles liées à la prostatite, et définissez-les comme les cibles de la EMP pour traiter la prostatite.
2. Établir l’association entre les principes actifs et les cibles thérapeutiques de l’EMP pour la prostatite.
3. Créez un fichier Excel nommé « Network » avec les trois premières colonnes nommées « Node1 », « Node2 » et « Net ».
4. Collez les associations entre l’EMP et le médicament dans les colonnes « Node1 » et « Node2 », tout en entrant « drug » dans la colonne « Net » pour toutes les lignes.
5. Collez les associations d’ingrédients actifs médicamenteux dans les colonnes « Node1 » et « Node2 », tout en entrant « ingrédient » dans la colonne « Net » pour toutes les lignes.
6. Remplissez les colonnes « Node1 » et « Node2 » avec les associations d’ingrédient actif-cible pour cibles d’EMP pour traiter la prostatite, en indiquant « cible » dans la colonne « Net ».
7. Collez les cibles thérapeutiques de l’EMP pour la prostatite dans la colonne « Node1 », tout en inscrivant « prostatite » dans la colonne « Node2 » et « disease » dans la colonne « Net » pour toutes les lignes.
8. Enregistrez le fichier Excel « Network » au format txt.
9. Créez un fichier Excel nommé « Type » avec les deux premières colonnes nommées « Node » et « Type ».
10. Remplissez la colonne « Nœud » avec « EMP », avec « formule » saisie dans la colonne « Type ».
11. Entrez « Huangbo » et « Cangzhu » dans la colonne « Node » ; entrez « drug » dans la colonne « Type » pour toutes les lignes.
12. Entrez les ingrédients actifs dans la colonne « Nœud », tout en entrant « ingrédient » dans la colonne « Type » pour toutes les lignes correspondantes.
13. Remplissez la colonne « Nœud » avec les cibles thérapeutiques de l’EMP pour la prostatite, en indiquant « cible » dans la colonne « Type ».
14. Entrez les cibles liées à la prostatite dans la colonne « Nœud », tandis que « maladie » dans la colonne « Type » pour toutes les lignes correspondantes.
15. Enregistrez le fichier Excel « Type » en format .txt.

5. Visualisation du réseau régulateur « Ingrédient actif médicament-cible-maladie » par Cytoscape

1. Lancez Cytoscape.
2. Allez dans « File > Import > Network from File System » et ouvrez le fichier « network.txt ».
3. Ouvre le panneau « Style ». Sélectionnez « Forme », choisissez « Type » dans le menu déroulant « Colonne », puis définissez « Mapping Type » sur « Cartographie discrète ».
4. Attribuez des formes distinctes de nœuds aux catégories suivantes : formule, médicament, ingrédient, cible, maladie.
5. Sélectionnez « Couleur de remplissage », choisissez « Type » dans le menu déroulant « Colonne », et définissez « Mapping Type » sur « Cartographie discrète ».
6. Attribuez des couleurs de nœuds distinctes aux catégories suivantes : formule, médicament, ingrédient, cible, maladie.
7. Sélectionnez « Hauteur » et « Largeur », choisissez « Type » dans le menu déroulant « Colonne », et définissez « Mapping Type » sur « Cartographie discrète ».
8. Attribuez des tailles de ganglions distinctes aux catégories suivantes : formule, médicament, ingrédient, cible, maladie.
9. Sélectionnez « Étiquette taille de la police », choisissez « Type » dans le menu déroulant « Colonne », et définissez « Mapping Type » sur « Mappage discret ».
10. Attribuez des tailles de police d’étiquette distinctes aux catégories suivantes : formule, médicament, ingrédient, cible, maladie.
11. Repositionnez manuellement les nœuds pour optimiser la disposition du réseau.
12. Allez dans « File > Export > Network Image to File » et enregistrez le réseau comme image.

