Article de méthode

PCR chevauchante en une étape pour la synthèse rapide de gabarits d’ADN d’ARN à guide unique pour le système CRISPR

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DOI :

10.3791/70369

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24 avril 2026

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1Institute of Cytology and Genetics, School of Basic Medical Sciences, Hengyang Medical School, University of South China, 2Translational Medicine Institute, the First People's Hospital of Chenzhou, Hengyang Medical School, University of South China, 3National Health Commission Key Laboratory of Birth Defect Research and Prevention & Ministry of Education Key Lab of Rare Pediatric Diseases, Institute of Cell Biology and Genetics, School of Basic Medical Sciences, Hengyang Medical School, University of South China

Dans cet article

Résumé

Une méthode de PCR chevauchante en une étape, utilisant quatre amorces, permet une génération rapide et à faible coût de gabarits d’ADN pour la transcription in vitro de sgARN. Un ratio optimisé des amorces (50:5:1:50) produit des sgRNA de haute qualité en 5 heures, avec une validation fonctionnelle démontrée par des tests in vitro et des activités d’édition dans HEK293T cellules.

Résumé

Le système CRISPR–Cas a révolutionné l’édition du génome ; cependant, les méthodes conventionnelles de génération d’ARN à guide unique (sgRNA) impliquent souvent des étapes de clonage longues ou des kits de synthèse commerciaux coûteux. Une stratégie PCR superposée optimisée en une étape est présentée pour la synthèse rapide et économique de gabarits d’ADN pour la transcription in vitro de sgRNA. En utilisant quatre amorces partiellement superposées couvrant le promoteur T7, la séquence guide spécifique à la cible et l’échafaudage de sgRNA, des modèles de longueur complète sont assemblés en une seule réaction PCR sans clonage. L’optimisation expérimentale systématique a établi un rapport d’amorce optimal (AF1 :AF2 :AF3 :Tracr-R = 50:5:1:50), minimisant les sous-produits non spécifiques tout en maximisant le rendement complet du produit, comme confirmé par l’électrophorèse en gel d’agarose. Cette approche a été étendue avec succès pour générer des modèles pour le sgRNA Staphylococcus aureus Cas9 (saCas9), démontrant une applicabilité inter-systèmes au-delà de Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9). Bien que la synthèse chimique directe des sgRNA offre des avantages tels que la haute pureté, des modifications chimiques pour améliorer la stabilité et des effets hors cible réduits, elle reste prohibitivement coûteuse pour les applications à haut débit ou les criblages à grande échelle nécessitant de nombreux sgRNA. Les analyses de clivage in vitro ont démontré que les ARN-guides générés par cette méthode atteignent des efficacités d’édition comparables à celles obtenues par le clonage conventionnel à base de plasmides. De plus, les complexes ribonucléoprotéiques assemblés avec ces sgRNA et livrés dans HEK293T cellules par électroporation ont entraîné la formation d’indel détectable au locus cible, confirmant la fonctionnalité in vivo. L’analyse des coûts indique que cette méthode réduit substantiellement les coûts de préparation du gabarit par rapport aux kits de synthèse commerciaux tout en diminuant le temps de traitement de jours à plusieurs heures, offrant ainsi une approche accessible et évolutive pour les laboratoires engagés en recherche génétique.

Introduction

Le système CRISPR–Cas, issu d’un mécanisme immunitaire adaptatif chez les bactéries et les archées, a révolutionné l’ingénierie génétique en permettant une édition génomique précise sur divers organismes 1,2. Un composant clé est l’ARN à guide unique (sgRNA), un ARN chimérique qui dirige les nucléases Cas vers des loci génomiques spécifiques ; sa conception modulaire permet un reciblage par modification d’une séquence proto-espaceuse d’environ 20nucléotides 3. Au-delà de SpCas9, d’autres nucléases Cas aux propriétés distinctes ont été largement adoptées. Staphylococcus aureus Cas9 (saCas9) est plus petit, facilitant la délivrance du virus adéno-associé (AAV) et élargissant ainsi les optionsde délivrance 4. Chaque système nécessite des architectures spécifiques d’ARN-guide, ce qui rend une méthode de synthèse polyvalente très recherchée3.

