Analyse multi-omique intégrative du Buti huatan Tang dans la maladie pulmonaire obstructive chronique

Résumé

Le profilage multi-omique du Buti Huatan Tang (BTHTT) dans la maladie pulmonaire obstructive chronique révèle son potentiel à moduler l’axe métabolique de l’hormone thyroïdienne IL-1R2/IL-1β-thyroïdienne. Ce travail fournit un cadre pour une validation mécanistique supplémentaire des composants bioactifs de la BTHTT, établissant une base pour de futures études d’intervention causale nécessaires à la confirmation de cet axe.

Résumé

Cette étude a utilisé un cadre multi-omique et de biologie computationnelle pour étudier le potentiel thérapeutique de la formule de la médecine traditionnelle chinoise (MTC) Buti Huatan Tang (BTHTT) contre la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC). Des améliorations physiologiques significatives ont été observées dans un modèle de rat après l’intervention BTHTT. L’analyse histologique a montré une inversion des lésions pathologiques pulmonaires, tandis que les analyses biochimiques et la transcriptomique ont confirmé la normalisation des niveaux d’IL-1β et IL-1R2 . De plus, le profilage métabolique a révélé que le BTHTT corrigeait les perturbations des niveaux d’hormones thyroïdiennes T3 et T4. Une corrélation négative a été observée entre l’axe IL-1β/IL-1R2 et ces hormones thyroïdiennes, indiquant que leur régulation est liée à l’effet thérapeutique de la formule. Au-delà des mesures directes, des algorithmes d’apprentissage automatique ont identifié dix gènes signatures de la MPOC à partir de bases de données cliniques. L’analyse d’enrichissement des voies suggère que la BTHTT pourrait agir via des interactions cytokine-cytokine-récepteur et des voies de synthèse des hormones thyroïdiennes. De plus, bien que 283 composants aient été identifiés in vivo, des composés tels que le tanshinone IIA et le cryptotanshinone sont actuellement considérés comme des substances actives candidates. Leur rôle de moteurs principaux est soutenu par un modèle dans lequel ils se lient de manière stable à l’IL-1R2 ; cette inférence repose sur des simulations d’amarrage moléculaire et de dynamique moléculaire (MD) plutôt que sur une isolation expérimentale directe. Dans l’ensemble, les données soutiennent un modèle dans lequel le BTHTT exerce un effet multi-cibles sur la MPOC en modulant l’inflammation et l’homéostasie métabolique. Cette approche intégrée fournit une base scientifique affinée pour l’application clinique du BTHTT et met en lumière des voies spécifiques pour une validation expérimentale future.

Introduction

La maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC), l’une des maladies respiratoires les plus courantes en pratique clinique, est devenue la troisième cause de mortalité mondiale en raison de son taux d’invalidité extrêmement élevé et de ses exacerbations aiguës^{récurrentes 1}. La MPOC a été un facteur important ayant conduit à la perte de capacité de travail dans la population et à une forte augmentation des coûts des soins familiaux, avec des pertes sociales et économiques largement supérieures à celles de la plupart des maladies^{chroniques 2}. Dans l'« Initiative Healthy China 2030 », la BPCO a été classée comme une maladie clé pour la prévention et le traitement. En raison d’une compréhension incomplète des mécanismes sous-jacents à la BPCO, l’utilisation combinée de bronchodilatateurs et de corticostéroïdes est restée le traitement principal. Bien que cette approche ait apporté un soulagement relativement évident des symptômes, elle ne peut pas empêcher le déclin progressif de la fonction pulmonaire. De plus, l’utilisation prolongée des corticostéroïdes augmente inévitablement l’incidence des réactions indésirables, ce qui affecte davantage l’efficacité à long terme des médicaments et la tolérance^{des patients 3}. Des études ont montré que même avec une triple thérapie, 28 % à 31 % des patients présentent encore des exacerbations aiguës ou une aggravation des symptômes. Par conséquent, le développement de médicaments efficaces contre la MPOC reste un enjeu clé et principal dans la recherche actuelle sur^{la MPOC 4}.

Pour répondre à ces besoins, des formules classiques de la MTC telles que Buti Huatan Tang (BTHTT), Shengmai Yin et Bu Fei Tang ont été développées. Parmi eux, le BTHTT s’est particulièrement distingué pour ses effets significatifs dans la tonifier du poumon, augmenter l’énergie et résoudre le mucus pour soulager la ^toux 5,6,7,8. Le BTHTT était largement utilisé dans le traitement clinique de la BPCO, non seulement pour son efficacité remarquable et ses effets secondaires minimes, mais aussi pour son potentiel à inverser le déclin progressif de la fonction pulmonaire. Il présentait un grand potentiel dans les contextes cliniques et sociaux et avait le potentiel d’un « développement secondaire » en tant que médicament majeur, avec une valeur scientifique et économique significative ^9,10,11,12. Cependant, en raison du manque de recherches scientifiques systématiques et à long terme, les études sur le BTHTT ont généralement souffert d’une compréhension incertaine de sa base composante et de cibles d’action non identifiées. Fondamentalement, cela était dû à des lacunes importantes dans la recherche sur le mécanisme principal et la base thérapeutique potentielle de la BTHTT.

