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Article de méthode

Isolation à noyau unique à partir du tissu endartériectomique coronarien des patients atteints de pontage coronarien

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DOI :

10.3791/70382

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3 avril 2026

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1Department of Medical Biotechnology, Gujarat Biotechnology University, 2U. N. Mehta Institute of Cardiology and Research Centre

Dans cet article

Résumé

Des échantillons de tissu d’endartériectomie coronarienne ont été traités pour isoler un seul noyau selon un protocole de dissociation optimisé. L’intégrité des noyaux isolés a été validée par trois approches complémentaires : la coloration par bleu de trypan pour évaluer l’intégrité membranaire, la microscopie confocale basée sur DAPI pour confirmer la morphologie nucléaire, et la cytométrie en flux pour quantifier le rendement et la pureté nucléaires.

Résumé

L’athérosclérose est une affection inflammatoire chronique et progressive caractérisée par l’accumulation de plaques dans les parois des artères. Au cours de la formation de la plaque, certaines lésions deviennent instables, appelées plaques à haut risque, et peuvent provoquer un infarctus du myocarde (IM). Une plaque athéroscléreuse comprend des cellules musculaires lisses, endothéliales, immunitaires, graisseuses et nécrotiques, chacune pouvant provoquer la rupture de la plaque. Il est crucial d’étudier l’hétérogénéité cellulaire au sein des plaques athérosclérotiques afin de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à l’instabilité des plaques. Nous présentons un protocole facilement reproductible pour isoler et valider les noyaux à partir de tissu endarterectomique coronarien humain obtenu auprès de patients subissant une chirurgie de pontage coronarien (CABG). Tous les tissus sont conservés sur de la glace humide dans un milieu de l’Institut Memorial Roswell Park (RPMI) afin de préserver l’intégrité cellulaire avant la récolte. Les échantillons de tissu sont finement hachés puis délicatement perturbés à l’aide d’un micropilon dans un tampon de lyse pour lyser les cellules et libérer les noyaux. Les noyaux isolés sont ensuite évalués pour leur intégrité et leur rendement à l’aide du test d’exclusion bleu de trypan dans un microscope inversé composé. La coloration DAPI permet de visualiser des noyaux intacts par microscopie confocale, et la cytométrie en flux fournit une quantification basée sur la fluorescence pour évaluer le rendement de l’isolation nucléaire et valider la population nucléaire. Contrairement aux méthodes traditionnelles d’isolation par dissociation unicellulaire, l’isolation nucléaire réduit le stress cellulaire et maintient l’environnement transcriptomique natif, empêchant ainsi les changements dans l’expression génique. La préparation nucléaire de haute qualité obtenue grâce à cette méthode est compatible avec des applications en aval telles que le séquençage d’ARN à noyau unique (snRNA-seq).

Introduction

La maladie cardiovasculaire athéroscléreuse (ASCVD) est la principale cause mondiale de décès et d’invalidité, et malgré d’importants progrès thérapeutiques, son fardeau reste intact. L’athérosclérose est une maladie inflammatoire chronique de la paroi artérielle, provoquée par des interactions complexes et dynamiques entre diverses populations cellulaires qui orchestrent collectivement la progression silencieuse de la maladie subclinique précoce vers des événements cardiovasculaires (CV) qui modifientla vie 2.

Dans les artères moyennes et grandes, l’accumulation de dépôts de cholestérol dans les macrophages est une caractéristique de l’athérosclérose3. La plaque athéroscléreuse est composée d’acides gras, de cholestérol, de cellules inflammatoires, de calcium, de fibrine, de cellules musculaires lisses, de cellules endothéliales et de débris cellulaires dans lesous-endothélium 4. Les plaques athérosclérotiques sont classées en deux types : à faible risque et à haut risque. Les plaques à haut risque sont identifiées par leur tendance à déclencher un événement cardiovasculaire ultérieur, généralement par des mécanismes tels que l’érosion ou la rupture de plaques5.

Les caractéristiques des plaques à haut risque incluent de gros noyaux lipidiques, plusieurs cellules inflammatoires, moins de cellules musculaires lisses, un mince capuchon fibreux, une microcalcification, une hémorragie intraplaque, des vaisseaux néo-inflammatoires et un noyaunécrotique 6. La détection des plaques à haut risque est réalisée cliniquement à l’aide de modalités d’imagerie non invasives et invasives, à savoir la tomodensitométrie coronarienne (CCTA) et la tomographie de cohérence optique (OCT), respectivement 7,8. Malgré de nombreux progrès en imagerie cardiovasculaire, il reste difficile de prédire la rupture de la plaque athéroscléreuse responsable de l’infarctus du myocarde (IM), et cela n’est pas toujours utile en milieu clinique9.

