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Article de méthode

Production rapide de ribonucléase humaine recombinante SLFN14 et analyse stœchiométrique par photométrie de masse

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DOI :

10.3791/70393

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20 février 2026

 ,  , 
1Department of Structural Biology, Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, University at Buffalo, SUNY, 2Verna and Marrs McLean Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, Baylor College of Medicine, 3Therapeutic Innovation Center (THINC), Baylor College of Medicine

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit la production de ribonucléase SLFN14 humaine recombinante et son analyse stœchiométrique par photométrie de masse.

Résumé

Les ribonucléases sont une classe spécialisée de protéines liant l’ARN qui catalysent la clivage de l’ARN et contribuent à divers processus biologiques, y compris la régulation des gènes. Néanmoins, la structure, la fonction et la régulation de nombreuses ribonucléases humaines restent peu caractérisées en raison des défis liés à la production de protéines recombinantes. Cette méthode décrit une approche efficace pour l’expression transitoire, la purification et l’analyse stœchiométrique de la ribonucléase de Schlafen 14 (SLFN14) humaine. SLFN14 marqué par drapeau recombinant a été exprimé dans des cellules de suspension HEK293 et isolé à l’aide d’un flux de travail rapide de purification en deux étapes comprenant une chromatographie d’affinité anti-Flag suivie d’une chromatographie d’exclusion de taille à faible résolution. La photométrie de masse, une technique sensible à molécule unique, a révélé qu’en conditions physiologiques de sel, SLFN14 forme un homodimère stable lié à l’ARN cellulaire, tandis qu’un taux élevé de sel favorise la dissociation de l’ARN tout en préservant l’arrangement homodimère. La protéine humaine recombinante SLFN14 résultante est adaptée aux études structurales en aval et aux tests biochimiques qualitatifs. Cette approche rapide pour l’isolement et la caractérisation des échantillons de protéines humaines recombinantes est largement applicable à la production d’autres ribonucléases de mammifères et de protéines liant l’ARN destinées à la caractérisation biophysique et biochimique.

Introduction

Schlafen 14 (SLFN14) est une ribonucléase peu étudiée et un facteur de restriction hôtechez les mammifères 1,2,3. La protéine SLFN14 humaine appartient à une famille de six régulateurs génétiques SLFN, jouant un rôle dans l’immunité, l’activité antivirale, la chimiosensibilité et la différenciationcellulaire 4,5,6,7,8. La compréhension mécaniste du rôle des régulateurs du gène SLFN reste incomplète ; Cependant, de nombreux membres présentent une activité de ribonucléase essentielle au contrôletranslationnel 7,9. Les ribonucléases SLFN sont activées lors de l’homodimérisation des protéines, formant une fente composite de liaison à l’ARN compétente dans le clivagedu substrat 10,11. Pour protéger les cellules contre la clivage spurie de l’ARN, la plupart des ribonucléases SLFN existent principalement sous forme de monomère et attendent leur activation par des signaux moléculaires spécifiques à chaque membrede la famille 5,7,11,12.

La production recombinante de SLFN14 chez l’humain a permis des études moléculaires approfondies de cette ribonucléase jusque-là peu étudiée, apportant de nouvelles perspectives sur sa fonction et sarégulation 2,13,14. La protéine SLFN14 recombinante purifiée a une caractérisation accélérée de son activité de clivage de transfert d’ARN dépendant de la structure à l’aide de tests in vitro 2,14. Les études de cryomicroscopie électronique (cryoEM) sur la protéine SLFN14 purifiée révèlent également une disposition homodimère SLFN14, où l’ARN duplexé se charge dans une fentecentrale 2,13,14. L’assemblage d’ordre supérieur de SLFN14 a été en plus caractérisé par la photométrie de masse, une technique à molécule unique pour mesurer la masse moléculaire. De manière inattendue, cette technique sensible démontre que SLFN14 forme principalement un homodimère résistant au sel, mais peut aussi former un homotétramère sensible au sel de fonctioninconnue 2,13,14. Collectivement, la capacité à obtenir la protéine humaine purifiée de SLFN14 a constitué une étape cruciale, permettant des premières découvertes moléculaires qui alimenteront sans aucun doute une nouvelle phase passionnante de recherche sur le contrôle translationnel médié par SLFN14.

La ribonucléase SLFN14 recombinante a historiquement été difficile à acquérir en utilisant des stratégies de production protéique standard. Le rapport initial décrivant l’activité enzymatique de SLFN14 notait son faible rendement, sa stabilité réduite et sa faiblesolubilité 1. La protéine SLFN14 humaine se caractérise par une longue chaîne polypeptidique, une hydrophobie prononcée et une cytotoxicité dépendante des ribonucléase, qui entravent largement l’utilisation des systèmes d’expression bactérienneconventionnels 1,13,14. Cependant, des machines sophistiquées de traduction eucaryote et de chaperonne offrent une alternative puissante qui produit efficacement la protéine SLFN14 humainepleine longueur 15. Les systèmes d’expression des baculovirus, insectes et mammifères ont été utilisés pour obtenir la protéine SLFN14 humaine de pleine longueur pour des études cryoEM et des testsbiochimiques 2,13,14. Cependant, dans certains cas, la protéine SLFN14 dérivée d’insectes nécessitait des mutations stabilisatrices pour éviter l’agrégation del’échantillon 2. La délivrance génique médiée par le baculovirus est également associée à un engagement important et à un long délai de préparation retardant les progrès de larecherche 15,16. En revanche, la protéine SLFN14 recombinante isolée d’un hôte d’expression mammifère offre l’avantage de la rapidité et évite le besoin d’ingénierie protéique dans l’optimisation des échantillons.