En réponse à cette caractéristique, en intégrant plusieurs technologies omiques telles que la métabolomique et la transcriptomique, ainsi que des méthodes d’extraction multi-algorithmes, en se concentrant sur les principales corrélations entre les gènes clés caractéristiques et les voies métaboliques clés dans le microenvironnement du corps 13,14,15 ne peut pas seulement explorer l’essence du traitement, mais aussi évaluer l’efficacité synergique des composants actifs. Une attention particulière est portée à l’axe hormonal thyroïdienne, car des recherches émergentes indiquent que le dysfonctionnement thyroïdien est une comorbidité fréquente dans la BPCO, souvent corrélée à une inflammation systémique accrue et à une altération de la fonction des muscles respiratoires. Moduler cet axe pourrait représenter une nouvelle voie pour restaurer l’homéostasie métabolique dans les maladies^{pulmonaires 16,17}.

En résumé, cette étude a adopté une approche en trois volets combinant l’intégration multi-omique avec la biologie computationnelle, fondée sur le postulat de la correspondance syndrome et formule. D’une part, elle utilisait des techniques de pharmacochimie sérique de la MTC pour identifier les composants transmissibles par le sang du BTHTT dans des conditions efficaces. En revanche, en se concentrant sur les gènes caractéristiques clés de la MPOC, elle a utilisé une métabolomique tissulaire complète pour découvrir des biomarqueurs de maladies à partir de petites molécules endogènes et construire une évaluation précise des effets globaux de la formule. Parallèlement, combinée à l’exploration multi-algorithme et à l’analyse d’identification transcriptomique, elle a identifié les principaux gènes caractéristiques régulés par BTHTT dans des conditions efficaces et a mené une analyse de corrélation entre les gènes caractéristiques clés et les voies métaboliques clés. La base potentielle de la substance thérapeutique a été examinée par l’amarrage moléculaire et l’analyse dynamique moléculaire.

Basée sur notre cadre multi-omique et le profil pharmacologique de la BTHTT, cette étude propose les prédictions testables suivantes. Modulation anti-inflammatoire : L’intervention BTHTT réduira significativement les marqueurs d’inflammation systémique et pulmonaire, notamment en normalisant l’axe d’expression IL-1β/IL-1R2 pour atténuer les lésions tissulaires. Restauration métabolique : Le BTHTT modifie les signaux dans la voie de synthèse de l’hormone thyroïdienne, conduisant à une correction mesurable des niveaux de T3/T4 et à une amélioration ultérieure de l’état métabolique du microenvironnement pulmonaire. Restauration métabolique : Le BTHTT modifie les signaux dans la voie de synthèse de l’hormone thyroïdienne, conduisant à une correction mesurable des niveaux de T3/T4 et à une amélioration ultérieure de l’état métabolique du microenvironnement pulmonaire.

Protocole

REMARQUE : Les réactifs et l’équipement utilisés dans cette étude sont listés dans le tableau des matériaux.

Acquisition et prétraitement des données cliniques

Pour étudier les signatures moléculaires de la MPOC, des ensembles de données transcriptomiques ont été extraits de la base de données Gene Expression Omnibus (GEO). Un total de cinq ensembles de données ont été sélectionnés : GSE11784, GSE12472, GSE16972, GSE38974 et GSE222965. Les données brutes et les fichiers d’annotation de la plateforme ont été téléchargés pour la cartographie sonde-gène. Lorsque plusieurs sondes ciblaient un seul gène, la valeur d’expression maximale était conservée. Les matrices d’expression génique résultantes (lignes comme gènes, colonnes comme échantillons) ont été fusionnées en un seul ensemble de données de découverte. Pour tenir compte des variations techniques entre différentes plateformes de microarrays et cohortes d’études, la correction par effet batch a été réalisée à l’aide de l’algorithme ComBat du package sva R. L’efficacité de la correction a été validée via des graphiques d’analyse des composantes principales (PCA). Après correction par lots, le jeu de données de découverte fusionné a été utilisé pour l’analyse différentielle. Des gènes différenciellement exprimés (DEG) entre patients atteints de MPOC et témoins sains ont été identifiés à l’aide du package limma. Les seuils de signification ont été fixés à |logFC| ≥ 1 et p ≤ 0,05.

