Générer des cultures organoïdes tumorales à partir de la lignée cellulaire de l’adénocarcinome pulmonaire

Résumé

Ici, nous présentons une méthode rapide, pure et économique pour établir des organoïdes tumoraux à partir de la lignée cellulaire A549, adaptée aux tests préliminaires et à des fins éducatives.

Résumé

Ici, nous décrivons un protocole pour générer des organoïdes tumoraux dérivés de lignées cellulaires (CDTO) à partir de la lignée cellulaire d’adénocarcinome pulmonaire humain A549. Le protocole consiste à intégrer des cellules A549 2D étendues dans Matrigel et à les maintenir dans un milieu de culture 3D pour une culture à long terme. La densité d’ensemencement recommandée de 500 cellules/μL a été déterminée comme favorisant une formation d’organoïdes cohérente. Les CDTO résultants ont été caractérisés par une coloration par hématoxyline et éosine (H&E) ainsi que par immunofluorescence (IF). Les organoïdes ont maintenu une forte expression des marqueurs adénocarcinomes pulmonaires Thyroid Transcription Factor 1 (TTF-1), protéine d’adhésion E-Cadherine (ECAD) et protéine cytosquelettique Kératine 7 (KRT7). De plus, l’expression de la protéine à jonction serrée Zona Occludens 1 (ZO-1) a montré une polarité déréglée des organoïdes tumoraux. Ce protocole offre une plateforme organoïde strictement simple, rentable et purement tumorale pour la recherche sur l’adénocarcinome pulmonaire. Sa simplicité et sa reproductibilité le rendent également adapté à l’enseignement en laboratoire de premier cycle, où il peut aider les étudiants à acquérir des techniques fondamentales de culture d’organoïdes tumoraux 3D dans un calendrier de laboratoire limité.

Introduction

Les organoïdes sont in vitro. des structures tridimensionnelles auto-organisées (3D) issues de cellules souches et capables de récapituler dans une large mesure les complexités biologiques des organes^{réels 1}. Les cellules constituant des organoïdes peuvent provenir de cellules souches pluripotentes induites ou de cellules dérivées des tissus, ces dernières incluant des cellules souches/progénitrices normales, des cellules différenciées et des cellules^{tumorales 2}. Comparés aux systèmes traditionnels de culture bidimensionnelle et aux modèles animaux, les organoïdes peuvent imiter plus fidèlement les caractéristiques physiologiques du corps humain tout en offrant une plus grande flexibilité expérimentale. Par conséquent, la technologie organoïde a été largement appliquée dans le développement de médicaments³, la médecine^{personnalisée 4} et la modélisation des^{maladies 5}.

De nombreuses études ont établi des modèles organoïdes pour un large éventail de cancers, notamment le^{colorectal 6},^{la prostate 7}, le pancréas⁸,^{le gastrique 9}, l’hépatique¹⁰, le¹¹ binaire, le sein¹² et les tumeurs neuroendocriniennes. Cependant, l’un des principaux défis dans la recherche sur les organoïdes tumoraux réside dans le maintien de la pureté. Par exemple, une étude sur un cancer du poumon non à petites cellules a révélé que seulement 17 % des organoïdes établis étaient purement tumoraux, car les échantillons tumoraux contiennent souvent un mélange de cellules normales et malignes difficiles à séparer complètement avant la culture¹³. Ce problème d’impureté peut entraîner l’élimination des cellules tumorales par la croissance des cellules non tumorales, perturber la lecture des tests de susceptibilité aux médicaments, et conduire à des analyses moléculaires inexactes, telles que la RT-qPCR ou le Western blot, où les ARN et protéines des cellules tumorales sont dilués par des proportions incontrôlables de cellules contaminantes.

Pour répondre à cette problématique, les chercheurs ont exploré la conception de milieux de culture sélectifs exploitant la dépendance réduite des cellules tumorales à certains facteurs de croissance, inhibant ainsi la croissance normale des cellules tout en favorisant l’expansion des cellules^{tumorales 14}. De plus, des stratégies telles que le tri cellulaire ou l’identification monoclonale sont en cours de développement pour construire des organoïdes tumoraux purs.