Cette méthode est conçue pour fournir une approche relativement rapide et à faible effort afin de produire une protéine SLFN14 sauvage recombinante adaptée aux études moléculaires en aval. L’utilisation de cellules de mammifères offre un environnement quasi naturel pour préserver un bon repliement des protéines sans nécessiter l’ingénierie des protéinesSLFN14 13. Une méthode de délivrance génétique basée sur des produits chimiques, contrairement à une stratégie de vecteur viral, accélère également le délai de production de plusieurs mois aujour 15. Pour contrebalancer le coût relativement élevé de la culture cellulaire de mammifères, cette méthode utilise le réactif de transfection en polyéthylenimine (PEI) rentable et les cellules embryonnaires humaines 293 (HEK293) économes en suspension17,18. Pour minimiser la perte de protéines lors du traitement des échantillons, cette procédure utilise également des stratégies à faible consommation d’échantillons pour la purification des protéines SLFN14 et l’analyse stœchiométrique pour le contrôle de la qualité des échantillons. Ce protocole de quatre jours fournit des détails précis sur la manière d’effectuer 1) l’expression génique transitoire dans les cellules HEK293, 2) un flux de travail chromatgraphique en deux étapes utilisant des colonnes de spin, et 3) la détermination de la stœchiométrie des protéines par photométrie de masse. Le produit final issu de cette procédure est une protéine humaine de type sauvage SLFN14 abritant une double marque Myc-Flag C-terminale (SLFN14Myc-Flag) pouvant être utilisée pour des études cryoEM en aval et une caractérisation biochimiquequalitative 13. Cette approche polyvalente peut être appliquée pour isoler et caractériser d’autres protéines de liaison à l’ARN humain peu étudiées, en particulier les grands gènes de ribonucléase cytotoxiques qui sont souvent difficiles à surexprimer dans les systèmes d’expression hétérologue. Par conséquent, ce protocole abaisse la barrière à une caractérisation moléculaire complète du protéome humain.

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Protocole

Les expériences impliquant une culture cellulaire HEK293 doivent être réalisées sous conditions de biosécurité de niveau 2 (BSL-2) conformément aux protocoles institutionnels de biosécurité approuvés.

1. Expression transitoire de SLFN14Myc-Flag dans les cellules de mammifères

  1. Des cellules de suspension HEK293 de mammifères graines à 0,5 x 106 cellules/mL dans un milieu de croissance préchauffé sans sérum pour un volume final de 320 mL dans une fiole ventilée de 1 L.
  2. Incubez les cellules à 37 °C, 125 tr/min, 8 % de CO2, 75-80 % d’humidité pendant 24 à 32 heures.
  3. Vérifiez que le nombre de cellules est de 1,2 à 1,8 x 106 cellules/mL et que la viabilité est supérieure à 90 % en utilisant la coloration bleue trypan et un compteur cellulaire19.
  4. Décantez 40 mL de culture en huit tubes coniques.
  5. Prélève les cellules par centrifugation à 400 x g pendant 5 minutes à 20-25 °C.
  6. Jetez le milieu de culture.
  7. Reposez doucement chaque pellet cellulaire dans 38 mL de milieu de transfection sans sérum préchauffé pour un volume final de 304 mL.
    REMARQUE : Les 16 mL restants du volume de culture original décrit à l’étape 1.1 seront fournis par le mélange de transfection décrit à l’étape 1.12.
  8. Transférez les cellules dans une nouvelle fiole ventilée de 1 L à déflecteurs.
  9. Dans un tube conique, ajoutez 320 μg d’ADN plasmidique purifié codant pour le gènerecombinant SLFN14 Myc-Flag à 8 mL de milieu de transfection sans sérum et incubez pendant 5 minutes à 20-25 °C.
    REMARQUE : La concentration plasmidique est typiquement de 500 ng/μL à un volume final de 640 μL.
  10. En même temps que l’étape 1.9, ajoutez 960 μg de PEI stérilisé filtré à 0,22 μm à 8 mL de milieu de transfection sans sérum et faites éclore pendant 5 minutes à 20-25 °C.
    REMARQUE : Le stock de travail est généralement de 1 mg/mL à un volume final de 960 μL.
  11. Ajoutez lentement le mélange PEI (voir étape 1.10) goutte par goutte à la solution d’ADN plasmidique recombinant (voir étape 1.9) et incubez 15 minutes à 20-25 °C.
  12. Ajoutez lentement 16 mL du mélange ADN/PEI goutte à goutte aux cellules préparées à l’étape 1.8.
  13. Incubez les cellules à 37 °C, 125 tr/min, 8 % de CO2, 75-80 % d’humidité pendant 48 heures.
  14. Découper 40 mL de cellules transfectées dans huit tubes coniques.
  15. Prélever les cellules transfectées par centrifugation à 400 x g pendant 5 minutes à 20-25 °C.
  16. Décantez le surnageant et stockez les huit granulés cellulaires à -80 °C.