Pour identifier les gènes caractéristiques les plus robustes, trois algorithmes indépendants d’apprentissage automatique ont été intégrés. Pour garantir la fiabilité des modèles et éviter les fuites de données, le processus de sélection des caractéristiques était imbriqué dans les boucles de validation croisée lorsque cela était applicable, et l’ensemble de données de découverte était strictement séparé des ensembles de validation indépendants. Le modèle LASSO était appliqué aux DEG en utilisant le package glmnet. Nous avons utilisé une validation croisée de 10 fois pour déterminer le paramètre de pénalité optimal. La valeur optimale du paramètre de pénalité correspondant à l’erreur minimale de validation croisée a été sélectionnée comme seuil pour identifier les gènes de caractéristiques centrales. La SVM a été utilisée pour classer les gènes selon leur pouvoir discriminatoire. Une stratégie de validation croisée à 10 fois a été mise en œuvre pour identifier le point d’erreur minimale de généralisation, déterminant ainsi le nombre optimal de gènes caractéristiques. Le package randomForest a été utilisé pour classer les DEG en fonction de leur Moyenne de Précision Inférieure et de leur indice de Gini. Les gènes ayant les scores d’importance les plus élevés ont été sélectionnés comme caractéristiques liées à la maladie.

L’intersection des caractéristiques identifiées par LASSO, SVM et randomForest a été prise pour définir les gènes caractéristiques centraux finaux. La performance diagnostique de ces gènes a été évaluée à l’aide d’une analyse de la courbe Receiver Operating Feature (ROC). L’Aire sous la courbe (AUC) et les intervalles de confiance (IC) à 95 % associés ont été calculés à l’aide du package pROC. Un gène était considéré comme ayant une valeur diagnostique élevée si l’AUC > 0,70. Enfin, les niveaux d’expression et la précision diagnostique de ces gènes ont été validés dans un ensemble de validation indépendant afin d’assurer la généralisabilité des résultats.

À l’aide de PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) et de la drugbank (https://go.drugbank.com/), un total de 12 profils spécifiques de médicaments ont été obtenus, tels que les LABA, LAMA, SABA, SAMA, propionate de fluticasone, budésonide, béclométhasone, fluticasone, salmétérol, umeclidinium, vilanterol, théophylline. Les cibles compilées ont été calibrées à l’aide de la base de données Uniprot (https://www.uniprot.org/), durant laquelle les gènes non humains ont été retirés, et les cibles doublées invalides supprimées pour obtenir des noms de gènes standardisés. En saisissant le mot-clé « maladie pulmonaire obstructive chronique », « BPCO » dans les bases de données GeneCards (https://www.genecards.org/), OMIM (https://www.omim.org/) et DisGENET (https://www.disgenet.org/), les cibles liées à la maladie ont été récupérées. Toutes les cibles des trois bases de données ont été consolidées dans un fichier Excel, les gènes en double ont été retirés, et les données ont été calibrées à l’aide de la base de données Uniprot pour obtenir les informations finales sur les gènes cibles de la maladie.

Développement de modèles d’apprentissage automatique

Un cadre d’apprentissage automatique multi-algorithmique a été construit en utilisant séquentiellement les paquets R glmnet, e1071 et randomForest. Plus précisément, la régression LASSO a été réalisée pour la réduction de dimensionnalité basée sur les pénalités, l’analyse Support Vector Machine (SVM) a été utilisée pour évaluer les erreurs de validation basées sur le regroupement d’échantillons, et la forêt aléatoire a été utilisée pour filtrer les caractéristiques selon les scores d’importance. Ce processus a permis de réaliser des visualisations diagnostiques correspondantes, incluant des courbes de validation croisée et des graphiques à bulles d’importance génique. Après la construction du modèle, une analyse du diagramme de Venn a été réalisée sur les ensembles de gènes identifiés par ces multiples algorithmes afin d’extraire les gènes de caractéristiques « d’intersection » qui se chevauchent, améliorant ainsi la fiabilité des biomarqueurs potentiels. La matrice d’expression de ces gènes d’intersection a ensuite été extraite pour visualiser les différences d’expression intergroupes via des graphiques de violon. Enfin, des courbes ROC ont été générées via des boucles itératives pour chaque gène afin de calculer l’Aire sous la Courbe (AUC), validant leur valeur diagnostique en tant que biomarqueurs candidats.