Ce protocole décrit la génération d’organoïdes tumoraux dérivés de lignées cellulaires (CDTO) utilisant la lignée cellulaire d’adénocarcinome pulmonaire humain A549, qui a été rapportée comme présentant partiellement des propriétés similaires à celles des cellules souches cancéreuses, ainsi qu’une clonogénicité accrue, un potentiel prolifératif et une tumorigenité accrus in vitro.¹⁵. Les CDTO résultants ont maintenu l’expression des biomarqueurs spécifiques à la lignée Facteur de transcription thyroïdien 1 (TTF-1)¹⁶, la protéine d’adhésion E-Cadherine (ECAD⁾¹⁷, et la protéine cytosquelettique Kératine 7 (KRT7)¹⁶ , et présentaient des caractéristiques physiologiques caractéristiques des organoïdes tumoraux. Ce modèle est facile à établir et contient des composants cellulaires cancéreux définis, ce qui le rend adapté aux chercheurs débutants dans le domaine des organoïdes tumoraux ou à ceux confrontés à la perte d’identité tumorale dans les cultures organoïdes tumorales primaires. Les applications potentielles incluent des tests préliminaires de susceptibilité aux^{médicaments 18}, des études sur le microenvironnement^{tumoral 19}, et une formation éducative aux techniques de culture 3D.

Protocole

La température ambiante dans le laboratoire est de 22 à 24 °C et est appelée RT. L’utilisation d’une centrifugeuse à seau oscillant est recommandée. Les réactifs et l’équipement utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Établissement des organoïdes primaires A549

1. Préparation et prélèvement des cellules A549
   1. Préparez un plat de 6 cm contenant des cellules A549 à 70 % de confluence. Préchauffez le TrypLE et le PBS à 37 °C. Calculez la quantité de cellules et le volume de la Matrigel selon le plan expérimental et le tableau 1.
      1. Le dégel nécessitait des aliquotes Matrigel avec redondance pour au moins deux puits sur glace pendant au moins 60 minutes. Préparez des plaques traitées au polystyrène et au TC pour permettre aux dômes de rester hémisphériques.
      2. Préparez fraîchement un médium 2D (Médium Eagle’s Modified Dulbecco’s contenant 10 % de sérum bovin fœtal) et un médium 3D (médium organoïde pour adénocarcinome pulmonaire humain). Le support 3D peut être généré à partir de kits commerciaux ou, selon les travaux de Sachs, N. et al., du laboratoire²⁰ de Hans Clever.
         REMARQUE : Un plat de 6 cm peut généralement produire environ 5 000 000 de cellules après digestion. Réduire le nombre de cellules d’entrée pour le plan expérimental. Les plaques conçues pour l’imagerie confocale utilisant un fond en verre ne conviennent pas à Matrigel pour former une forme 3D correcte.
   2. Aspirez le milieu 2D usé et lavez les cellules une fois avec 1 mL de PBS pour éliminer le sérum résiduel. Aspirez PBS, ajoutez 1 mL de TrypLE préchauffé, et incubez la plaque à 37 °C pendant 4 minutes.
   3. Observez les cellules au microscope. Lorsque le cytoplasme se rétracte et que les cellules perdent des connexions intercellulaires, on ajoute un volume égal (1 mL) de nouveau milieu 2D pour mettre fin à la réaction enzymatique.
   4. Pipette doucement pour détacher et resuspendre les cellules adhérentes de la surface de la culture. Transférez la suspension de cellules dans des tubes centrifuge de 1,5 mL et centrifugez à 300 × g pendant 3 minutes en RT pour pelleter les cellules.
   5. Jetez le surnageant et resuspendez la pellete cellulaire dans un milieu 2D de 1 mL. Diluez la suspension de 10 μL à 100 μL et comptez le nombre de cellules avec un hémocytomètre. Calculez le volume requis selon l’étape 1.1.1 et aspirez dans un tube centrifugeuse de 1,5 mL avec des embouts pré-rincés.
2. Ensemencement des cellules récoltées en Matrigel
   1. Préparez de la glace et pré-refroidissez les embouts de pipette au réfrigérateur à -20 °C pendant 1 minute et utilisez des embouts à faible rétention si possible. Assurez-vous qu’aucun cristal ne reste dans les aliquotes de Matrigel et qu’aucune bulle ne se forme lorsque la pointe entre dans la solution.
   2. Centrifugez le tube contenant les cellules prélevées à 300 × g en RT et jetez le surnageant. Posez le tube sur de la glace. Utilisez des pointes de pipette prérefroidies pour aspirer lentement le volume requis de Matrigel et ajoutez-le au pellet sur glace. Resuspendez lentement en utilisant seulement la première butée de la pipette sur de la glace. Veuillez ne pas laisser de glace plus de 10 secondes si une observation est requise.
   3. Utilisez des pointes de pipette prérefroidies et gardez le mélange sur la glace. Distribuez une aliquote du mélange au centre de chaque puits. Retirez lentement la pipette pendant la distribution, en utilisant seulement le premier arrêt pour éviter la formation de bulles.
      REMARQUE : Le mélange doit former une structure 3D en forme de dôme au centre. Resuspendez le mélange avant de passer au puits suivant. Si possible, évitez d’utiliser les puits de bord et ajoutez du PBS à ces puits.
   4. Incubez la plaque à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO₂ pendant 40 minutes pour permettre la polymérisation en gel. Après la solidification du Matrigel, ajoutez soigneusement un milieu 3D le long de la paroi du puits, puis continuez la culture à 37 °C.
      REMARQUE : Évitez de former des bulles lors de la distribution. Si des bulles sont générées, évitez d’utiliser cette partie du mélange.
   5. Pendant la culture, remplacez le milieu 3D tous les 3 jours ou dès qu’un changement de couleur (du rose au jaune) est observé. Examinez la croissance organoïde au microscope inversé à chaque changement de milieu, et documentez la morphologie photographiquement pour surveiller le développement structurel.
      REMARQUE : Les organoïdes doivent être denses et complexes avec des diamètres supérieurs à 30 μm au lieu d’être désintégrés ou fragmentés comme indiqué par 5000 cellules/μL (Figure 1D).