2. Purification en deux étapes par recombinaison SLFN14Myc-Flag

  1. Chromatographie d’affinité anti-drapeau.
    Exécutez le protocole de chromatographie d’affinité anti-Flag en double, en utilisant quatre granulés cellulaires de l’étape 1.16 pour chaque préparation.
    1. Préparation à la résine.
      1. Équilibrez la résine d’agarose anti-Flag à 20-25 °C pendant 15 minutes.
      2. Résuspendez doucement la résine en inversant la bouteille juste avant de transférer 40 μL de boue de résine à 50 % dans un tube microcentrifuge de 2 mL.
        REMARQUE : Coupez l’extrémité de la pointe de la pipette pour récupérer facilement la suspension visqueuse.
      3. Resuspendez la résine dans 1 mL de tampon à haute teneur en sel (50 mM Tris pH 7,4, 600 mM NaCl, 5 mMMgCl 2, 0,5 mM β-ME, 0,1 % Tween-20).
      4. Couver pendant 45 minutes à 4 °C.
      5. Centrifugez la boue de résine à 8 000 x g pendant 2 minutes à 4 °C.
      6. Aspirez et jetez le tampon à haute teneur en sel tout en faisant attention à ne pas abîmer la résine.
    2. Clarification du lysat cellulaire.
      1. Resuspendez chaque pellet de cellule transfectée avec 225 μL de tampon de resuspension refroidi (50 mM de Tris pH 7,4, 600 mM de NaCl, 5 mM deMgCl 2, 0,5 mM β-ME, 0,5 % de Triton-X-100, 1 mM de PMSF, 5 μg/mL de Leupeptine, 1 mM de Benzamidine, 0,7 μg/mL de Pepstatine A, 0,25 U/mL de nucléase Genius) pour un volume total de 900 μL sur quatre granulés cellulaires.
      2. Transférer les cellules dans un tube microcentrifuge de 2 mL qui a été pré-refroidi sur glace.
      3. Incubez le tube de microcentrifuge horizontalement sur un nutator pendant 30 minutes à 4 °C.
        REMARQUE : Conservez une aliquote de 20 μL de lysat total à -20 °C pour le dépannage en cas de faibles niveaux d’expression protéique.
      4. Clarifiez le lysat cellulaire par centrifugation à 21 300 x g pendant 20 minutes à 4 °C.
    3. Capture d’affinité protéique et lavages.
      1. Combinez le lysat clarifié (voir étape 2.1.2.4) avec la résine anti-Flag équilibrée (voir étape 2.1.1.6).
      2. Incubez le mélange lysate-résine dans un tube microcentrifuge positionné horizontalement sur un nutator pendant 60 minutes à 4 °C.
      3. Centrifugez le mélange lysate-résine à 8 000 x g pendant 2 minutes à 4 °C pour former une pastille de résine.
      4. Jetez environ 700 μL de surnageant en faisant attention à ne pas perturber la pastille de résine.
        REMARQUE : Stockez une aliquote de surnageant de 20 μL à -20 °C après liaison de résine pour le dépannage en cas de faible efficacité de capture.
      5. On resuspend le mélange restant de résine surnageante et on transfère la solution dans une colonne de spin vide de 800 μL qui a été insérée dans un tube de microcentrifuge vide de 2 mL.
      6. Centrifugez la colonne de rotation à 1 000 x g pendant 2 minutes à 4 °C et jetez le flux direct.
      7. Rincez le tube vide de microcentrifuge de l’étape 2.1.3.5 avec 500 μL de tampon à haute teneur en sel et transférez la solution dans la colonne de spin.
        REMARQUE : Cette étape aide à récupérer toute résine résiduelle restante dans le tube de la microcentrifuge.
      8. Centrifugez la colonne de rotation à 1 000 x g pendant 2 minutes à 4 °C et jetez le flux direct.
      9. Ajoutez 500 μL de tampon à haute teneur en sel à la colonne de rotation. Centrifugez la colonne de rotation à 1 000 x g pendant 2 minutes à 4 °C et jetez le flux direct. Répétez cette étape pour un total de quatre lavages à haute teneur en sel.
      10. Ajoutez 500 μL de tampon de lavage à faible teneur en sel (50 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mMMgCl 2, 0,5 mM β-ME, 0,1 % Tween-20) à la colonne de spin. Centrifugez la colonne de rotation à 1 000 x g pendant 2 minutes à 4 °C et jetez le flux direct. Répétez cette étape pour un total de deux lavages à faible teneur en sel.
      11. Ajoutez 500 μL de tampon de lavage ATP (50 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mMMgCl 2, 0,5 mM β-ME, 0,1 % Tween-20, 10 mM ATP) à la colonne de spin. Bouchez le bas de la colonne de spin et incubez pendant 5 minutes à 4 °C. Débranchez la colonne de rotation et la centrifugeuse à 1 000 x g pendant 2 minutes à 4 °C et jetez le flux de flux continu. Répétez cette étape pour un total de quatre lavages ATP.
      12. Effectuez un lavage final en ajoutant 500 μL de tampon de lavage à faible teneur en sel à la colonne de rotation. Centrifugez la colonne de rotation à 1 000 x g pendant 2 minutes à 4 °C et jetez le flux direct.
    4. Élution des protéines par 3xFlag Peptide.
      1. Épongez le bas de la colonne de spin avec un essuie à faible teneur pour éliminer l’excès de liquide et bouchez le bas de la colonne de spin.
      2. Ajoutez 55 μL de tampon 3xFlag Elution (50 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mMMgCl 2, 0,5 mM β-ME, 0,1 % Tween-20, 300 μg/mL 3xFlag peptide) directement sur la résine.