Induction par modèle animal

Le protocole expérimental a été approuvé par le Comité d’éthique animale de l’Université médicale du Guizhou (2303411) et respectait les directives ARRIVE ainsi que les règlements sur le bien-être animal. Un total de 72 rats mâles Sprague-Dawley (SD) de grade SPF (230 ± 20 g). Après une semaine d’hébergement adaptatif dans des conditions standard (25 ± 1 °C, 50 ± 5 % d’humidité, 12 heures de cycle lumière-obscurité), les rats ont été divisés aléatoirement en groupe témoin (groupe C) (n = 24) et groupe modèle (groupe M) (n = 48).

Le groupe M a été soumis à une modélisation à double facteur : exposition intermittente à la fumée de cigarette (9 semaines, 6 jours par semaine, 3 cigarettes de qualité recherche par jour réparties en 2 séances, 30 minutes par séance) et instillation intratrachéale de LPS (200 μg par instillation, une fois toutes les deux ^{semaines)18,19}. Le groupe C a reçu un volume équivalent de solution saline normale. Après modélisation réussie, les groupes ont été divisés aléatoirement en groupe M (n = 12), groupe BTHTT à haute dose (groupe H) (dose clinique élevée, 1×, n = 12), et groupe BTHTT à faible dose (groupe L) (faible dose clinique 1/2×, n = 12), avec une intervention gavage continue pendant 2 semaines. Les groupes C et M ont reçu de l’eau distillée de façon synchrone.

Le poids corporel et les paramètres d’activité spontanée étaient enregistrés chaque semaine. À la fin de la modélisation et du traitement, les tissus pulmonaires, le sérum, le sérum et le liquide de lavage bronchoalvéolaire (BALF) ont été prélevés. Les niveaux de marqueurs inflammatoires (c’est-à-dire TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8, OPN et MCP-1) ont été mesurés à l’aide d’ELISA selon les instructions du kit. Des analyses de pathologie tissulaire et multi-omiques ont également été réalisées.

Administration du traitement

Buti Huatan Tang (BTHTT) se compose de neuf herbes médicinales traditionnelles chinoises : Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. (Radix d’Astragali, 15 g), Pseudostellaria heterophylla (Miq.) Pax (Pseudostellariae Radix, 15 g), Cinnamomum cassia (L.), J. Presl (Cortex de Cinnamomi, 15 g), Angelica sinensis (Oliv.) Diels (Angelicae Sinensis Radix, 10 g), Salvia miltiorrhiza Bge. (Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma, 15 g), Perilla frutescens (L.) Britt. (Perillae Folium, 10 g), Raphanus sativus L. (Sperme de Raphani, 10 g), Lepidium apetalum Willd. (Descurainiae Semen, 10 g), et Mahonia fortunei (Lindl.) Fedde (Mahoniae Folium, 10 g). Les matières herbacées ont été trempées dans de l’eau à 10 fois leur poids combiné pendant 30 minutes, puis décoccées pendant 1 heure. La décoction était filtrée, puis le filtrat prélevé et divisé en trois portions égales pour une administration orale.

Selon les recommandations cliniques de sécurité et d’efficacité, la dose standard de BTHTT chez les adultes était de 1,57 g∙^kg-1∙^jour-1 selon les recommandations cliniques de médication. En considérant le facteur de conversion de dose chez les rats, qui indiquait que la dose standard chez le médicament était de 6,3× la dose standard chez l’humain, le groupe H correspondant pour les rats était fixé à 9,9 g∙kg-1∙jour-1, et le groupe L à la moitié de cette dose (4,95 g∙^kg-1∙^day-1). Étant donné que le volume concentré final de BTHTT était de 50 mL, le volume administré pour le groupe H chez les rats était d’environ 1,6 mL, et pour le groupe L, d’environ 0,8 mL. Le médicament était administré une fois par jour par voie orale.

Collection de tissus et BALF

Aux critères d’évaluation expérimentaux (semaine 9 et semaine 11), les rats ont été anesthésés par injection intrapéritonéale de pentobarbital sodique à 5 % (1 mL/100 g). Le sang était prélevé dans la veine porte, laissé reposer 30 minutes à température ambiante, puis centrifugé à 13 000 × g pendant 15 minutes à 4 °C. Le surnageant était stocké à -80 °C. Les tissus pulmonaires ont été rapidement congelés dans de l’azote liquide et stockés à -80 °C. Le BALF a été collecté par trois lavages consécutifs avec du PBS froid.