Les méthodes traditionnelles de génération d’ARN-guides fonctionnels incluent le clonage à base de plasmides, les kits commerciaux de synthèse de sgARN, ou la synthèse commerciale directe dessgRNA 5,6. Le clonage à base de plasmides nécessite plusieurs étapes laborieuses — restriction digestive, ligatura, transformation et criblage des colonies — prenant généralement plus de 48 heures 2,4,6. Les kits commerciaux de sgRNA, bien qu’offrant un flux de travail simplifié (<5 h), restent prohibitifs pour les applications à haut débit, coûtant généralement entre 35 et 45 $ par réaction. La synthèse chimique directe des sgRNA offre des avantages tels que la haute pureté, des modifications chimiques pour améliorer la stabilité et une réduction des effets hors cible7 ; cependant, elle est prohibitivement coûteuse (généralement 200 à 280 $ par sgRNA) pour des applications à haut débit ou des criblages à grande échelle nécessitant des centaines de sgRNA.

En revanche, la méthode PCR superposée en une étape décrite ici complète la synthèse du modèle en moins de 5 heures à l’aide d’amorces standards, pour un coût d’environ 5 à 8 $ par sgRNA, ce qui représente une réduction substantielle en temps et en coût matériel. De plus, les sgARN produits par cette méthode atteignent des efficacités d’édition comparables à celles générées par le clonage à base de plasmides, comme confirmé par des tests de clivage in vitro . Une comparaison de ces approches est illustrée à la Figure 1.

La PCR D’EXTENSION DE CHEVAUCHEMENT (OE-PCR) fournit une stratégie rapide et indépendante de ligase pour assembler les fragmentsd’ADN 8. Cette approche a été adaptée pour la synthèse de gabarits de sgRNA à l’aide d’amorces superposées. Dans une réaction en une étape utilisant quatre amorces partiellement superposées, une liaison compétitive se produit : les amorces extérieures (AF1 et Tracr-R) définissent les frontières d’amplification, tandis que les amorces internes (AF2 et AF3) doivent être diluées pour assurer une extension ordonnée des deux extrémités vers le centre. Malgré ce cadre théorique, un paramètre critique affectant l’efficacité de l’assemblage — le rapport optimal d’amorces — n’a pas été étudié de manière systématique. De plus, l’applicabilité plus large de telles méthodes OE-PCR à différents systèmes CRISPR reste sous-explorée.

Pour remédier à ces limitations, une étude a été conçue pour optimiser et valider une méthode PCR chevauchante en une étape pour la synthèse de gabarit d’ARNsg. Le rapport d’amorce optimal a été établi grâce à un plan expérimental structuré, avec l’électrophorèse sur gel d’agarose utilisée pour identifier les conditions donnant un produit unique, de taille correcte. Après optimisation, la polyvalence de la méthode a été évaluée sur deux systèmes CRISPR largement utilisés (SpCas9 et saCas9), avec une amplification réussie des deux modèles. La validation fonctionnelle utilisant des tests de clivage in vitro a démontré que les ARNsgRNA générés par cette méthode atteignent des efficacités comparables à celles obtenues par clonage à base de plasmides.

Pour évaluer davantage la fonctionnalité dans un contexte cellulaire, le sgRNA de SpCas9 a été complexé avec la protéine Cas9 pour former des complexes ribonucléoprotéiques (RNP) et délivré dans HEK293T cellules par électroporation. L’édition génomique à un locus endogène a été évaluée à l’aide d’un test d’endonucléase T7 I (T7EI), avec des motifs de clivage sur des gels d’agarose indiquant une formation d’indel détectable in vivo. Collectivement, ces résultats démontrent que cette méthode produit de manière fiable des modèles de sgRNA fonctionnels de haute qualité. Le protocole suivant décrit la procédure détaillée en utilisant SpCas9 comme exemple représentatif, avec des modèles d’amorce fournis pour l’adaptation à d’autres nucléases Cas.