      3. Scellez l’ouverture de la colonne de rotation avec un parafilm et placez la colonne dans un tube microcentrifuge de 1,7 mL.
      4. Incubez la colonne de rotation verticalement sur un nutator pendant 60 minutes à 4 °C.
        REMARQUE : Pour maintenir la colonne de rotation verticale, montez un support de tubes pour microcentrifuge sur le nutator avec des élastiques.
      5. Retirez le parafilm et le bouchon de colonne de rotation. Collectez la protéineMyc-Flag SLFN14 recombinante élue dans un tube microcentrifuge propre de 1,7 mL par centrifugation à 1 000 x g pendant 2 minutes à 4 °C.
      6. Conserver 50 μL d’éluate de résine anti-Flag pour la chromatographie d’exclusion de taille ultérieure et 5 μL pour l’analyse SDS-PAGE.
  2. Chromatographie par exclusion de taille.
    Effectuer le protocole de chromatographie d’exclusion de taille en utilisant un tampon de dessalage à faible teneur en sel (150 mM NaCl) pour l’analyse standard des protéinesMyc-Flag SLFN14 ou un tampon de dessalement à haute teneur en sel (500 mM NaCl) pour la caractérisation apo SLFN14Myc-Flag .
    1. Combinez deux éluats de résine anti-Flag de 50 μL de l’étape 2.1.4.6 pour un total d’échantillon de 100 μL.
    2. Préparez une colonne de dessalage par spin de 0,5 mL avec une coupure de masse moléculaire de 40 kDa en desserrant le bouchon, en retirant la fermeture inférieure et en insérant la colonne dans un tube microcentrifuge de 2 mL.
    3. Centrifugez la colonne de désalage à 700 x g pendant 1 minute à 4 °C pour retirer la solution de stockage de la colonne. Abandonnez le flux direct.
    4. Ajoutez 300 μL de tampon de dessalage à faible ou haute teneur en sel (20 mM de pH Tris 7,4, 150/500 mM de NaCl, 1 mM deMgCl 2, 1 mM de TCEP) à la colonne de désalage de spin. Centrifugez la colonne de centrifugation à 700 x g pendant 1 à 2 minutes à 4 °C et supprimez le flux de circulation. Effectuez cette étape trois fois pour équilibrer complètement la colonne.
    5. Épongez le bas de la colonne de désalage avec une lingette à faible tendresse.
    6. Transférez la colonne de désalage de spin dans un tube propre de microcentrifuge de 1,7 mL.
    7. Ajoutez 100 μL d’éluate combiné de résine anti-Flag (voir étape 2.2.1) au centre du lit de colonne sans perturber la résine.
    8. Éluez la protéineMyc-Flag recombinante SLFN14 en centrifugant la colonne de désalage de spin à 700 x g pendant 2 minutes à 4 °C.
    9. Conserver 95 μL de protéine recombinante récupérée pour la caractérisation moléculaire et 5 μL pour l’analyse SDS-PAGE.
  3. Caractériser l’échantillon de protéinemyc-flag de SLFN14 recombinant purifié.
    1. Effectuer une électrophorèse en gel de polyacrylamide de sodium dodécylsulfate (SDS-PAGE).
      1. Combinez 5 μL de 2x tampon d’échantillon de Laemmli avec 5 μL d’aliquotes d’échantillon collectés à des stades distincts selon le protocole de purification.
      2. Chauffez à 95 °C pendant 5 minutes.
      3. Résoudre une échelle protéique large avec 10 μL de mélange tampon échantillon-Laemmli par 4-15 % de SDS-PAGE à 200V pendant 30 minutes.
      4. Visualisez les bandes protéiques en colorant le gel avec la solution de coloration Coomassie G-250 pendant 30 minutes sur un shaker orbital, puis en retirant le gel avec de l’eau déionisée sur un shaker orbital jusqu’à ce que le fond soit clair.
      5. Inspectez les bandes protéiques obtenues pour vous assurer que l’échantillon récupéré de l’étape 2.2.9 correspond à une bande protéique unique correspondant aupoids moléculaire théorique Myc-Flag de SLFN14 de 107,5 kilodalton (kDa).
    2. Quantifier les protéines et les acides nucléiques par spectrophotométrie UV/vis.
      1. Blanchissez un spectrophotomètre microvolume avec 2 μL de tampon de dessalage à faible ou haute teneur en sel, correspondant au tampon de stockage des protéines.
      2. Mesurez l’absorbance à 260 nm et 280 nm à partir de 2 μL de protéineMyc-Flag recombinante SLFN14 récupérée (voir étape 2.2.9) à l’aide d’un spectrophotomètre microvolume.
      3. Calculez la concentration de protéinesMyc-Flag de SLFN14 recombinant en utilisant l’absorption enregistrée à 280 nm et son coefficient d’extinction (93330 M-1 cm-1) en utilisant la loide Beer-Lambert 20.
      4. Calculez le rapport d’absorbance de l’échantillon A260/280 en divisant la valeur d’absorbance enregistrée à 260 nm par la valeur d’absorbance mesurée à 280 nm afin de déterminer si l’acide nucléique co-purifie avec la protéineMyc-Flag recombinante SLFN14.
        REMARQUE : Un rapport A260/280 supérieur à 0,7 indique probablement la présence d’acidenucléique 21.
    3. Quantifier l’ARN cellulaire par fluorométrie.
      1. Quantifiez la teneur en ARN en utilisant 1 à 3 μL de protéine recombinante récupérée de l’étape 2.2.9 à l’aide d’un colorant fluorescentspécifique à l’ARN à haute sensibilité 22.