Analyse transcriptomique

L’ARN total a été extrait du tissu pulmonaire et contrôlé de qualité à l’aide de (A₂₆₀/A₂₈₀ > 1,8) (RIN ≥ 7,0). Des bibliothèques de séquençage d’ARN ont été construites : l’ARNm était enrichi en oligo(dT), fragmenté, et utilisé pour synthétiser de l’ADNc double brin, qui était ensuite ligagé aux oligonucléotides adaptateurs et amplifié par PCR. Les bibliothèques étaient quantifiées et vérifiées en qualité avant le séquençage. Incluant l’inspection de la distribution du contenu, l’analyse de la distribution de la densité FPKM de chaque échantillon, et l’analyse globale de la qualité de l’ARN-seq²⁰.

Les données brutes de transcriptomique générées par la plateforme de séquençage ont été traitées à l’aide de scripts Perl pour supprimer les séquences adaptatrices et les lectures de faible qualité (lectures avec Q ≤ 25 bases représentant > 60 % ou un taux N > 5 %). Des lectures claires ont été obtenues après ce processus de filtrage. Les lectures nettes ont été alignées sur le génome de référence à l’aide de HISAT2, et les niveaux d’expression génique ont été quantifiés pour calculer les valeurs FPKM. Une analyse différentielle de l’expression a été réalisée (avec des critères de dépistage de |log2FC| > 1 et p-adj < 0,05). L’annotation par facteurs de transcription était basée sur des bases de données Animal TFDB ou Pfam/DBD, correspondant aux identifiants de gènes et aux informations de domaine^{protéique 21}.

Une stratégie de cartographie génétique orthologue a été employée pour garantir la rigueur méthodologique de la validation inter-espèces. Cette stratégie consistait à extraire des orthologues chez des rats pour des gènes humains principaux (par exemple, SRPX2, IL-1R2, TFF3) à l’aide des bases de données NCBI HomoloGene et Ensembl BioMart. La sélection s’est limitée à des paires de gènes présentant une relation claire de cartographie « un-à-un » et une forte identité de séquences protéiques. Dans les cas où plusieurs candidats étaient présents, la préférence était donnée aux paires orthologues certifiées par le HGNC. Pour garantir une haute précision de détection, des amorces RT-qPCR spécifiques ont été conçues à partir des séquences d’ARNm des orthologues identifiés chez les rats. Les critères de validation étaient définis par la cohérence dans la direction de l’expression et la vérification fonctionnelle. Consistance dans la direction de l’expression : Dans un modèle de MPOC chez rats induit par la fumée, la RT-qPCR a montré que les tendances d’expression des gènes cibles dans le tissu pulmonaire de rat étaient parfaitement cohérentes avec celles observées dans les ensembles de données cliniques GEO humaines. Les gènes présentant la même polarité de changement entre espèces étaient considérés comme conservateurs que les biomarqueurs de maladies. Vérification pathologique : Une fois la cohérence de l’expression établie, une analyse de corrélation a été réalisée pour vérifier l’implication de ces gènes dans l’évolution pathologique de la MPOC.

Flux de travail métabolomique

Le tissu pulmonaire (20–50 mg) a été homogénéisé dans de l’eau prérefroidie en méthanol-acétonitrale (2:2:1, v/v) et sonicisé dans un bain de glace. L’homogénéate a été centrifugée à 13 000 × g pendant 20 minutes à 4 °C. Le surnageant a été concentré sous vide, rédissous dans de l’acétonitrile-eau (1:1, v/v), puis filtré à travers une membrane de 0,22 μm pour l’analyse^{LC-MS 22}.

La séparation chromatographique a été réalisée à l’aide d’une colonne UPLC à base d’amide (1,7 μm, 2,1 mm × 100 mm). La température de la colonne était maintenue à 25 °C. La phase mobile comprenait (A) de l’eau contenant 25 mM d’acétate d’ammonium et 25 mM d’ammoniac, et (B) d’acétonitrile. Le débit était réglé à 0,5 mL/min, et le volume d’injection était de 2 μL. Le programme d’élution du gradient était le suivant : 0–0,5 min, 95 % B ; 0,5–7 min, diminution linéaire de B de 95 % à 65 % ; 7–8 min, diminution linéaire de B de 65 % à 40 % ; 8–9 min, B maintenu à 40 % ; 9–9,1 min, augmentation linéaire de B de 40 % à 95 % ; 9,1–12 min, B est resté à 95 %. Pendant toute l’analyse, les échantillons ont été conservés à 4 °C dans l’autoéchantillonneur. Pour garantir la stabilité du système et la fiabilité des données expérimentales, les échantillons étaient analysés selon une séquence aléatoire, avec des échantillons de contrôle qualité (QC) entrecoupés dans la file d’attente. L’analyse par spectrométrie de masse a été réalisée à l’aide d’un système de chromatographie liquide ultra-haute performance (UHPLC) couplé à un spectromètre de masse. Les échantillons ont été ionisés par ionisation par électropulvérisation (ESI) en modes à ions positifs et négatifs. Les réglages de la source ESI et du MS étaient les suivants : gaz de nébuliseur (Gaz 1) réglé à 50, gaz auxiliaire (Gaz 2) à 2, température de la source d’ions à 350 °C, et tension de pulvérisation (ISVF) à 3 500 V en mode ion positif et 2 800 V en mode ion négatif. La plage de masse pour MS1 a été réglée de 70 à 1 200 Da, avec une résolution de 60 000 et un temps d’accumulation de balayage de 100 ms. Pour MS2, l’acquisition dépendante des données (DDA) avec énergie de collision par étapes a été utilisée. La plage de masse pour MS2 a également été réglée de 70 à 1 200 Da, avec une résolution de 60 000 et un temps d’accumulation de balayage de 100 ms. Le temps d’exclusion dynamique était fixé à 4 s.