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Protocole

L’utilisation de la lignée cellulaire HEK293T disponible commercialement (ATCC CRL-3216) a été réalisée conformément aux directives du Comité d’éthique du First People’s Hospital de la ville de Chenzhou, Université de Chine du Sud, pour l’utilisation des lignées cellulaires d’origine humaine. Les réactifs, logiciels et équipements utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Conception des séquences cibles d’ARNsgs

  1. Identifier la région génomique cible à l’aide d’outils en ligne établis (par exemple, CRISPRscan, CHOPCHOP ou Broad Institute CRISPick)3.
  2. Accédez au serveur web CHOPCHOP à https://chopchop.cbu.uib.no/ 3,9.
  3. Entrez les informations du gène cible et sélectionnez le système CRISPR/Cas approprié (par exemple, EGFR pour CRISPR/Cas9) (Figure 2A).
  4. Examinez la table de sortie, incluant le rang, la séquence cible, la localisation génomique, le brinement, le contenu en GC ( %), l’auto-complémentarité, les sites hors-cible prédits (MM0, MM1, MM2, MM3) et le score d’efficacité (Figure 2B).
  5. Sélectionnez une séquence d’ARN guide avec un haut rendement sur la cible et une faible activité hors-cible prédite.
  6. Enregistrer la séquence finale de cible sgRNA pour la conception de l’amorce (par exemple, séquence cible EGFR : « CTTAATTCCTTGATAGCGGG ») (Figure 2B).

2. Synthèse et préparation de quatre amorces qui se chevauchent

  1. Concevez quatre amorces oligonucléotides (AF1, AF2, AF3, Tracr-R) avec des régions qui se chevauchent comme suit (Figure 3A) :
    AF1 : 5′–TTCTAATACGACTCACTATAG
    [cible seq] GTTTTAGAGCTAGAAATAG–3′
    AF2 : 5′–GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGT
    TAAAATAAGGCTAGTCCTATCAAC–3′
    AF3 : 5′–GGCTAGTCCGTTATCAACTTG
    AAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTT–3′
    Tracr-R : 5′–AAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC–3′
    REMARQUE : Remplacez [target seq] dans l’amorce AF1 par la séquence obtenue à l’étape 1.6.
  2. Synthétiser les amorces à une échelle de 25 nmol avec une purification désaline standard.
  3. Resuspendez les amorces séchées dans de l’eau sans nucléase à une concentration de base de 100 μM. Centrifugez à 5000 × g pendant 1 minute à température ambiante.

3. Optimisation de la concentration d’amorces et PCR chevauchante en une étape pour la synthèse du sgRNA

  1. Préparez des mélanges d’amorces avec des concentrations variables d’AF2 et AF3 selon le tableau 1. Maintenez AF1 et Tracr-R à 10 μM.
  2. Préparez les réactions PCR dans des tubes sans nucléase de 0,2 mL selon le tableau 2. Utilisez une ADN polymérase haute fidélité.
  3. Mélangez doucement en pipettant cinq fois. Ne pas faire de vortex. Centrifugez à 5000 × g pendant 1 minute.
  4. Effectuez la PCR en utilisant les conditions de cycle décrites dans le tableau 3.

4. Électrophorèse et récupération de modèles d’ADN

  1. Préparez un gel d’agarose à 2 % en dissolvant 2 g d’agarose dans 100 mL de tampon 1× TAE. Refroidissez à 50–60 °C, ajoutez une coloration d’acide nucléique de 5 μL, puis coulez le gel.
  2. Laissez le gel solidifier pendant 30 minutes à température ambiante.
  3. Chargez un produit PCR de 10 μL mélangé avec 2 μL de tampon de chargement à 6×. Incluez une échelle d’ADN à 100 pb.
  4. Faites exécuter l’électrophorèse à 100 V pendant 30 à 40 minutes.
  5. Visualisez sous éclairage UV. Confirmez que la Condition 9 (AF1 :AF2 :AF3 :Tracr-R = 50:5:1:50) produit une seule bande de ~120 bp (Figure 4A).
  6. Utilisez des concentrations optimisées d’amorces : AF1 10 μM, AF2 1 μM, AF3 0,2 μM, Tracr-R 10 μM.
  7. Retirez la bande cible avec un scalpel stérile. Limitez l’exposition aux UV à ≤30 s.
    REMARQUE : Conservez les tranches de gel à −20 °C pendant jusqu’à 1 semaine ou procédez immédiatement.