3. Analyse de la masse moléculairede la Myc-Flag de SLFN14 par photométrie de masse

  1. Installation d’instruments du photomètre de masse.
    1. Allumez le laser à l’aide de l’interrupteur situé à l’arrière de la boîte électronique du photomètre de masse.
    2. Activez le plateau d’isolation et cliquez sur le bouton « isolation » pour minimiser les vibrations de l’instrument.
    3. Ouvre le logiciel AcquireMP.
    4. Attendre 1 heure que l’instrument atteigne l’équilibre thermique.
  2. Préparation de la diapositive de couverture.
    1. Tenez une coulisse en verre en position verticale à l’aide d’une pince à pince souple.
    2. Rincez les deux côtés de la lame du couvercle en verre avec de l’eau ultrapure de type I suivie d’alcool isopropylique. Répétez cette étape un total de trois fois.
    3. Rincez chaque côté de la lame du couvercle en verre une dernière fois avec de l’eau ultrapure de type I pendant 45 secondes.
    4. Retirez doucement les gouttelettes d’eau excédentaires de la couvercle en verre par aspiration à l’aide d’une pointe de pipette propre reliée à une conduite sous vide.
    5. Stockez la lame de couvercle en verre propre dans une boîte en plastique doublée de papier d’objectif pour la transporter jusqu’au photomètre de masse.
  3. Montez la coulisse du couvercle sur l’instrument.
    1. Placez un joint en silicium à 6 trous sur l’outil d’alignement métallique à l’aide d’une pince à pointe souple.
    2. Placez la glissière propre du couvercle en verre de l’étape 3.2.5 sur le joint en silicone et utilisez la pince à pince à pointe souple pour appuyer légèrement autour du joint en silicone.
      REMARQUE : N’appliquez pas de pression sur les puits d’échantillonnage.
    3. Placez une goutte d’huile d’immersion sur l’oculus du photomètre à masse.
    4. Retournez la glissière du couvercle en verre pour que le joint en silicone soit orienté vers le haut et placez doucement la glissière du couvercle sur l’oculus à l’aide d’une pince à pointe souple.
    5. Fixez les coins supérieur gauche et inférieur droit de la glissière du couvercle en verre à l’aide d’aimants.
    6. Sous contrôle latéral, sélectionnez le puits en haut à gauche sur le logiciel AcquireMP pour aligner le laser avec le centre du puits.
  4. Analysez les normes protéiques à grande échelle.
    1. Préparez une solution calibrant 50x large plage (90 kDa pour 1 MDa) en diluant 1 μL d’une crosse calibrant 500x en 9 μL 1x solution saline tamponnée phosphate.
    2. Préparez un stock de travail calibrant 5x en combinant 2 μL de la solution calibrant à large plage 50x de l’étape 3.4.1 dans 18 μL 1x solution saline tamponnée phosphate.
    3. Ajoutez 10 μL de tampon de dessalage à faible ou haute teneur en sel filtré de 0,22 μm dans le puits vide.
      REMARQUE : Il est important de faire correspondre le tampon filtré à cette étape avec le tampon utilisé pour préparer l’échantillonMyc-Flag SLFN14 à l’étape 2.2.9.
    4. Ferme le couvercle.
    5. Dans la section Recherche de focus, cliquez sur « dilution de gouttelettes » dans le logiciel AcquireMP pour déterminer la bonne mise au point du puits d’échantillon.
    6. Ajoutez 10 μL de la pièce de travail calibrant 5x à la gouttelette tampon (voir étape 3.4.3) et pipettez doucement de haut en bas pour mélanger la solution.
    7. Ferme le couvercle.
    8. Examinez les réglages de l’instrument pour confirmer que les valeurs de mouvement, de signal, de saturation et de netteté sont stables et optimales.
      REMARQUE : Les valeurs optimales apparaîtront en bleu, et les valeurs aberrantes sont colorées en orange.
    9. Cliquez sur « enregistrer » dans le logiciel AcquireMP pour enregistrer une vidéo de 60 secondes.
    10. Enregistrez le fichier de résultats (.mpr) avec un titre descriptif et une heure.
  5. Créez une courbe d’étalonnage.
    1. Ouvre le logiciel DiscoverMP.