Malgré des décennies de recherche, nous manquons toujours de biomarqueurs circulants fiables capables d’identifier spécifiquement les phénotypes des plaques à haut risque, laissant un vide critique dans notre gestion clinique de l’athérosclérose. Cela souligne la nécessité de stratégies moléculaires capables de caractériser ces plaques à un niveau biologique plusfondamental 7,10. Dans ce contexte, les marqueurs à base d’ARN ont attiré une attention considérable, car ils peuvent capturer l’activité transcriptionnelle complexe qui se produit dans le microenvironnementplaque 11. Les développements récents dans le séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) se sont révélés particulièrement puissants, offrant une résolution sans précédent pour profiler des cellules individuelles au sein de plaques athérosclérotiques et découvrir des populations cellulaires distinctes, des schémas d’expression génique et des voies moléculaires sous-jacents à la vulnérabilité à laplaque 12,13. Malgré ces avancées, on connaît peu les processus régulateurs, les interactions et l’importance fonctionnelle des différents types cellulaires impliqués dans le développement de l’athérosclérose14.

Lorsque la charge athérosclérotique est sévère et diffuse, la revascularisation chirurgicale devient la stratégie de traitement définitive. L’endartériectomie coronarienne (CE) est un complément chirurgical de la chirurgie de pontage coronarien (CABG) dans laquelle la plaque athéroscléreuse est retirée mécaniquement des artères coronaires diffuses afin de permettre un pontage et d’assurer une revascularisation complètedu myocarde 15,16. Les plaques athérosclérotiques et les échantillons d’endartarterectomie sont particulièrement difficiles à manipuler car ils contiennent une abondance de tissu nécrotique, des dépôts lipidiques, de la fibrine et des calcifications. Lorsque ces tissus sont décomposés pour analyse, ils génèrent d’importants débris qui obstruent les filtres et les systèmes microfluidiques, rendant l’isolement des cellules uniques viables extrêmementdifficile 17,18. En fait, une étude sur la plaque carotidienne a révélé que les cellules viables représentaient moins de 1 % de toutes les particules après traitement tissulaire ; le reste était simplement la plaquedébris 18.

Pour aggraver ce défi, les plaques athérosclérotiques existent dans un état de stress métabolique et oxydatif chronique, où les cellules subissant l’apoptose, la sénescence et d’autres processus dégénératifs rendent les membranes cellulaires de plus en plus fragiles et susceptibles de se perturber, rendant l’isolement de cellules uniques viables extrêmementdifficile 18,19,20 . La digestion mécanique et enzymatique nécessaire pour préparer les échantillons pour le scRNA-seq endommage souvent ces cellules déjà compromises, réduisant encore la viabilité et entraînant de faibles taux de capture cellulaire. Ce processus tend également à perdre sélectivement des populations cellulaires fragiles ou rares, ce qui introduit un biais significatif tant dans les données transcriptomiques que dans les types cellulaires représentés dans les résultats finaux. Ce problème devient encore plus marqué dans les plaques calcifiées ou fortement malades, où les conditions de traitement rudes nécessaires pour dégrader le tissu causent des dommages supplémentaires à la viabilité cellulaire 18,21,22.

En revanche, le noyau reste structurellement intact même dans ces conditionsadverses 23. Cela est principalement dû à l’enveloppe nucléaire, une double couche lipidique renforcée par des lamines nucléaires (Lamin A/C et Lamin B), qui assure une rigidité mécanique et une résistance aux contraintes osmotiques, enzymatiques et physiques qui perturbent facilement la membraneplasmique 24,25. La lame nucléaire préserve également la morphologie nucléaire même lorsque le cytoplasme environnant est gravement compromis26. Cela fait du séquençage à ARN à noyau unique (snRNA-seq) une alternative plus pratique et fiable au séquençage d’ARN unicellulaire (scRNA-seq) pour le profilage des tissusathéroscléreux 27. En capturant des informations transcriptionnelles provenant de noyaux intacts plutôt que de cellules entières, snRNA-seq contourne les limitations imposées par une faible viabilité cellulaire et une forte teneur en débris, permettant un profilage transcriptomique plus précis et complet du microenvironnementde la plaque 18.