5. Purification des modèles d’ADN

  1. Purifiez l’ADN à l’aide d’un kit d’extraction en gel selon les instructions du fabricant10.
  2. Élute de l’ADN dans de 20 à 30 μL d’eau sans nucléase préchauffée (60 °C).
  3. Mesurer la concentration d’ADN. Rendement typique : 15–50 ng/μL ; A260/A280 : 1,8–2,0.
    REMARQUE : Conserver l’ADN purifié à −20 °C pendant jusqu’à 1 an.

6. Transcription in vitro et purification de sgRNA

  1. Assembler la réaction de transcription à l’aide d’un kit de synthèse d’ARN T7 (Tableau 4). Préparer sur glace11.
    REMARQUE : Utilisez des matériaux sans RNase et décontaminez toutes les surfaces.
  2. Incubez à 37 °C pendant 16 heures.
  3. Ajoutez 1 μL de DNase I et incubez à 37 °C pendant 15 minutes.
  4. Purifiez le sgRNA à l’aide d’un kit de nettoyageARN 12.
  5. Éluter dans de l’eau sans nucléase de 30 à 50 μL.
  6. Quantifier le sgRNA. Rendement attendu : 700–900 ng/μL ; A260/A280 : 1,9–2,1.
    REMARQUE : Conserver l’ARNsgRNA à −80 °C pendant jusqu’à 1 an.

7. Test de clivage in vitro pour vérifier l’activité des sgRNA

  1. Préparer et purifier l’ADN cible. Ajuster la concentration à 60 ng/μL13.
  2. Assembler la réaction de clivage (Tableau 5) — pré-incuber sans ADN à 25 °C pendant 30 minutes. Inclure un témoin négatif.
  3. Ajouter 1 μL d’ADN cible.
  4. Incubez à 37 °C pendant 2 heures.
  5. Ajoutez 4 μL de tampon de charge à 6× pour arrêter la réaction.
  6. Faites fonctionner les produits sur un gel d’agarose à 2 % à 100 V pendant 30 à 40 minutes.
  7. Visualisez sous lumière UV. Confirmez le clivage (par exemple, 617 pb → 414 pb + 203 pb) (Figure 4C).

8. Validation cellulaire de l’édition Cas9 guidée par sgRNA

  1. Préparez le complexe ribonucléoprotéine (RNP) en mélangeant la protéine Cas9 et l’ARNsgDNA à un rapport molaire de 1:2. Combinez 10 μL de Cas9 (4 mg/mL), 280 μL d’ARNsgDNA (60 ng/μL) et 200 μL de DMEM. Incubez pendant 15 minutes.
  2. Cultivez HEK293T cellules jusqu’à ~80 % de confluence. Prélevez et ajustez à 3 × 106 cellules par échantillon.
  3. Combinez le complexe RNP avec les cellules et incubez pendant 10 minutes à température ambiante.
  4. Transférer sur une cuvette d’électroporation de 2 mm. Électroporer à 115 V, 4 ms, une impulsion (575 V/cm). Ajouter immédiatement 10 mL de milieu complet et transférer sur une plaque à 6 puits.
  5. Incubez à 37 °C avec 5 % deCO2 pendant 48 heures.
  6. Extraire l’ADN génomique des cellules traitées et témoins. Mesurer la concentration.
    REMARQUE : Conserver l’ADN à −20 °C pendant jusqu’à 6 mois.
  7. Amplifiez le locus cible par PCR (Tableau 6 et Tableau 7).
    REMARQUE : Taille attendue du produit : 617 pb pour l’EGFR.
  8. Vérifiez les produits PCR sur un gel d’agarose à 2 %. Purifiez la bande correcte et quantifiez l’ADN.
  9. Effectuer la formation hétéroduplex (Tableau 8 et Tableau 9).
  10. Ajoutez 1 μL d’endonucléase T7 I et incubez à 37 °C pendant 15 minutes. Inactivez à 85 °C pendant 10 minutes.
  11. Ajoutez un tampon de chargement et utilisez un gel d’agarose à 2 %.
  12. Visualisez sous lumière UV. Confirmez la formation de l’indel (617 pb → 414 pb + 203 pb) (Figure 4D).

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Résultats

L’application réussie du protocole PCR à chevauchement en une étape produit une bande d’ADN unique et nette de la taille attendue lorsqu’elle est analysée par électrophorèse sur gel d’agarose.

