Évaluation des effets du triptolide sur la géphyrine hippocampique, la collybistine et l’autophagie dans un modèle murin Aβ1-42

Résumé

Ce protocole décrit l’établissement d’un modèle murin agrégé de type Alzheimer induit par Aβ1-42 ainsi que l’évaluation des effets du triptolide sur les protéines inhibitrices de l’hippocampe associées à la synapse, la signalisation PI3K/Akt/GSK-3β et les marqueurs liés à l’autophagie.

Résumé

La maladie d’Alzheimer est associée à un dysfonctionnement synaptique, mais les procédures standardisées pour évaluer comment la pathologie induite par l’Aβ affecte les protéines inhibitrices associées aux synapses et la signalisation liée à l’autophagie après une intervention candidate restent limitées. Ce protocole décrit un flux de travail pour établir un modèle murin de type Alzheimer induit par Aβ1-42 et évaluer les effets du triptolide sur la géphyrine hippocampique, la collybistine, la signalisation PI3K/Akt/GSK-3β et les marqueurs liés à l’autophagie. Les souris adultes C57BL/6J reçoivent une injection intracérébrale bilatérale d’Aβ1-42 préparée dans des conditions d’agrégation, suivie d’une administration quotidienne intrapéritonéale de triptolide avec ou sans l’inhibiteur de PI3K LY294002. L’apprentissage spatial et la mémoire sont évalués à l’aide du test de labyrinthe aquatique de Morris. Les lésions neuronales de l’hippocampe et le dépôt d’Aβ sont évalués par coloration de l’hématoxyline et de l’éosine ainsi que par immunohistochimie de l’Aβ, tandis que les lysats hippocampiques sont analysés par Western blotting pour quantifier la Gephyrine, la Gephyrine phosphorylée, la collybistine, les protéines de signalisation PI3K/Akt/GSK-3β, LC3-II/I et p62. Les principales considérations procédurales incluent la préparation standardisée Aβ1-42, l’injection stéréotaxique précise, des conditions de test comportementales cohérentes, la sélection aveugle de la région d’intérêt, ainsi que l’analyse standardisée de l’image et de la densitométrie. Grâce à ce flux de travail, l’administration d’Aβ1-42 a entraîné un apprentissage spatial et des déficits de mémoire, des lésions neuronales de l’hippocampe, un dépôt d’Aβ, une diminution de l’expression de la géphyrine et de la collybistine, une altération de la signalisation PI3K/Akt/GSK-3β, ainsi qu’une augmentation de l’accumulation de LC3-II/I et p62. Le triptolide a partiellement inversé ces changements comportementaux, histologiques et moléculaires, tandis que LY294002 atténuait ses effets. Ce protocole peut être utilisé pour évaluer les altérations moléculaires hippocampiques induites par l’Aβ et les interventions candidates, tout en reconnaissant que ce modèle ne reproduit pas la progression chronique et multifactorielle de la maladie d’Alzheimer humaine.

Introduction

La maladie d’Alzheimer (MA) est un trouble neurodégénératif progressif caractérisé par un déclin cognitif, des troubles de la mémoire et des troubles du comportement, et représente l’une des principales causes de démence chez les personnes âgées. Bien que le dépôt de β amyloïde (Aβ), la pathologie de la tau, le dysfonctionnement synaptique, la neuroinflammation et l’altération de l’homéostasie des protéines aient été largement impliqués dans la pathogenèse de la MA, les mécanismes moléculaires reliant la toxicité associée à Aβ à la perturbation des protéines synaptiques inhibitrices restent incomplètement^compris 1,2,3,4 . Le dysfonctionnement synaptique inhibiteur peut perturber l’équilibre entre excitation et inhibition dans les circuits neuronaux, contribuant ainsi à l’instabilité du réseau et à la dégradation cognitive. Cependant, les événements de signalisation intracellulaire qui régulent les protéines d’échafaudage associées à la synapse inhibitrice dans des conditions pathologiques de type DA induites par Aβ nécessitent une clarification^{supplémentaire 5}.