Ainsi, dans cette étude, nous présentons un protocole d’isolation des noyaux optimisé, spécifiquement développé pour les tissus endarterectomies coronariens, incorporant une lyse non ionique à base de détergent et une durée de lyse empiriquement ajustée en fonction du degré de calcification tissulaire, afin d’obtenir de manière constante des noyaux de haute qualité avec une intégrité structurelle et ARN préservée, adaptée à une analyse ultérieure du snRNA-seq.

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Protocole

La présente étude a été réalisée avec approbation et conformément aux directives du Comité d’éthique humaine de l’Institut de cardiologie et du Centre de recherche de l’ONU Mehta (EC/Aprovation/26/Cardio/14/12/2024) et de l’Université de biotechnologie du Gujarat (GBU_IHEC/2023/006). Le consentement éclairé a été obtenu de tous les participants avant la collecte de l’échantillon. Les patients subissant une chirurgie de pontage coronarien avec endartériectomie coronarienne ont été sélectionnés pour la présente étude. Après l’ablation chirurgicale, le tissu de l’endartériectomie a été immédiatement placé dans un milieu RPMI sans sérum, maintenu à 4 °C, puis transporté au laboratoire dans environ 12 heures dans un cryovial. Voir le tableau des matériaux pour les détails sur tous les matériaux utilisés dans le protocole suivant.

1. Isolation des noyaux

REMARQUE : Effectuez toutes les étapes sur la glace et utilisez des matériaux stériles. Préparez tous les tampons fraîchement.

  1. Lavez le mouchoir une ou deux fois avec un médium RPMI sans sérum pour enlever les taches et fragments de sang. À l’aide de pinces stériles, transférez le tissu sur une boîte de Petri stérile et notez le poids.
  2. À l’aide d’une lame chirurgicale (n° 10), hachez le tissu en petits morceaux de 1 mm3 de taille.
  3. Préparez un tampon de lyse de 1 mL en combinant 10 mM de Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM de NaCl, 3 mM de MgCl2 (en utilisant des solutions d’origine de 1 M pour chaque composant), 0,1 % (v/v) de Nonidet P-40 dans de l’eau sans nucléase. Ajouter les composants séquentiellement dans l’ordre suivant : d’abord de l’eau sans nucléase, puis Tris-HCl, NaCl, MgCl₂ et enfin NP-40, pour éviter la mousse.
    REMARQUE : Le tampon de lyse doit être préparé frais le jour de l’utilisation et conservé au frais sur glace en permanence. Ne gèle pas.
  4. Ajoutez un tampon de lyse refroidi de 1 mL au tissu dans un tube microcentrifuge de 5 mL.
  5. Lisez le papier sur de la glace à l’aide d’un micropilon en appliquant une force douce et constante, puis en faisant tourner le micropilon dans le sens horaire et antihoraire alternativement. Poursuivez la lyse pendant environ 30 minutes, en veillant à ce que l’échantillon reste froid tout au long de la durée.
    REMARQUE : Lisez le tissu jusqu’à ce qu’il devienne trouble. Utilisez une pointe de 1000 μL pour mélanger doucement en pipettant.
  6. Filtrez la solution à l’aide d’une tamoire de 100 μm de la taille d’un pore dans un tube centrifugeuse de 15 mL pour éliminer les débris et les morceaux de tissu.
    REMARQUE : Le filtrat doit paraître moins turbide avec des débris visibles retenus sur la passoire.
  7. Centrifugez les noyaux à 500 x g pendant 5 minutes à 4 °C à l’aide d’un rotor à seau pivotant.
    REMARQUE : Un granule visible doit se former au fond du tube.
  8. Retirez le surnageant à l’aide d’une pointe de pipette à calibre classique sans déranger la pastille.
  9. Préparez un lavage et un tampon de resuspension des noyaux en combinant 1 % d’albumine sérique bovine (BSA) (en utilisant 10 % de solution stock), un inhibiteur RNase à 0,2 U/μL (en utilisant une solution de stock de 20 U/μL) dans 1X solution tampon phosphate Dulbecco (DPBS). Ajouter les composants séquentiellement dans l’ordre suivant : DPBS d’abord, puis BSA, et enfin inhibiteur RNase.
    REMARQUE : Le tampon doit être préparé frais le jour de l’utilisation et maintenu au frais sur la glace en permanence. Ne gèle pas.
  10. Resuspendez la pastille dans un lavage de noyaux et un tampon de resuspension. Refroidissez le tampon sur de la glace avant utilisation.
  11. Évaluer l’efficacité de la lyse et la viabilité cellulaire en colorant avec 5 μL de bleu de trypan et en comptant à l’hémocytomètre.
    REMARQUE : Si des cellules viables sont encore présentes, centrifugez à 500 x g pendant 5 minutes à 4 °C, puis répétez les sections 3 à 10.
  12. Filtrez la solution à l’aide d’un filtre de pore de 30 μm dans un tube centrifugeuse de 15 mL pour éliminer les débris et les agmeaux.
  13. Centrifugez les noyaux à 500 x g pendant 5 minutes à 4 °C à l’aide d’un rotor à seau pivotant.
  14. Retirez le surnageant à l’aide d’une pointe de pipette à calibre classique, puis resuspendez la pellete dans 1 mL de lavage des noyaux et de tampon de resuspension.