Les données brutes de métabolomiques étaient converties au format mzXML puis traitées pour l’alignement des pics, la correction du temps de rétention et l’extraction de la zone de pic. Le flux de prétraitement des données comprenait les étapes suivantes : premièrement, les pics d’ions avec un taux manquant > 50 % ont été supprimés. Deuxièmement, les valeurs manquantes restantes ont été imputées à l’aide de l’algorithme KNN. Troisièmement, les caractéristiques métaboliques présentant un écart type relatif (RSD) >50 % ont été écartées. La qualité des données expérimentales a été évaluée à l’aide d’analyses en composantes principales (ACP) et de regroupement d’échantillons de contrôle qualité. Les analyses ultérieures comprenaient des statistiques univariées (par exemple, tests t), des statistiques multivariées (PLS-DA), un dépistage différentiel des métabolites (VIP > 1 et p < 0,05), ainsi que l’analyse d’enrichissement des voies KEGG (test hypergéométrique)^23,24.

Établissement de méthodes analytiques pour les composants in vivo et in vitro

Préparation des échantillons de BTHTT pour les tests in vitro : le BTHTT a été extrait par décoction dans l’eau (2 x 30 min), concentré à 1,1 à 1,2 g/mL, puis lyophilisé. Avant analyse, 600 μL de la solution en poudre lyophilisée ont été mélangés à 400 μL de méthanol, rédissous dans 40 % de méthanol, puis centrifugés pour collecter le surnageant.

Préparation des échantillons de BTHTT pour des tests in vivo : Le sérum a été déprotéinisé en mélangeant avec du méthanol (1:1) et en précipitant à −20 °C pendant 30 minutes, suivi d’une centrifugation pendant 20 minutes. Le surnageant a été séché sous vide puis redissous dans 40 % de méthanol pour obtenir l’échantillon final. Pour la préparation des échantillons de sérum à vide + BTHTT, une quantité appropriée de sérum à vide a été injectée avec le surnageant BTHTT in vitro , et les autres étapes ont été effectuées comme décrit.

Les échantillons étaient séparés à l’aide d’un système UHPLC équipé d’une colonne UPLC à phase inverse (2,1 mm × 100 mm, 1,8 μm). La température de la colonne était maintenue à 35 °C, et le débit était réglé à 0,3 mL/min. La phase mobile comprenait (A) 0,1 % d’acide formique dans l’eau et (B) 0,1 % d’acide formique dans l’acétoninitrile. L’élution en gradient a été réalisée comme indiqué dans le tableau 1.

Un spectromètre de masse a été utilisé pour l’acquisition des spectres MS1 et MS2. Le spectromètre de masse était couplé au système UHPLC et fonctionnait en modes ESI positif et négatif. Les paramètres ESI étaient les suivants : tension de pulvérisation 3 800 V (ESI+) / 3500 V (ESI-), pression de gaz de la gaine 45 arb, pression de gaz auxiliaire 20 arb, température du tube de transfert d’ions 320 °C, et température du vaporisateur 350 °C. Le mode de détection était réglé sur MS2 en balayage complet/dépendant des données (Full-MS/dd-MS2) avec des résolutions de 60 000 pour MS1 et 15 000 pour MS2. Les 10 ions MS1 les plus importants ont été sélectionnés pour la fragmentation MS/MS avec des énergies de collision normalisées par palier de 20, 40 et 60. La plage de masse pour MS1 a été fixée de 90 à 1 300 Da.