La géphyrine est une protéine majeure de l’échafaudage postsynaptique qui ancre et stabilise les récepteurs inhibiteurs des neurotransmetteurs, y compris les récepteurs de la glycine et les récepteurs de l’acide γ-aminobutyrique de type A, aux sites^{postsynaptiques 6}. La collybistine, codée par ARHGEF9, est un facteur d’échange nucléotidique de la guanine qui interagit avec la Gephyrine et favorise le regroupement et la localisation membranaire des composants synaptiques^{inhibiteurs 7}. L’interaction fonctionnelle entre la Gephyrine et la Collybistine est donc essentielle à l’organisation, au maintien et à la plasticité des synapses inhibitrices. La perturbation de ce complexe protéique peut altuer la neurotransmission inhibitrice et contribuer à des déficits cognitifs. Notamment, la stabilité de la Gephyrine et le regroupement synaptique peuvent être régulés par des mécanismes dépendants de la phosphorylation. La signalisation associée à l’oligomère Aβ a été rapportée comme influençant des kinases telles que la glycogène syntase kinase-3β (GSK-3β), qui peuvent favoriser la phosphorylation de la géphyrine à la sérine 270 et ainsi affecter le regroupement et la dégradation de la géphyrine. Ces résultats suggèrent que la régulation médiée par la kinase de la Gephyrine pourrait représenter un lien moléculaire important entre la pathologie associée à l’Aβ et la dysfonction synaptique^{inhibitrice 8,9}.

La voie PI3K/Akt est une voie de signalisation intracellulaire clé impliquée dans la survie neuronale, la plasticité synaptique, l’homéostasie des protéines et la régulation de l’autophagie. L’activité Akt peut supprimer le GSK-3β par phosphorylation inhibitrice, modulant ainsi les substrats en aval impliqués dans la fonction neuronale et la stabilité synaptique. La dysrégulation de la signalisation PI3K/Akt/GSK-3β a été impliquée dans des lésions neuronales liées à la DA et peut contribuer à la fois à une altération synaptique et à une dégradation anormale des protéines^10,11. Parallèlement, l’autophagie est une voie essentielle de dégradation intracellulaire qui retire les organites endommagés et les protéines mal repliées par les organes. Le dysfonctionnement autophagie-lysosomale a été étroitement associé à l’accumulation d’Aβ, à la pathologie de la tau et aux lésions neuronales dans la^{norme 12}. Cependant, les changements de LC3-II/I seuls ne peuvent pas distinguer l’augmentation de la formation d’autophagosomes d’une dégradation autophagique altérée ; Par conséquent, des marqueurs supplémentaires tels que P62 sont nécessaires pour mieux évaluer les changements de flux liés à l’autophagie. Ensemble, ces observations soutiennent la nécessité d’examiner l’activité PI3K/Akt, la régulation de la géphyrine médiée par GSK-3β, et les marqueurs liés à l’autophagie dans le même cadre expérimental.

Le triptolide, un diterpène triépóxide bioactif isolé de Tripterygium wilfordii, a été rapporté comme ayant des effets anti-inflammatoires, immunomodulateurs et^{neuroprotecteurs 13}. Des études antérieures ont suggéré que le triptolide pouvait améliorer la performance cognitive et préserver les protéines inhibitrices associées aux synapses dans des modèles de type AD. Néanmoins, la relation mécaniste entre le traitement par triptolide, l’activation de la voie PI3K/Akt, la phosphorylation de la Gephyrine médiée par GSK-3β, l’expression de la collybistine et les changements des protéines liées à l’autophagie n’a pas été entièrement définie. Il reste incertain que le triptolide régule l’expression de la géphyrine et de la collybistine dans l’hippocampe via un mécanisme associé à PI3K/Akt/GSK-3β dans un modèle murin de type AD induit par Aβ1-42^14,15.

Comparé aux modèles transgéniques chroniques de la maladie d’Alzheimer, tels que les souris APP/PS1 ou 5xFAD, et aux modèles basés sur la tauopathie, l’injection intracébroventriculaire d’Aβ1-42 agrégé offre une approche relativement rapide et techniquement accessible pour induire des lésions hippocampiques associées à Aβ et un trouble cognitif. Ce protocole est approprié lorsque l’objectif expérimental est d’évaluer la neurotoxicité à court terme induite par l’Aβ, les modifications moléculaires de l’hippocampe et les effets liés à l’intervention sur des voies de signalisation définies. Cependant, ce modèle ne reproduit pas la production chronique d’amyloïde, la pathologie tau, les altérations vasculaires, la complexité neuro-immune ou la progression dépendante de l’âge de la MA. Par conséquent, les résultats obtenus grâce à ce protocole doivent être interprétés comme une pathologie de type AD induite par l’Aβ et idéalement validés dans des modèles transgéniques chroniques, des modèles liés à la tau ou des systèmes neuronaux d’origine humaine. Malgré des preuves antérieures liant la pathologie de l’Aβ, la signalisation PI3K/Akt/GSK-3β, les protéines associées à la synapse inhibitrice et les anomalies liées à l’autophagie à une pathologie de type MA, peu de protocoles intègrent les tests comportementaux, l’évaluation histologique hippocampique, l’immunohistochimie de l’Aβ, l’analyse des protéines associées à la synapse inhibitrice, l’évaluation de la signalisation des kinases et la détection de marqueurs liés à l’autophagie au sein d’un seul modèle d’intervention induit par l’Aβ1-42. Cette lacune méthodologique limite l’évaluation reproductible de la modulation des changements des protéines inhibitrices associées aux synapses par des voies de signalisation intracellulaires définies.