2. Caractérisation des noyaux isolés

  1. Coloration bleue de Trypan pour évaluer l’intégrité des noyaux.
    1. Prenez 15 μL de la suspension de noyaux isolés dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL.
    2. Ajoutez 5 μL de colorant bleu de trypan (0,4 % en v/v) et mélangez doucement en pipettant.
    3. Incubez à température ambiante pendant 5 minutes pour permettre une bonne teinture.
    4. Chargez 10 μL du mélange coloré sur un hémocytomètre.
    5. Observez sous un microscope inversé composé pour examiner la morphologie et compter le nombre de noyaux.
  2. Analyse de cytométrie en flux de suspension à noyau unique
    1. Prenez 1 mL de suspension à noyaux isolés et centrifugez la suspension à noyaux à 500 x g pendant 5 minutes à 4 °C à l’aide d’un rotor à godet oscillant.
    2. Retirez le surnageant à l’aide d’une pointe de pipette à ouage régulier et resuspendez la pellete dans un tampon FACS de 200 μL (1X PBS et 1 % BSA).
    3. Divisez 200 μL de noyaux en suspension en deux aliquotes : gardez 100 μL comme témoin non coloré et utilisez 100 μL comme échantillon coloré.
    4. Ajouter 1 μL de 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (1 mg/mL) à l’échantillon coloré pour obtenir une concentration finale de 10 μg/mL. Mélangez doucement et faites couver à température ambiante dans le noir pendant 5 minutes avant l’analyse cytométrique en flux.
    5. Dans le cytomètre en flux utilisé pour cette étude, utilisez le laser violet à 405 nm, et détectez à 448/45 nm. Prélez d’abord l’échantillon témoin non coloré et recueillez un minimum de 10 000 événements sur la population totale.
    6. Réglez la tension à 183 V pour la diffusion directe (FSC), 300 V pour la diffusion latérale (SSC) et 400 V pour V450 (laser DAPI). Fixez le seuil à 10 000 pour la FSC.
      REMARQUE : Tous les réglages de tension et de gain de l’instrument sont constants entre les échantillons pour maintenir la cohérence.
    7. Tracez la zone de diffusion avant (FSC-A) par rapport à la hauteur de diffusion avant (FSC-H) pour distinguer les singlets des doublets et des agrégats. Tracez une porte autour d’événements montrant une relation linéaire pour ne conserver que les noyaux singlet.
    8. Générez un graphique bivarié de FSC-A versus aire de dispersion latérale (SSC-A). Appliquer une large porte englobant toute la population dispersée, car les noyaux isolés présentent généralement un profil de dispersion hétérogène sans sous-populations distinctes.
    9. Créer un graphique de densité 2D (pseudo-couleur) de SSC-A versus une zone violette de 450 nm (V450-A). Utilisez le contrôle non coloré pour définir la fluorescence de fond et guider le placement précis des grilles. Identifier et verrouiller la population DAPI⁺ distincte correspondant aux noyaux intacts.
      REMARQUE : Comme un seul fluorochrome (DAPI) est utilisé, la compensation de fluorescence n’est pas nécessaire.
  3. Imagerie des noyaux isolés à l’aide de microscopie confocale
    1. Prenez 50 μL de suspension de noyaux et ajoutez 1 μL de DAPI (1 mg/mL) à l’échantillon coloré pour obtenir une concentration finale de 10 μg/mL, mélangez doucement, puis incubez à température ambiante pendant 5 minutes dans l’obscurité avant l’imagerie confocale.
    2. Montez 5 μL de suspension de noyaux colorés sur une lame en verre propre et recouvertez-la d’une gaine de revêtement.
      REMARQUE : Éviter la fixation pour préserver la morphologie nucléaire.
    3. Visualisez les noyaux à l’aide d’un microscope confocal inversé. Ouvre le logiciel du microscope confocal et observe d’abord en champ lumineux 10X, puis passe en champ lumineux 40X.
    4. Acquérir des images confocales à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser équipé d’un détecteur spectral et d’objectifs PLAN APO λD 40X (NA 0,95, RI 1,0). Excitez le DAPI à l’aide d’un laser de 405 nm et collectez l’émission entre 429 et 474 nm.
    5. Les paramètres d’imagerie étaient les suivants :
      1. Mode détecteur : Multi-canal (GaAsP)
      2. Scanner : Galvano unidirectionnel
      3. Mode de balayage : Bande
      4. Moyenne de ligne : 2X
      5. Résolution : 1024 × 1024 pixels
      6. Temps de séjour : 2,0 μs
      7. Taille du trou d’épingle : 47,7 μm
      8. Puissance laser : 0,1-9,3 % (selon l’intensité du champ)
      9. Gain du détecteur : 37,8-45,9 %
      10. Zoom : 1,0X
      11. Étalonnage : 0,43-0,58 μm/pixel
    6. Acquiert toutes les images avec la caméra AX avec un mode de diaphonie minimal sous des configurations optiques identiques, et le système de mise au point parfaite (PFS) doit être actif pendant l’imagerie pour maintenir la stabilité du plan z.