6. Analyse et visualisation de réseaux PPI

1. Accède https://cn.string-db.org/ et va dans le module « Protéines multiples ».
2. Saisissez la liste des gènes cibles dans la barre de recherche, sélectionnez « Homo sapiens » comme organisme, puis cliquez sur « Rechercher ».
3. Après le chargement des résultats, cliquez sur « Continuer ».
4. Ouvrez le panneau « Paramètres », définissez « score d’interaction minimum requis » sur « haute confiance (0,700) », et cochez « masquer les nœuds déconnectés dans le réseau ».
5. Cliquez sur « Mettre àjour e », puis exportez les données d’association PPI au format TSV via le menu « Export ».
6. Lance Cytoscape, va dans le menu Fichiers, et sélectionne « Importer le réseau depuis le système de fichiers » pour ouvrir ton fichier TSV.
7. Naviguez dans le menu « Outils », puis sélectionnez « NetworkAnalyzer > Network Analysis > Network Interpretation > Traiter le réseau comme non dirigé ».
8. Naviguez dans le menu « Fichier », sélectionnez « Exporter la table vers le système de fichiers », et exportez les données réseau.
9. Naviguez dans le panneau « Style » et configurez les attributs « Forme », « Couleur de remplissage », « Hauteur » et « Largeur ».
10. Ajustez la disposition du réseau PPI en repositionnant les nœuds.
11. Naviguez dans le menu « Fichier », sélectionnez « Exporter image réseau en fichier », et exportez le réseau visualisé sous forme d’image.
12. Ouvrez les données réseau PPI exportées avec WPS et triez-les par ordre décroissant par colonne « Degré ».
13. Sélectionnez les 20 cibles les plus triées, générez un graphique à barres, puis enregistrez le graphique en image.

7. Analyse de l’enrichissement des voies KEGG

1. Ouvrez un terminal ou une invite de commande, tapez R, et appuyez sur Entrée.
2. Dans la console R, exécutez les commandes suivantes une par une :
   install.packages(c(« RSQLite », « colorspace », « stringi », « BiocManager »))
   BiocManager ::install(c("org. Hs.eg.db », « DOSE », « clusterProfiler », « pathview »))
3. Convertir les symboles génétiques des cibles de l’EMP pour traiter la prostatite en identifiants Entrez en utilisant org. Hs.eg.db.
4. Lisez les identifiants Entrez et effectuez une analyse d’enrichissement KEGG à l’aide du package clusterProfiler avec les paramètres : organisme = « a », pvalueCutoff = 0,05, qvalueCutoff = 0,05.
5. Après avoir retiré les voies humaines liées aux maladies et au métabolisme des résultats obtenus de l’analyse d’enrichissement KEGG, triez les voies restantes selon le nombre de gènes enrichis.
6. Établir l’association entre les 15 voies de signalisation les mieux classées et les cibles.
7. Préparez un fichier à deux colonnes avec les associations « pathway » et « target », puis importez-le dans Cytoscape via « File > Import > Network from File ».
8. Définissez les formes et couleurs des nœuds pour distinguer les chemins des cibles en utilisant le panneau « Style ».
9. Ajustez la disposition manuellement et exportez le réseau en image.

8. Préparation pharmaceutique

REMARQUE : La formulation EMP est composée de 15 g de cortex de Phellodendri Chinensis (Huangbo) et 15 g de Rhizome Atractylodis (Cangzhu). La méthode d’extraction par eau et de précipitation alcoolique a été utilisée pour obtenir l’extrait lors des expériences ultérieures à base cellulaire²⁰.

1. Immergez le médicament dans une masse d’eau multipliée par 10 pendant 1 heure.
2. Décocquez pendant 1 heure, puis filtrez à travers de la gaze pour obtenir la décoction.
3. Ajoutez à nouveau une masse d’eau multipliée par 10 au médicament, découssez pendant 30 minutes, puis filtrez à travers de la gaze pour obtenir la décoction.
4. Ajoutez à nouveau une masse d’eau multipliée par 10 au médicament, décoccez pendant 30 minutes, puis filtrez à travers de la gaze pour obtenir la décoction.
5. Combinez les trois décoctions filtrées, puis filtrez le mélange à travers du papier filtrant.
6. Concentrez la décoction à pression réduite à 10 % de son volume initial.
7. Refroidissez le concentré, ajoutez lentement l’éthanol à 75 % en remuant, puis scellez et conservez à 4 °C pendant 12 heures.
8. Centrifugez le mélange et collectez le surnageant.
9. Continuez la distillation sous pression réduite.
10. Enfin, lyophiliser le produit à l’aide d’un lyophiliseur sous vide.
    REMARQUE : La poudre lyophilisée peut être stockée à –20ºC pendant jusqu’à 3 mois, ce qui constitue un point de pause sûr. Pour reprendre, reconstituez la poudre dans un solvant approprié si nécessaire.