2. Fixation, encastrement et coupe des organoïdes

1. Préparez les cultures organoïdes au jour 6 à 9. Retirez le milieu de culture de la plaque de culture cellulaire. Détachez doucement les organoïdes en pipettant avec 1 mL de PBS froid, puis transférez-les dans un tube de 1,5 mL préalablement rincé avec 5 % de BSA pour éviter l’adhérence. Laissez les organoïdes se déposer naturellement par gravité sur la glace et retirez soigneusement le surnageant.
2. Ajoutez 1 mL de PBS froid pour resuspendre le pellet. Laissez les organoïdes se déposer naturellement par gravité pendant au moins 5 minutes et retirez soigneusement le surnageant. Si certains organoïdes ne sédimentent pas, centrifugez brièvement à 200 × g pendant 1 minute à 4 °C pour les collecter. Cette étape sera effectuée plusieurs fois et sera appelée « small wash ».
3. Effectuez deux fois le petit lavage pour éliminer les résidus de Matrigel. Si le Matrigel résiduel persiste, ajoutez une concentration finale de 10 mM d’EDTA à la PBS froide pendant le lavage.
   ATTENTION : Transférez les échantillons dans la hotte à vapeur. Ajoutez 4 % de paraforméldéhyde (PFA) suffisant pour recouvrir les organoïdes, puis fixez sur de la glace pendant 1 heure dans une hotte à fumée. Jetez le fixateur et effectuez deux fois le petit lavage. Procédez à l’étape 4.1 pour la tache IF.
4. Après que les organoïdes se soient déposés au fond du tube, jetez le surnageant et préchauffez les échantillons dans un bain métallique à 70–75 °C pendant 5 minutes afin d’éviter une solidification rapide de l’agarose lors de l’étape 2.7.
5. Préparez 3 % (p/v) d’agarose dans 1× PBS, puis chauffez le mélange dans un bain-marie au micro-ondes jusqu’à ce qu’il soit complètement dissous et transparent. Évitez l’ébullition pour éviter la perte de volume ou les variations de concentration d’agarose.
6. Reposez rapidement les organoïdes fixes à 30–50 μL d’agarose à 3 %, assurant une répartition uniforme, puis refroidissez sur glace pendant 20 à 30 minutes jusqu’à solidification, évitant ainsi la formation de bulles.
7. Une fois le mélange d’agarose-organoïde solidifié, retirez soigneusement le bloc d’agarose du tube à l’aide d’une aiguille et transférez-le dans une cassette marquée pour l’incorporation.
8. Immergez séquentiellement la cassette contenant le bloc d’agarose dans des solutions d’éthanol classées (30 %, 50 %, 70 % [peut être stockée toute la nuit à 4 °C], 80 %, 90 %, 95 %, 100 % et 100 %) pour la déshydratation. Incubez chaque étape sur une plateforme de secouement à 20 tr/min pendant 30 minutes.
9. Pré-fondez les blocs de cire de paraffine au four avant utilisation à 65 °C. Transférez les organoïdes déshydratés incrustés dans l’agarose dans du xylène pour les clarifier. Immergez deux fois, chacune pendant 15 à 20 minutes, pour éliminer les résidus d’éthanol.
10. Transférez les cassettes de tissu séquentiellement dans le bain de paraffine 1 pendant 45 minutes, puis dans le bain de paraffine 2 pendant encore 45 minutes.
11. Placez les cassettes de tissu et les moules métalliques dans la chambre de paraffine en fusion de la station d’immersion. Retirez l’organoïde ou l’échantillon de tissu de la cassette et placez-le au centre du moule métallique. Placez le moule sur une plaque froide pour fixer l’orientation de l’échantillon.
12. Placez la cassette de tissu sur le moule métallique, remplissez-la de paraffine en fusion supplémentaire, puis laissez-la refroidir sur la plaque froide pendant au moins 60 minutes. Une fois le bloc de paraffine complètement solidifié, retirez le moule métallique et stockez le bloc organoïde incrusté de paraffine à 4 °C jusqu’à la coupe.
13. Sectionner les blocs organoïdes incrustés de paraffine à l’aide d’un microtome. Assurez-vous que l’épaisseur de chaque section est uniforme pour faciliter la coloration et l’imagerie ultérieures.
14. Laissez les sections découpées flotter dans un bain-marie maintenu à 40 °C pour permettre une expansion complète des rubans de paraffine. Assurez-vous que chaque section s’étale en une seule couche sans plis ; Jetez toutes les sections pliées ou qui se chevauchent.
15. Montez les sections dilatées sur des lames adhésives de microscope en immergeant la lame à un léger angle sous la section et en la soulevant verticalement pour capturer le tissu. Étiquetez les lames avec un crayon pour préserver l’identification de l’échantillon lors du traitement ultérieur.

3. Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E)

1. Faites cuire les lames contenant des tissus ou des sections organoïdaux dans un four à 60 °C pendant 1 à 2 heures pour assurer une bonne adhérence et éliminer la paraffine résiduelle.
2. Faites un dewax séquentiel sur les sections en les immergeant dans le xylène I pendant 15 minutes, le xylène II pendant 15 minutes, puis réhydratez dans une série d’éthanol graduée de 100 %, 100 %, 95 %, 90 %, 80 % et 70 %, chacune pendant 5 minutes. Ensuite, rincez les lames dans de l’eau double distillée (ddH₂O) deux fois, chacune pendant 5 minutes.
3. Colorez les sections d’hématoxyline pendant 5 minutes, rincez dans de l’eau du robinet courante pendant 1 à 2 minutes, puis différenciez dans de l’alcool acide à 1 % pendant 2 secondes. Lavez à nouveau dans de l’eau du robinet pendant 1 à 2 minutes, puis faites blanchir les noyaux dans de l’eau à 1 % d’ammoniac pendant 5 secondes, puis un dernier rinçage dans de l’eau du robinet pendant 1 à 2 minutes.
4. Déshydratez les sections à travers une série éthanolique graduée de 70 %, 80 %, 90 % et 95 % chacune pendant 3 minutes, puis contre-colorez avec de l’éosine dans une solution alcoolisée pendant 10 minutes.
5. Rincez les sections deux fois dans l’éthanol absolu, chacune pendant 5 minutes.
   REMARQUE : Pour l’éosine à base d’alcool, assurez-vous d’une déshydratation jusqu’à 95 % d’éthanol avant la coloration. Pour l’éosine soluble dans l’eau, effectuez une coloration avant la déshydratation.
6. Dégagez les sections en les immergeant deux fois dans le xylène, chacune pendant 5 minutes, et gardez-les dans le xylène jusqu’au montage.
7. Montez les lames immédiatement après le retrait du xylène à l’aide d’un support en résine neutre, en évitant soigneusement les bulles d’air.
8. Faites sécher à l’air les lames montées à la RT pendant 30 à 60 minutes, puis observez au microscope optique.
   REMARQUE : Le montage immédiat après le nettoyage du xylène empêche l’oxydation et assure une clarté optique.

4. Coloration immunofluorescente entière

1. Continuez à partir de l’étape 2.4. Ajouter 1 mL de solution de blocage et de perméabilisation (5 % BSA + 0,3 % Triton X-100) au pellet et incuber à la RT pendant 60 minutes ou à 4 °C en point d’arrêt pendant 1 à 2 jours.
2. Diluer les anticorps primaires et secondaires en suivant le ratio recommandé par le fabricant dans la solution de blocage et de perméabilisation. Un petit lavage une fois et ajoutez 200 μL d’anticorps primaires dilués au pellet. Incubez à 4 °C toute la nuit.
3. Effectuez le petit lavage 3 fois et ajoutez 200 μL d’anticorps secondaires dilués au comprimé. Incuber en RT pendant 60 minutes.
4. Ensuite, effectuez le petit lavage 3 fois. Ajoutez 15 μL de milieu de montage pour resuspendre la pellete et déposez le milieu contenant des organoïdes sur une lame en verre. Appliquez lentement une housse de couverture sur le médium et scellez la gaine avec du vernis à ongles. Ne pas comprimer manuellement le couvercle et ne laissez pas le support de montage s’étendre par tension superficielle.