Pour l’analyse in vivo , incluant les échantillons de groupe blanc, les échantillons de groupe dosé et les échantillons de groupe blanc + BTHTT, 6 μL de chaque échantillon ont été injectés avec précision. Pour une analyse in vitro de la BTHTT, 2 μL de l’échantillon ont été injectés. Chaque lot d’échantillons blancs et du groupe dosé a été injecté une fois, tandis que les échantillons du groupe blanc + BTHTT ont été injectés en triple licat, et les échantillons BTHTT en quintuplicate.

Les données au format mzXML étaient traitées et les composés identifiés à partir d’une base de données locale de spectrométrie de masse TCM commerciale à haute résolution. Les critères d’identification étaient les suivants : une erreur de masse de <25 ppm pour MS1 et un score de correspondance > 0,7 pour MS2 (où le score reflétait la similarité des ions fragments, ≥0,7 étant un seuil fiable)^25,26. L’analyse statistique comprenait le comptage et la classification des composés (par exemple, flavonoïdes, alcaloïdes), réalisés conjointement avec les annotations de la base de données de spectrométrie^{de masse 27}.

Amarrage moléculaire et simulation MD

Pour étudier les modes de liaison potentiels entre les protéines caractéristiques identifiées et leurs ligands correspondants, un amarrage moléculaire in silico a été réalisé. Les structures tridimensionnelles des petites molécules ont été récupérées dans la base de données PubChem, et leurs configurations géométriques optimisées. Les structures cristallines des protéines cibles ont été obtenues à partir de la Banque de données protéiques (PDB) de la RCSB. À l’aide de PyMOL, des molécules d’eau et des hétératomes ont été retirés, et des ligands co-cristallisés ont été extraits pour définir les coordonnées du site actif. Des atomes d’hydrogène ont été ajoutés, et des charges de Gasteiger assignées à l’aide d’un logiciel. Des simulations d’amarrage ont été exécutées, générant 15 conformations indépendantes par exécution. La conformation avec la plus faible énergie de liaison a été sélectionnée pour une analyse plus approfondie. Pour caractériser rigoureusement les interactions non covalentes, les complexes récepteur-ligand ont été analysés à l’aide du profileur d’interaction protéine-ligand (PLIP). REMARQUE : Il est important de souligner que ces résultats d’amarrage fournissent un soutien structurel aux interactions moléculaires potentielles et servent de base à un affinement dynamique supplémentaire ; cependant, ils ne constituent pas une preuve autonome d’efficacité biologique.

Pour évaluer la stabilité et l’évolution conformationnelle des complexes protéine-ligand prédits dans des conditions physiologiquement pertinentes, des simulations de dynamique moléculaire ont été réalisées à l’aide du logiciel GROMACS. Les fichiers topologiques pour les protéines et les ligands ont été générés à partir du champ de force GROMOS96 43a1. Chaque complexe était positionné au centre d’une boîte dodécaédrique, en maintenant une distance minimale de 1,0 nm des bords de la boîte, et solvé à l’aide du modèle d’eau SPC. Pour garantir la neutralité électrique, des ions sodium ou chlorure étaient ajoutés au système selon les besoins. La minimisation d’énergie a été réalisée à l’aide de l’algorithme de descente la plus raide jusqu’à ce que la force maximale soit inférieure à 1 000,0 kJ^∙mol-1∙^nm-1. Le système a ensuite été équilibré en deux étapes : d’abord, un ensemble NVT a été utilisé pour chauffer le système à 300 K sur 100 ps à l’aide d’un thermostat à rescaling en V ; deuxièmement, un ensemble NPT a été utilisé pour stabiliser la pression à 1 bar sur 100 ps à l’aide d’un barostat de Parrinello-Rahman. Les simulations de production ont été réalisées pour une durée totale de 10 ns avec un laps de temps de 2 fs. Les interactions électrostatiques à longue portée étaient calculées selon la méthode Particle Mesh Ewald (PME), tandis que les interactions de van der Waals à courte portée et électrostatiques étaient gérées avec un rayon de coupure de 1,2 nm. Pour garantir la fiabilité des simulations, trois exécutions indépendantes ont été effectuées lorsque cela était possible. La stabilité des complexes a été évaluée quantitativement en calculant la déviation quadratique moyenne des racines (RMSD) et la fluctuation quadratique moyenne des racines (RMSF) des atomes de la colonne vertébrale protéique par rapport à la structure initiale. L’atteinte d’un plateau dans le profil RMSD a été utilisée comme critère principal pour l’équilibre du système et la stabilité structurelle.

Analyse statistique générale

Dans cette expérience, les calculs de groupe ont été réalisés à l’aide de tests t ou d’une analyse unidirectionnelle de la variance (ANOVA).