9. Dégel cellulaire et culture

REMARQUE : Les cellules achetées ont été livrées au laboratoire sur de la glace sèche. Avant le début de l’expérience, le milieu sans sérum de kératinocytes (K-SFM) a été préparé à l’avance en le complétant avec un facteur de croissance épidermique recombinant humain (rEGF) jusqu’à une concentration finale de 5 ng/mL, un extrait hypophysaire bovin à une concentration finale de 50 μg/mL, et 1 % de pénicilline-streptomycine.

1. Activez le bain-marie et ajustez la température à 37 °C.
2. Retirez les cellules de la glace sèche et agitez-les immédiatement dans le bain-marie jusqu’à ce qu’elles soient complètement décongelées.
3. Ajoutez 5 mL de K-SFM aux cellules. Mélangez doucement, puis centrifugez le mélange (4 °C, 500 × g, 5 min).
4. Retirez le surnageant et resuspendez la pastille en K-SFM complet.
5. Transférez les cellules dans une fiole T-25 et placez-les dans un incubateur de culture cellulaire.
   REMARQUE : Les paramètres environnementaux de l’incubateur de culture cellulaire ont été maintenus à 37 °C, 5 % de CO₂ et ≥ 95 % d’humidité relative.

10. Subculture cellulaire

REMARQUE : La subculture a été réalisée lorsque les cellules atteignaient une confluence de 80 à 90 %, avec un ratio de sous-culture de 1:2 à 1:3.

1. Aspirez le surnageant du milieu de culture, suivi de deux lavages de cellules avec du PBS sans calcium ni magnésium.
2. Introduisez 2 mL de trypsine-EDTA et laissez les cellules reposer 3 minutes pour la dissociation enzymatique.
   ATTENTION : Ce protocole implique l’utilisation de réactifs dangereux, notamment le lipopolysaccharide (LPS), le chloroforme, l’éthanol et le réactif TRIzol. Toutes les procédures impliquant des produits chimiques dangereux doivent être effectuées dans une hotte chimique certifiée tout en portant un équipement de protection individuelle approprié (blouse de laboratoire, gants et protection oculaire). Les matériaux biologiques doivent être manipulés conformément aux directives institutionnelles de biosécurité.
3. Ajouter un milieu K-SFM complété avec un sérum bovin fœtal à 10 % pour arrêter la digestion.
4. Transférez le mélange de cellules dans un tube centrifugeuse de 15 mL, centrifugeuse (4 °C, 500 × g, 5 min), puis retirez le surnageant.
5. La pastille cellulaire a été resuspendue dans un K-SFM complet puis transférée dans de nouvelles fioles de culture.

11. Détermination de la concentration maximale de traitement médicamenteux via un test MTS

REMARQUE : Chaque concentration de médicament a été testée avec 5 réplicés techniques.

1. Digérez les cellules RWPE-1 en phase de croissance logarithmique.
2. Resuspendez les cellules dans un milieu complet K-SFM, puis déterminez la concentration cellulaire en comptant.
3. Ajustez la suspension des cellules à une densité de 1 × 10⁵ cellules/mL avec un milieu complet K-SFM.
4. Distribuez la suspension de la cellule dans une plaque de 96 puits de 100 μL par puits.
5. La plaque de 96 puits a été placée dans un incubateur de culture cellulaire pour la culture.
6. Après 24 heures, une fois que les cellules avaient complètement adhéré, le milieu de culture était aspiré puis jeté.
7. Remplacer le milieu par un milieu complet K-SFM contenant différentes concentrations de solution EMP.
8. Remettez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pour encore 24 heures d’incubation.
9. Aspirez le milieu, puis rincez les cellules deux fois avec du PBS.
10. Ajouter 100 μL de milieu complet K-SFM à chaque puits, puis incuber la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant encore 4 heures.
11. Distribuez 10 μL de solution MTS dans chaque puits, et déterminez la OD à 490 nm après une incubation d’une heure.
12. En utilisant le groupe témoin blanc (cellules cultivées dans un milieu complet sans stimulation LPS ni traitement médicamenteux) comme référence, la prolifération cellulaire sous chaque concentration de traitement a été calculée.
    REMARQUE : La concentration la plus élevée sans effet significatif sur la prolifération cellulaire a été définie comme le traitement à haute dose, suivi de sa demi-concentration comme traitement à dose moyenne, et d’un quart de concentration comme traitement à faible dose.