Résultats

Le processus général de ce protocole inclut l’expansion des cellules A549 2D vers le stade exponentiel (Figure supplémentaire 1A) et le passage dans le Matrigel 3D pour former des organoïdes (Figure 1A). Lors de l’encapsulation dans Matrigel, les cellules se sont proliférées et auto-assemblées, formant principalement des organoïdes monoclonaux (Figure 1B). Sa morphologie dense et complexe était uniforme tout au long du passage (Figure su...

Discussion

Ce protocole décrit une méthode pour générer des organoïdes tumoraux dérivés de lignées cellulaires A549 pour l’adénocarcinome pulmonaire optimisé pour la simplicité technique, la reproductibilité et un usage éducatif. Trois paramètres déterminent de manière critique le succès : l’état cellulaire initial, la formulation du milieu et la composition de la matrice. De plus, la durée de la culture n’est pas recommandée de dépasser 14 jours. Voici les paramètres clés et le dépannage des probl...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1.5 mL Micro Centrifuge tube	Biofil	CFT003015
A549 [A-549]human non-small cell lung cancer cells	ZQXZbio	ZQ0003	STR: Amelogenin: X,Y; CSF1PO: 10,12; D13S317: 11; D16S539: 11,12; D5S818: 11; D7S820: 8,11; TH01: 8,9.3; TPOX: 8,11; vWA: 14. Mycoplasma was negetive when purchased was tested every 2 weeks. Passage number within 10 passages from the P1 aliquots of the purchased batch was used.
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634010
Anti-E Cadherin antibody	Abcam	ab231303
Anti-Fade Mounting Medium	YEASEN	36307ES08
Anti-HIF-1 alpha antibody	Abcam	ab51608
Biological Safety Cabinet	Nuaire LABGARD	NU-540
Biological Tissue Embedding Machine	KEDEE	KD-BM
BSA	Sigma	A1933
Cell-Grade BSA	Sigma	A1933-100G
Centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5702 R	Swing bucket; Mild to low speed.
Centrifuge tube	Biofil	CFT920150
Citrate Antigen Retrieval Solution (pH 6.0)	ZSGB-BIO	ZLI-9065
Cryostage	KEDEE	KD-BL
Cytation 5 Cell Imaging Multimode  Reader	Biotek	Cytation 5
Cytokeratin 7 (KRT7) Rabbit mAb	Abclonal	A4357
DMEM	Gibco	11965092
DMSO	Solarbio	D8371
Donkey Serum	Solarbio	SL050
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	11965118
Eclipse Ts2 Inverted Microscope	Nikon	Eclipse Ts2
Eosin Staining Solution (Alcohol-Soluble)	Servicebio	G1001
FBS	Nobimpex	B118-500
Forma Steri-Cycle i160 CO2 Incubator	Thermo Scientific	i60
Hematoxylin Bluing Solution	Servicebio	G1040
Hematoxylin Differentiation Solution	Servicebio	G1040
Hematoxylin Staining Solution	Servicebio	G1004
Hemocytometer	Solarbio	YA0810
Human Lung Adenocarcinoma Organoid Medium (3D medium)	PMO Bio	HC1001
Immunohistochemistry (IHC) Pen	ZSGB-BIO	ZLI-9305	Store in 4°C
Laser Confocal Microscope  FV3000	Olympus	FV3000	Usual parameter range: PMT Voltage: 500 ± 200 V; Laser Transmissivity: 5 ± 3%; Offset: 3 %
Manual Rotary Microtome	Leica	RM2235
Metal Bath	ALLSHENG	MK-3000
Microwave Oven	Galanz
Nail Polish	Lete
Neutral Balsam (Mounting Medium for Microscopy)	Beyotime	C0173
Organoid-Specific Extracellular Matrix Gel	PMO Bio	BM1001
PBS	WISENT	311-010-CL
Peroxidase Blocking Solution	Beyotime	P0100A
Pipettes	Eppendorf	312300063/312300020/312400083
Pipettes tips	Axygen	14-222-692/14-222-723/14-222-869	Consider using low retention tips if possible.
Three-Dimensional Shaker	SCILOGEX	SK-D3309-Pro	Low speed.
Tissue Flotation Water Bath	KEDEE	KD-P
Triton X-100	VWR	92046-34-9
Trypan Blue	Gibco	15250061
TryPLE	Gibco	12605028
TTF1 Recombinant Monoclonal Antibody	HUABIO	HA720067