Des rapports d’amorces sous-optimaux, en particulier ceux avec des concentrations excessives d’amorces internes (AF2 et AF3), entraînent des bandes supplémentaires plus grandes que le produit attendu, indiquant une amplification non spécifique ou une formation d’amorce-d...

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Discussion

Un protocole simplifié et économique pour synthétiser les gabarits d’ADN d’ARNsg via une stratégie PCR chevauchante en une étape est décrit. Cette méthode élimine le besoin de construction et de clonage de plasmides, réduisant le temps de préparation du modèle de plusieurs jours à environ 5 heures. Un aspect clé de cette approche est l’optimisation systématique du rapport amorce, déterminé à 50:5:1:50 (AF1 :AF2 :AF3 :Tracr-R), correspondant à des concentrations de travail de 10 ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le projet de recherche en santé de la Commission provinciale de la santé du Hunan (subvention numéro W20243264), la Natural Science Foundation of Hunan province (grant numéro 2023JJ50368), le projet clé de recherche du Département de l’Éducation de la province du Hunan (subvention numéro 24A0607), et le projet d’équipe innovant du First People’s Hospital of Chenzhou (subvention numéro CX202103).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
100 bp DNA LadderTIANGENMD109Marqueur de taille d'ADN pour l'électrophorèse
2Taq Plus MasterMixCWBIOCW2849MRéactif d'amplification PCR
50 bp DNA LadderTIANGENMD108Marqueur de taille d'ADN pour les petits fragments
6DNA loading bufferTIANGEN1109565Tampon de chargement d'échantillon pour l'électrophorèse
Agarose Gel DNA Recovery KitTIANGENDP219Purification d'ADN à partir de gel d'agarose
Agarose I Thermo Scientific 17850Préparation de gel d'agarose
Broad Institute CRISPickhttps://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/publicOutil de conception sgRNA
CentrifugeHENGNUO2-16RCentrifugation d'échantillon
Certified Copper Fetal Bovine SerumUmedium, Beijing BioTopped Technology Co., Ltd3023ASupplément pour culture cellulaire
CH3CO2HShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., LtdA758682Réactifs pour la préparation de la solution tampon TAE
CHOPCHOPhttps://chopchop.cbu.uib.no/Outil de conception sgRNA
CO2 incubatorThermo Scientific51032874Incubation de culture cellulaire de mammifère
CRISPRscanhttps://www.crisprscan.org/Outil de conception sgRNA
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)KeyGEN BioTECHKGL1211-500Milieu de culture cellulaire
dsDNaseThermo Scientific EN0771Élimination du modèle d'ADN après transcription
ECM 830 Square Wave Electroporation SystemBTXECM830Électroporation des cellules
EDTA Na2BioSharpBS108Réactifs pour la préparation de la solution tampon TAE
Electric thermostatic water bathSHANGHAI SUMSUNG LABORATORY INSTRUMENT CO.,LTDDKD8Incubation à température contrôlée
Electrophoresis Apparatus TrophoresisLIUYIDYCP-31BNÉlectrophorèse sur gel d'agarose
Gel Imaging analysis systemShanghHai JiaPengZF-258Visualisation et imagerie de gel
GenCRISPR SpCas9GenScriptZ03624-GMP-2.5Nucléase Cas9 pour l'édition du génome
Genomic DNA extraction kitTIANGENYDP304Isolation d'ADN génomique
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis KitNEBE2040STranscription in vitro de sgRNA
MiniAmp ThermocyclerThermo Scientific A37834Amplification PCR
NanoDrop 2000c SpectrophotometerThermo Scientific 2000cQuantification d'acides nucléiques
Nucleic acid stain (e.g., GeneRed)TIANGENRT211Visualisation de l'ADN dans un gel d'agarose
PCR Using Q5 Quick-Load High-Fidelity 2X Master MixNEBM0578Amplification PCR haute-fidélité
Primers (AF1, AF2, AF3, Tracr-R)GenScriptOligonucléotides pour l'assemblage du modèle de sgRNA
Tris-baseBioSharpBS083Réactifs pour la préparation de la solution tampon TAE
VAHTS RNA Clean BeadsVAHTSN412-01Purification de l'ARN

Références

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Mots-clés

Synth se de matrice d ADNtranscription in vitrooptimisation des amorceslectrophor se sur gel d agarosecomplexe ribonucl oprot iquelectroporationdition du g nome

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