    2. Dans la section Mesures, cliquez sur le bouton « + ouvrir » et allez au fichier de résultats du calibrant à partir de l’étape 3.4.10.
    3. Double-cliquez sur le fichier des standards protéiques listés pour voir les résultats.
    4. En configuration de plot, ajustez les frontières de contraste à 0,00000 et -0,03000, respectivement.
    5. Définissez manuellement une courbe gaussienne pour les quatre premiers pics standards protéiques en faisant glisser le curseur sur chaque pic individuel.
    6. Cliquez sur « Créer » et sélectionnez « calibration de masse ».
    7. Sous l’en-tête calibrant, attribuez chaque pic de calibrant adapté de l’étape 3.5.5 à sa masse moléculaire connue de 86, 172, 258 et 344 kDa, respectivement.
    8. Vérifiez que la courbe d’étalonnage a unR2 proche de 1,0 et une erreur de masse maximale (MME) inférieure à 2 %.
    9. Cliquez sur « confirmer étalonnage » et enregistrez le fichier de la courbe d’étalonnage (.mc).
      REMARQUE : Le photomètre de masse doit être recalibré toutes les heures.
  6. Analysez la protéinemyc-flag recombinante SLFN14 dans des conditions pauvres et riches en sel.
    1. Préparer une solution de 50 μL de protéineMyc-Flag SLFN14 recombinante de 50 nM (voir étape 2.2.9) à l’aide d’un tampon de dessalage à faible teneur en sel pour l’analyse standard de l’échantillon dans des conditions physiologiques de sel, ou un tampon de dessalage à haute teneur en sel pour la caractérisation de l’échantillon de protéine apo.
    2. Centrifugez le mélange protéique recombinant SLFN14Myc-Flag de 50 nM à 21 300 x g pendant 10 minutes à 20-25 °C pour éliminer les agrégats protéiques potentiels et la poussière.
    3. Sous contrôle latéral, cliquez sur « puits suivant » dans le logiciel AcquireMP.
    4. Chargez 10 μL de tampon de dessalage à faible ou haute teneur en sel filtré de 0,22 μm dans le puits et fermez le couvercle.
      REMARQUE : Il est important de faire correspondre le tampon filtré à cette étape avec le tampon utilisé pour préparer la dilution de l’échantillonMyc-Flag SLFN14 à l’étape 3.6.1.
    5. Dans la section Trouver le focus, cliquez sur « dilution de gouttelettes » pour déterminer la bonne mise au point du nouveau puits d’échantillon.
    6. Chargez 10 μL de la solution protéiqueMyc-Flag SLFN14 recombinante de 50 nM à partir de l’étape 3.6.2 vers la gouttelette tampon et pipetez doucement pour mélanger l’échantillon.
    7. Fermez le couvercle et assurez-vous de réglages optimaux de l’instrument comme décrit à l’étape 3.4.8.
    8. Cliquez sur « enregistrer » dans le logiciel AcquireMP pour enregistrer une vidéo de 60 secondes.
      REMARQUE : La résolution de masse optimale est obtenue à partir d’une vidéo de 60 secondes avec environ 1 000 à 4 000 décomptes au total.
    9. Enregistrez le fichier de résultats (.mpr) avec un titre descriptif et une heure.
  7. Calculez la masse moléculaire et la stœchiométrie de la protéineMyc-Flag recombinante SLFN14.
    1. Dans la section mesures dans le logiciel DiscoverMP, cliquez sur le bouton « + ouvrir » pour sélectionner le fichier de résultat de l’étape 3.6.9.
    2. Sous calibrations, double-cliquez sur le fichier de la courbe d’étalonnage créé à l’étape 3.5.9 pour appliquer l’étalonnage.
    3. Définissez manuellement une courbe gaussienne pour chaque espèce observée de SLFN14Myc-Flag en faisant glisser le curseur sur chaque pic pour obtenir une valeur de masse moléculaire calculée.
    4. Calculez la masse moléculaire moyenne de chaque espèce oligomérique à partir de trois mesures indépendantes, ainsi que son écart-type correspondant.
    5. Déterminez la stœchiométrie de la protéineMyc-Flag SLFN14 recombinante en évaluant la masse moléculaire moyenne calculée avec des entiers de la valeur massique théorique du protomèreMyc-Flag SLFN14.
      REMARQUE : La masse théorique d’un monomèreMyc-Flag de SLFN14 est de 107,5 kDa, d’un dimère de 215 kDa, d’un trimer de 322,5 kDa, et d’un tétramère de 430 kDa.