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Résultats

Le tissu endarterectomique coronarien humain a été prélevé sur des patients subissant une chirurgie de CABG. Le tissu a été pesé et traité pour l’isolement des noyaux, et d’autres noyaux isolés ont été confirmés par cytométrie en flux et microscopie confocale (Figure 1).

Évaluation bleu de trypan de la qualité de l’isolation des noyaux
Le tissu maintenu dans un moyen RPMI a été pesé, et il mesurait 247,8 mg. Le tissu a été haché, puis homogénéi...

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Discussion

Un flux de travail optimisé pour l’isolement des noyaux du tissu endartériectomique coronarien humain est décrit dans le protocole actuel. Le protocole d’isolement nucléaire décrit ici a été spécifiquement conçu pour surmonter les limites critiques de l’obtention de cellules viables et intactes à partir de plaques athéroscléreuses coronariennes avancées. Contrairement aux approches conventionnelles scRNA-seq qui reposent sur une digestion enzymatique agressive et une dissociation

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le Conseil indien de la recherche médicale (ICMR) (EM/Dev/SG/34/01106/2024) et par la collaboration de l’Institut de cardiologie et du Centre de recherche des Nations Unies Mehta, Ahmedabad. Khushi Jani remercie la Commission de subventions universitaires (UGC) et le Conseil de la recherche scientifique et industrielle (CSIR), Gouvernement de l’Inde, pour avoir délivré la qualification conjointe CSIR-UGC NET (N° DE RÉFÉRENCE NTA : 241620143543).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
100 & mu ; Filtre MMiltenyi Biotech  ;130-098-463
30 & mu ; Filtre MMiltenyi Biotech  ;130-098-458
Albumine sérique bovineHiMediaTC546-25G
CentrifugeuseMPWNAhttps://mpw.pl/en/offer/mpw-352r
Microscope à composésNikonNA  ;Microscope inversé Nikon Eclipse Ts2 (https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_AOM/products/inverted-microscopes/eclipse-ts2)
Microscope confocal & nbsp ;NikonNAMicroscope confocal inversé Nikon Ti2-E (https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_AOM/products/inverted-microscopes/eclipse-ti2-series)
CouverturesHiMediaBG011C
Fiole de spécimen à large bouche CRYOCHILTarsons883191
DAPISigmaD9542-5MG
DPBSGibco (thermofischer)10010-023
Tube centrifugeuse (15 mL)Tarsons546021
Cytomètre en débit   ;BD Biosciences663029BD FACSLyric (3L12C Instrument CEIVD)
HémocytomètreAxibioCCB 100
Tube microcentrifuge (1,5 mL)Tarsons500010C
Tube à microcentrifuge (5 mL)Tarsons500050
MgCl2SigmaM1028-100ML
Micro pilonTarsons160020
NaClSigmaS9888-500G
NP-40HiMediaMB143-100ML
Eau sans nucléaseGibco (thermofischer)W4502-1L
Inhibiteur de RNaseSigma333540201
RPMI 1640Gibco (thermofischer)11875093
Diapositive  ;Riviera72910135
Tris-HClSigmaT2194-100ML
Bleu de Trypan  ;Sigma302643-25G

Références

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