Résultats

Prédiction des gènes caractéristiques clés dans la MPOC

Après correction par effet batch des données cliniques provenant de plusieurs plateformes de microarray (Fichier supplémentaire 1–Figure supplémentaire S1), une analyse d’expression différentielle a été réalisée. 34 gènes candidats (32 à la hausse et 2 à la baisse) ont été identifiés, dont SRPX2, CLDN10 et TFF3 (Figu...

Discussion

La synthèse et le maintien des niveaux d’hormones thyroïdiennes sont significatifs pour les patients atteints de BPCO et vont bien au-delà de la simple fonction endocrinienne, influençant profondément la progression de la maladie, l’état nutritionnel, la fonction pulmonaire et le pronostic^global 31,32,33^. En particulier lors d’exacerbations aiguës, les patients atteints de BPCO présentaient souv...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Acétonitrile (de qualité chromatographique)	Merck, Allemagne	1499230-935
Bioanalyseur Agilent 4150	Agilent Technologies, États-Unis
Acétate d’ammonium	SIGMA, Allemagne	SRE0035-20230321
Angelica sinensis (Oliv). Diels (Angelicae Sinensis Radix),	Guizhou Shanhaitongjia Pharmaceutical Co., Ltd., Chine	20240807
Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. (Radix Astragali),   ;	Guizhou Shanhaitongjia Pharmaceutical Co., Ltd., Chine	20240601
ChemOffice		Logiciels de dessin de structure chimique et de modélisation moléculaire
Cinnamomum cassia (L.) J. Presl (Cortex de Cinnamomi),	Guizhou Shanhaitongjia Pharmaceutical Co., Ltd., Chine	20240901
Centrifugeuse Eppendorf 5430 R	Eppendorf, Allemagne
Cigarettes expérimentales	Harbin Taihua, Chine	20230208
GraphPad Prism 8		Logiciels d’analyse statistique et de graphiques
Cigarettes Huangshan		Expériences de cigarettes de qualité recherche pour exposition à la fumée
IL-1 & bêta ; Kit ELISA	Biotechnologie liée aux enzymes de Shanghai, Chine	E-EL-R0012c-20230522
Plateforme de séquençage Illumina Novaseq 6000	Illumina, USA
Lepidium apetalum Willd. (Descurainiae Semen)	Guizhou Shanhaitongjia Pharmaceutical Co., Ltd., Chine	20240201
Lepidium sativum L. (Sperme Raphani)	Guizhou Shanhaitongjia Pharmaceutical Co., Ltd., Chine	20240301
Lipopolysaccharide (LPS)	Shandong Huino Pharmaceutical, Chine	20230315
Mahonia fortunei (Lindl.) Fedde (Folium Mahoniae)	Guizhou Shanhaitongjia Pharmaceutical Co., Ltd., Chine	20240301
Méthanol (qualité chromatographique)	Fisher, États-Unis	DK745764
Spectrophotomètre Nanodrop ND-2000	Thermo Scientific, États-Unis
Perilla frutescens (L.) Britt. (Perillae Folium)	Guizhou Shanhaitongjia Pharmaceutical Co., Ltd., Chine	20240510
Pseudostellaria heterophylla (Miq.) Pax (Pseudostellariae Radix),	Guizhou Shanhaitongjia Pharmaceutical Co., Ltd., Chine	20250201
Fluoromètre Qubit 4.0	Thermo Fisher Scientific, États-Unis
Kit de construction de bibliothèque ARN	ABclonal, États-Unis	RK20301-20230415
SMINA		Logiciel d’amarrage moléculaire
Salvia miltiorrhiza Bge. (Salviae miltiorrhizae radix et rhizoma)	Guizhou Shanhaitongjia Pharmaceutical Co., Ltd., Chine	20240902
Enregistreur d’activité spontanée pour petits animaux (KW-ZF)	Nankin Karlvin Biotechnology, Chine
Pentobarbital sodique	Société d’approvisionnement expérimental de réactifs de Shanghai, Chine	20230412
TNF-& alpha ; Kit ELISA	Biotechnologie liée aux enzymes de Shanghai, Chine	E-EL-R2856c-20230522
Base de données de la SEP en médecine traditionnelle chinoise (Shanghai Applied Protein Technology Co., Ltd.)		Base de données spectrale de spectrométrie de masse de médecine traditionnelle chinoise commerciale
Réactif Trizol	Magen, Chine	20230508
Colonne amide BEH UPLC		colonne analytique UHPLC basée sur les amides
Colonne UPLC HSS T3		colonne analytique UHPLC à phase inversée (type T3)
Système Vanquish Neo UHPLC-Orbitrap Exploris 480 MS	Thermo Scientific, États-Unis
Vanquish système MS UHPLC-Q-Exactive HF-X	Thermo Scientific, États-Unis