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Résultats

Un vecteur mammifère conçu pour l’expression transitoire des gènes de la protéineMyc-Flag humaine recombinante SLFN14 de pleine longueur est illustré à la Figure 1. Un flux de travail de purification en deux étapes illustre l’isolement de la protéineMyc-Flag de SLFN14 à partir des cellules HEK293 (Figure 2A). Un gel dénaturant représentatif réussi de la protéineMyc-Flag purifiée de SLFN14 est mon...

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Discussion

Plusieurs étapes cruciales soulignent la performance et la polyvalence de ce protocole de production protéique. Pour maximiser le rendement des protéines recombinantes, nous utilisons des cellules HEK293 qui ont une forte absorption de l’ADN plasmidique étranger et peuvent être cultivées en suspension pour maximiser la densité cellulaire dans tout le volume23 du milieu. Le réactif de transfection PEI est utilisé dans ce protocole de délivrance de transgènes à gran...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions les membres du laboratoire Pillon pour leur lecture critique de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par le programme de recherche extramurale du National Institute of Health des États-Unis, ainsi que par le National Institute of General Medical Sciences (NIGMS ; R35GM147123 au M.C.P.) attribué au Baylor College of Medicine et transféré à l’Université d’État de New York à Buffalo.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
2-mercaptoéthanol (b-Me)SigmaM3148-500ML14,3 M solutions tock
AcquireMP 2024 R2Refeyn/Logiciels d’acquisition de données
Adénosine-5'-triphosphate sel disodique trihydrate (ATP)Chem-Impex International00015-100Gajuster la solution à pH 7,0
Gel d’affinité anti-drapeau M2MilliporeA2220Résine d’affinité anti-drapeau
Hydrate d’hydrochlorure de benzamidineSigmaB6506-25GInhibiteur de la protéase
Normes protéiques à large plage (10-250 kDa)Bio-RadP7719SÉtalons de protéines prêtes
Comtesse 3InvitrogenA49862compteur de cellules automatisé
DiscoverMP v2024 R2Refeyn/Logiciel d’analyse de données
Le sérum tamponné phosphate de DulbeccoCorning21-031-CVCrosse solution 1x
Peptide DYKDDDDKThermo Fisher ScientificA36805Peptide 3xFlag
Cellules FreeStyle 293-FThermo Fisher ScientificR79007Cellules en suspension de mammifères
Nucléase Geniust M DMF déposéeSanta Cruzsc-391121BNucléase universelle
HyClone CDM4HEK293 médiasCytivaSH3085802Milieu de croissance sans sérum
Médias HyClone SFM4Transfx-293CytivaSH3086002Milieu de transfection transitoire
Immersol 518FZeiss4Y00-R0DY-1007-3BF3Huile d’immersion
Alcool isopropyliqueMacron Fine Chemicals3032-02
Tampon d’échantillons de LaemmliBio-Rad1610737Crosse de solution 2x
LeupeptinVWRJ580-25MGInhibiteur de la protéase
Chlorure de magnésium hexahydraté (MgCl2)Fisher ScientificM33-500
MassFerence P1  ;RefeynMP-CON-41033Crosse calibrant 500x
Kit de préparation d’échantillons UC MassGlassRefeynMP-CON-21022Culasse et joint
Colonne micro-bio-spinBio-Rad7326204Colonne de spin en polypropylène vide
Système Milli-Q IQ 7000MilliporeZIQ7000T0CEau ultrapure de type I
Mini-Protean TGX gélifiés sans colorationBio-Rad45680864-15 % SDS-PAGE
Minitron avec humidité, refroidissement et CO2Infors72175Vibrateur à incubateur
Kit d’alignement MPRefeynMP-CON-21019outil d’alignement, pince à pince à pointe souple, aimant
NanophotomètreImplémentNP80Spectrophotomètre UV-vis
NutatorMarque Clay Adams421105
Pepstatine ASanta CruzSC-45036BInhibiteur de la protéase
Fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF)Produits de recherche InternationalP20270-25.0Inhibiteur de la protéase
Flasque de shake en polycarbonate   ;Duran Wheaton KimbleWPFBC1000SFlasque de base ventilée et déflectrice
Polyéthyléniine (PEI) MW 40 000Polysciences24765Réactif de transfection
Fluoromètre Qubit 4Thermo Fisher ScientificQ33226
Kit de test à haute sensibilité à ARN de qubitsThermo Fisher ScientificQ32852quantification à l’aide d’un colorant spécifique à l’ARN
SimplyBlue SafeStainThermo Fisher ScientificLC6065Coomassie G-250
ADN plasmidique d’expression de SLFN14OrigeneRC226257clone ORF marqué par humain
Chlorure de sodium (NaCl)Millipore1.37017
Tris, pH 7,4Thermo Fisher ScientificJ60202. K2Stock de solution tampon 1 M
Tris (2-carboxyéthyle) chlorhydrate de phosphine (TCEP)Biotechnologie de l’orTCEP10TCEP
Triton X-100VWRM143-1LDétergent
Teinture bleue de TrypanThermo Fisher ScientificT102820,4 % d’actions de solutions
Préadolescent 20VWR0777-1LDétergent
TwoMPRefeynMP-PRO-00001Photomètre de masse
Colonne Zeba 40K DesaltinThermo Fisher ScientificA57759Chromatographie d’exclusion de taille