12. Intervention cellulaire

1. Digérez les cellules RWPE-1 en phase de croissance logarithmique.
2. Les cellules ont été resuspendues dans un milieu complet K-SFM, et la concentration cellulaire a été déterminée par décompte cellulaire.
3. La suspension des cellules a été ajustée à une densité de 5 × 10⁵ cellules/mL en utilisant un milieu complet K-SFM.
4. La suspension de cellules a été ensemencée dans une plaque à 6 puits à 2 mL par puits.
5. La plaque a été placée dans un incubateur de culture et incubée pendant 12 heures afin de permettre l’adhésion cellulaire.
6. Les cellules ont été traitées avec des concentrations EMP faibles (150 μg/mL), moyennes (300 μg/mL) et à haute dose (600 μg/mL) respectivement.
7. Après 1 heure, une solution de 10 μg/mL de LPS a été ajoutée au milieu de culture.
8. Après 24 heures de traitement, le surnageant a été prélevé pour ELISA, et les cellules ont été prélevées pour une analyse RT-PCR.
   REMARQUE : Le LPS a été sélectionné pour induire une réponse inflammatoire grâce à sa capacité bien établie à activer les voies de signalisation pro-inflammatoires dans les cellules épithéliales prostatales ; la concentration (10 μg/mL) a été choisie sur la base d’études antérieures démontrant une induction robuste des cytokines.

13. Isolement de l’ARN total

REMARQUE : Pour prévenir la dégradation de l’ARN, des gants et des masques ont été portés tout au long de la procédure expérimentale, et des embouts de pipette sans RNase ainsi que des tubes centrifugeuses ont été utilisés.

1. Après l’intervention, rincez les cellules deux fois avec du PBS.
2. Ajoutez 1 mL de réactif Trizol aux cellules et mélangez-le à plusieurs reprises avec une pipette pour assurer l’homogénéisation.
   ATTENTION : Effectuer toutes les procédures dans une hotte chimique tout en portant un équipement de protection individuelle approprié.
3. Transférez le lysat dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL et laissez-le incuber à température ambiante pendant 15 minutes.
4. Ensuite, ajoutez 0,2 mL de chloroforme et agitez vigoureusement l’échantillon.
5. Après l’avoir laissé reposer à température ambiante pendant 5 minutes, centrifugez l’échantillon à 10 000 × g pendant 15 minutes à 4 °C.
6. Après centrifugation, transférez soigneusement la phase aqueuse supérieure incolore dans un tube de microcentrifugation frais.
7. Introduisez un volume égal d’isopropanol pré-refroidi, mélangez soigneusement, puis incubez à température ambiante pendant 10 minutes.
8. Centrifugez l’échantillon à nouveau (4 °C, 10 000 × g, 10 min), puis jetez la phase liquide et conservez le précipité.
9. Rincez le pellet avec 1 mL d’éthanol pré-refroidi à 75 % et resuspendez-le doucement en pipettant.
10. Effectuer une centrifugation finale à 4 °C et 7 500 × g pendant 10 minutes, puis retirer le surnageant et laisser le granule d’ARN sécher à l’air dans un cabinet de biosécurité.
11. Dissoudre l’ARN purifié dans 50 μL d’eau traitée au DEPC.
12. Déterminez la concentration d’ARN, le rapport A260/A280 et le rapport A260/A230 à l’aide d’un spectrophotomètre NanoDrop afin d’évaluer la pureté de l’ARN et d’assurer une contamination minimale par les protéines et les solvants avant les analyses en aval.

14. RT-PCR

1. Utilisez 1 μg d’ARN total pour préparer un système de réaction de transcription inverse de 20 μL.
2. Incubez le système de réaction à 42 °C pendant 15 minutes, puis à 95 °C pendant 5 minutes, puis refroidissez à 4 °C.
3. Diluez l’ADN C obtenu de 10 fois à l’aide d’eau distillée.
4. Préparez un système de réaction PCR de 20 μL en utilisant l’ADNc dilué.
5. Programmez le thermocycleur et fixez une première retenue à 95 °C pendant 60 s, suivie de 40 cycles à 95 °C pendant 15 s et 60 °C pendant 60 s.
6. Effectuer une analyse de la courbe de fusion et enregistrer les valeurs de CT pour tous les gènes cibles et les gènes de référence après l’achèvement.
7. Utilisez la méthode 2^(-ΔΔCT) pour déterminer les niveaux d’expression normalisés des gènes cibles.

