PCR chevauchante en une étape pour la synthèse rapide de gabarits d’ADN d’ARN à guide unique pour le système CRISPR

Yao Yao; Jia Li; Lili Duan; Jun Chen; Guoqing Li; Zheng Hu

doi:10.3791/70369

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Article de méthode

PCR chevauchante en une étape pour la synthèse rapide de gabarits d’ADN d’ARN à guide unique pour le système CRISPR

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DOI :

10.3791/70369

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24 avril 2026

Yao Yao¹^,² , Jia Li² , Lili Duan² , Jun Chen² , Guoqing Li¹^,³ , Zheng Hu¹^,²

¹Institute of Cytology and Genetics, School of Basic Medical Sciences, Hengyang Medical School, University of South China, ²Translational Medicine Institute, the First People's Hospital of Chenzhou, Hengyang Medical School, University of South China, ³National Health Commission Key Laboratory of Birth Defect Research and Prevention & Ministry of Education Key Lab of Rare Pediatric Diseases, Institute of Cell Biology and Genetics, School of Basic Medical Sciences, Hengyang Medical School, University of South China

Dans cet article

Résumé

Une méthode de PCR chevauchante en une étape, utilisant quatre amorces, permet une génération rapide et à faible coût de gabarits d’ADN pour la transcription in vitro de sgARN. Un ratio optimisé des amorces (50:5:1:50) produit des sgRNA de haute qualité en 5 heures, avec une validation fonctionnelle démontrée par des tests in vitro et des activités d’édition dans HEK293T cellules.

Résumé

Le système CRISPR–Cas a révolutionné l’édition du génome ; cependant, les méthodes conventionnelles de génération d’ARN à guide unique (sgRNA) impliquent souvent des étapes de clonage longues ou des kits de synthèse commerciaux coûteux. Une stratégie PCR superposée optimisée en une étape est présentée pour la synthèse rapide et économique de gabarits d’ADN pour la transcription in vitro de sgRNA. En utilisant quatre amorces partiellement superposées couvrant le promoteur T7, la séquence guide spécifique à la cible et l’échafaudage de sgRNA, des modèles de longueur complète sont assemblés en une seule réaction PCR sans clonage. L’optimisation expérimentale systématique a établi un rapport d’amorce optimal (AF1 :AF2 :AF3 :Tracr-R = 50:5:1:50), minimisant les sous-produits non spécifiques tout en maximisant le rendement complet du produit, comme confirmé par l’électrophorèse en gel d’agarose. Cette approche a été étendue avec succès pour générer des modèles pour le sgRNA Staphylococcus aureus Cas9 (saCas9), démontrant une applicabilité inter-systèmes au-delà de Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9). Bien que la synthèse chimique directe des sgRNA offre des avantages tels que la haute pureté, des modifications chimiques pour améliorer la stabilité et des effets hors cible réduits, elle reste prohibitivement coûteuse pour les applications à haut débit ou les criblages à grande échelle nécessitant de nombreux sgRNA. Les analyses de clivage in vitro ont démontré que les ARN-guides générés par cette méthode atteignent des efficacités d’édition comparables à celles obtenues par le clonage conventionnel à base de plasmides. De plus, les complexes ribonucléoprotéiques assemblés avec ces sgRNA et livrés dans HEK293T cellules par électroporation ont entraîné la formation d’indel détectable au locus cible, confirmant la fonctionnalité in vivo. L’analyse des coûts indique que cette méthode réduit substantiellement les coûts de préparation du gabarit par rapport aux kits de synthèse commerciaux tout en diminuant le temps de traitement de jours à plusieurs heures, offrant ainsi une approche accessible et évolutive pour les laboratoires engagés en recherche génétique.

Introduction

Le système CRISPR–Cas, issu d’un mécanisme immunitaire adaptatif chez les bactéries et les archées, a révolutionné l’ingénierie génétique en permettant une édition génomique précise sur divers organismes ^1,2. Un composant clé est l’ARN à guide unique (sgRNA), un ARN chimérique qui dirige les nucléases Cas vers des loci génomiques spécifiques ; sa conception modulaire permet un reciblage par modification d’une séquence proto-espaceuse d’environ 20^{nucléotides 3}. Au-delà de SpCas9, d’autres nucléases Cas aux propriétés distinctes ont été largement adoptées....