Références

  1. Pisareva, V. P., Muslimov, I. A., Tcherepanov, A., Pisarev, A. V. Characterization of novel ribosome-associated endoribonuclease slfn14 from rabbit reticulocytes. Biochemistry. 54 (21), 3286-3301 (2015).
  2. Li, M., et al. Human schlafen 14 cleavage of short double-stranded rnas underpins its antiviral activity. Adv Sci (Weinh). 12 (37), e01727(2025).
  3. Seong, R. K., et al. Schlafen 14 (slfn14) is a novel antiviral factor involved in the control of viral replication. Immunobiology. 222 (11), 979-988 (2017).
  4. Jo, U., Pommier, Y. Structural, molecular, and functional insights into schlafen proteins. Exp Mol Med. 54 (6), 730-738 (2022).
  5. Lee, S., et al. Velcrin-induced selective cleavage of trna(leu)(taa) by slfn12 causes cancer cell death. Nat Chem Biol. 19 (3), 301-310 (2023).
  6. Murai, J., Thomas, A., Miettinen, M., Pommier, Y. Schlafen 11 (slfn11), a restriction factor for replicative stress induced by DNA-targeting anti-cancer therapies. Pharmacol Ther. 201, 94-102 (2019).
  7. Zhang, P., et al. Schlafen 11 triggers innate immune responses through its ribonuclease activity upon detection of single-stranded DNA. Sci Immunol. 9 (96), eadj5465(2024).
  8. Li, M., et al. Codon-usage-based inhibition of hiv protein synthesis by human schlafen 11. Nature. 491 (7422), 125-128 (2012).
  9. Valenzuela, C., Saucedo, S., Llano, M. Schlafen14 impairs hiv-1 expression in a codon usage-dependent manner. Viruses. 16 (4), (2024).
  10. Metzner, F. J., et al. Mechanistic understanding of human slfn11. Nat Commun. 13 (1), 5464(2022).
  11. Garvie, C. W., et al. Structure of pde3a-slfn12 complex reveals requirements for activation of slfn12 rnase. Nat Commun. 12 (1), 4375(2021).
  12. Kugler, M., Metzner, F. J., Witte, G., Hopfner, K. P., Lammens, K. Phosphorylation-mediated conformational change regulates human slfn11. Nat Commun. 15 (1), 10500(2024).
  13. Van Riper, J., et al. Cryoem structure of the slfn14 endoribonuclease reveals insight into rna binding and cleavage. Nat Commun. 16 (1), 5848(2025).
  14. Luo, M., et al. Structural and functional characterization of human slfn14. Nucleic Acids Res. 53 (10), (2025).
  15. Schellenberg, M. J., Maheshwari, S., Pillon, M. C. Encyclopedia of cell biology. Vol. 1, Elsevier. 57-73 (2022).
  16. Hutchinson, A., Seitova, A. Production of recombinant prmt proteins using the baculovirus expression vector system. J Vis Exp. (173), e62510(2021).
  17. Ojha, R., Timin, E., Szirovicza, L., Xu, W., Hepojoki, J. A systematic comparison of in-house prepared transfection reagents in the delivery of mrna or DNA to a wide range of cultured cells. J Biol Chem. 301 (12), 110742(2025).
  18. Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. High yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of hek293 cells in suspension. J Vis Exp. (106), e53568(2015).
  19. Piccinini, F., Tesei, A., Arienti, C., Bevilacqua, A. Cell counting and viability assessment of 2d and 3d cell cultures: Expected reliability of the trypan blue assay. Biol Proced Online. 19, 8(2017).
  20. Pace, C. N., Vajdos, F., Fee, L., Grimsley, G., Gray, T. How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein. Protein Sci. 4 (11), 2411-2423 (1995).
  21. Glasel, J. A. Validity of nucleic acid purities monitored by 260nm/280nm absorbance ratios. Biotechniques. 18 (1), 62-63 (1995).
  22. Li, X., Ben-Dov, I. Z., Mauro, M., Williams, Z. Lowering the quantification limit of the qubittm rna hs assay using rna spike-in. BMC Mol Biol. 16, 9(2015).
  23. Swiech, K., et al. Transient transfection of serum-free suspension hek 293 cell culture for efficient production of human rfviii. BMC Biotechnol. 11, 114(2011).
  24. Gu, J., et al. Correction: Advances in the structures, mechanisms and targeting of molecular chaperones. Signal Transduct Target Ther. 10 (1), 117(2025).
  25. Bernhard, H., et al. Structural basis of spliced leader rna recognition by the trypanosoma brucei cap-binding complex. Nat Commun. 16 (1), 685(2025).
  26. Lai, S. H., Tamara, S., Heck, A. J. R. Single-particle mass analysis of intact ribosomes by mass photometry and orbitrap-based charge detection mass spectrometry. iScience. 24 (11), 103211(2021).
  27. Liu, H., May, K. Disulfide bond structures of igg molecules: Structural variations, chemical modifications and possible impacts to stability and biological function. MAbs. 4 (1), 17-23 (2012).
  28. Marenchino, M., Armbruster, D. W., Hennig, M. Rapid and efficient purification of rna-binding proteins: Application to hiv-1 rev. Protein Expr Purif. 63 (2), 112-119 (2009).
  29. Smith, L. M., et al. The human proteoform project: Defining the human proteome. Sci Adv. 7 (46), eabk0734(2021).
  30. Carrasco-Zanini, J., et al. Mapping biological influences on the human plasma proteome beyond the genome. Nat Metab. 6 (10), 2010-2023 (2024).
  31. Adhikari, S., et al. A high-stringency blueprint of the human proteome. Nat Commun. 11 (1), 5301(2020).
  32. Liao, J. Y., et al. Rbpworld for exploring functions and disease associations of rna-binding proteins across species. Nucleic Acids Res. 53 (D1), D220-D232 (2025).
  33. Gebauer, F., Schwarzl, T., Valcarcel, J., Hentze, M. W. Rna-binding proteins in human genetic disease. Nat Rev Genet. 22 (3), 185-198 (2021).
  34. Poodts, J., et al. Improved expression of sars-cov-2 spike rbd using the insect cell-baculovirus system. Viruses. 14 (12), (2022).
  35. Mckenzie, E. A., Abbott, W. M. Expression of recombinant proteins in insect and mammalian cells. Methods. 147, 40-49 (2018).
  36. Shi, X., Jarvis, D. L. Protein n-glycosylation in the baculovirus-insect cell system. Curr Drug Targets. 8 (10), 1116-1125 (2007).

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