15. Essai ELISA

REMARQUE : Récupérez le kit ELISA du stockage et laissez-le s’équilibrer à température ambiante pendant 30 minutes avant utilisation.

1. Préparez la solution standard selon les instructions du fabricant, et effectuez les dilutions appropriées pour les étalons, les anticorps biotinylés, les conjugués enzymatiques et le tampon de lavage.
2. Centrifugez le surnageant de culture cellulaire collecté (4 °C, 10 000 × g, 10 min) et collectez le surnageant.
3. Transférez 100 μL des dilutions standard et des échantillons d’essai vers les puits pré-revêtus.
4. Scellez les puits avec une bande adhésive et faites couver la plaque à 37 °C pendant 90 minutes.
5. Éliminez le liquide des puits et lavez la plaque à l’aide d’un lave-plaques automatique.
   REMARQUE : Réglez les paramètres du lave-laveur automatisé à : 350 μL de tampon de lavage par puits, temps de trempage de 15 secondes entre la distribution et l’aspiration, 5 cycles complets.
6. Injectez 100 μL de solution active biotinylée par anticorps dans chaque puits. Laissez couver à 37 °C pendant 60 minutes.
7. Jetez la solution et lavez la plaque comme décrit à la 15.5.
8. Pipeter 100 μL de solution de travail conjuguée enzymatique par puits, puis incuber à 37 °C pendant 60 minutes.
9. Jetez la solution et lavez la plaque comme décrit à la 15.5.
10. À chaque puits, ajoutez 100 μL de substrat chromogénique. Maintenez à 37 °C pendant 15 minutes tout en vous protégeant de la lumière.
11. Pipeter 100 μL de solution d’arrêt par puits, puis mélanger doucement.
12. Mesurez immédiatement la densité optique (OD) à 450 nm.
13. Établissez une courbe standard en retraçant les valeurs moyennes de OD par rapport aux concentrations standard à l’aide du logiciel Curve Expert.
14. Déterminez la concentration de chaque échantillon par interpolation à partir de la courbe standard en utilisant sa valeur OD.

16. Analyse statistique

1. Utilisez le logiciel SPSS (Version 20.0).
2. Importez le jeu de données dans SPSS Statistics et définissez les variables de manière appropriée. Utiliser Analyser > Statistiques descriptives> Explorer pour calculer la moyenne et l’écart-type (DE).
3. Utilisez les moyennes d’analyse > de comparaison > ANOVA unidirectionnelle pour les comparaisons de groupes multiples.
4. Obtenez les valeurs p directement à partir des tables de sortie de test et rapportez-les en conséquence.
5. Présenter tous les résultats en moyenne ± DS et considérer les différences statistiquement significatives lorsque p < 0,05.

Résultats

Identification des composés actifs et prédiction des cibles

Ces résultats démontrent l’efficacité de notre approche intégrée de pharmacologie en réseau et de vitro pour identifier et valider les cibles thérapeutiques de l’EMP dans la prostatite. Une recherche dans la base de données TCMSP a permis d’identifier 46 composants bioactifs issus des plantes constitutives de l’EMP, correspondant à 178 cibles potentielles. À partir de la base...

Discussion

Ce protocole intègre la pharmacologie en réseau avec la validation expérimentale afin de fournir un cadre systématique pour étudier les mécanismes thérapeutiques multicomposants. Les étapes critiques incluent un criblage précis des composés actifs à l’aide de seuils définis (OB ≥ 30 %, DL ≥ 0,18), une construction fiable du réseau et la sélection appropriée de modèles expérimentaux de validation. Une sélection minutieuse des paramètres dans les analyses bioinformatiques et un contrôle st...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
KIT D’IL-6 ELISA HUMAIN	4Abio	CHE0009
TNF et alpha humains ; ELISA KIT	4Abio	CHE0019
Suppléments K-SFM	Procell	CM-0200
Lipopolysaccharides	Solarbio	L8880
MTS	Promega	G1111
Système de transcription inverse	Promega	A3500
RWPE-1	Procell	CL-0200	RRID : CVCL_EQ24
Milieu complet de cellules RWPE-1	Procell	CM-0200
SYBR Mix Vert Maître PCR en temps réel	Toyobo	QPK-201
Réactif Trizol	Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)	15596026
Trypsine-EDTA	Gibco (Thermo Fisher)	25200072