L’objectif de ce protocole est de fournir un flux de travail reproductible pour évaluer l’expression de la Gephyrine et de la Collybistine en hippocampe ainsi que leurs mécanismes régulateurs associés dans un modèle murin de type AD induit par Aβ1-42, traité avec triptolide, avec ou sans l’inhibiteur de PI3K LY294002. La contribution initiale de ce travail est l’intégration de l’administration stéréotaxique d’Aβ1-42, la modulation pharmacologique des voies de signalisation, les tests du labyrinthe d’eau de Morris, l’évaluation histologique et immunohistochimique, ainsi que l’analyse par Western blot des protéines inhibitrices associées aux synapses, de la signalisation PI3K/Akt/GSK-3β et des marqueurs liés à l’autophagie. L’hypothèse de travail était que la pathologie de type DA induite par Aβ1-42 serait associée à une signalisation PI3K/Akt altérée, une altération de la phosphorylation de la Gephyrine associée à GSK-3β, une diminution de l’expression de la Gephyrine et de la Collybisine dans l’hippocampe, ainsi qu’une accumulation anormale de protéines liées à l’autophagie, tandis qu’un traitement au triptolide inverserait partiellement ces anomalies comportementales et moléculaires.

Protocole

Toutes les procédures animales ont été approuvées par le Comité d’éthique médicale de l’Université de médecine du Hubei et ont été réalisées conformément aux directives institutionnelles pour les soins et l’utilisation des animaux (n° SYXK2019-0031.). Toutes les procédures impliquant des animaux tels que Aβ1-42, triptolide, LY294002, paraformaldéhyde, xylène, éthanol et réactifs chimiluminescents doivent être réalisées avec un équipement de protection individuelle approprié, incluant une blouse de laboratoire, des gants et des lunettes de protection. Les carcasses animales, les tissus cérébraux, les consommables contaminés par Aβ, les déchets de paraformaldéhyde, les déchets de xylène et les matériaux contaminés par l’ECL doivent être collectés séparément et éliminés conformément aux réglementations institutionnelles sur la biosécurité et l’élimination des déchets chimiques. L’analyse d’image a été réalisée à l’aide d’ImageJ. Pour l’analyse immunohistochimique, les images ont été converties en niveaux de gris de 8 bits ou soumises à une déconvolution des couleurs afin d’isoler la coloration DAB-positive. Le même seuil a été appliqué à toutes les images au sein d’une même expérience. La surface de coloration positive, la zone totale de la région d’intérêt et la densité intégrée ont été mesurées. Pour le Western blotting, les intensités des bandes ont été mesurées à l’aide de l’outil d’analyse gel après soustraction de fond. Les niveaux de protéines cibles ont été normalisés en β-actine, tandis que les protéines phosphorylées ont été normalisées à leurs taux totaux correspondants.

Les réactifs et équipements utilisés dans cette étude sont listés dans le tableau des matériaux, incluant les noms des produits, les fabricants, les numéros de catalogue ou de modèle, ainsi que les descriptions génériques.

Animaux et regroupement expérimental
Quarante-huit souris adultes C57BL/6J, dont 24 mâles et 24 femelles, âgées de 10 à 12 semaines et pesant entre 22 et 28 g, ont été achetées au Centre expérimental animalier de l’Université de médecine du Hubei. Les souris ont été hébergées dans des conditions spécifiques sans agents pathogènes à 22 ± 2 °C, avec un accès libre à l’eau autoclavée et à la nourriture standard pour rongeurs. Après une semaine d’acclimatation, les souris ont été réparties au hasard dans quatre groupes : le groupe témoin, le groupe modèle de type AD induit par Aβ1-42, le groupe traité par triptolide, et le groupe co-traitement LY294002 plus triptolide, avec 12 souris par groupe. Les souris mâles et femelles étaient rééquilibrées entre les groupes aussi uniformément que possible.

Le peptide Aβ1-42 a été dissous dans une solution saline normale stérile jusqu’à une concentration finale de 10 μg/μL. Pour préparer Aβ1-42 dans des conditions inductantes à l’agrégation, la solution était incubée à 37 °C pendant 7 jours dans un bain-marie circulant, délicatement mélangée avant utilisation, puis conservée sur glace pendant l’injection. Cette condition de préparation a été adaptée des procédures d’agrégation Aβ42 publiées précédemment. Dans la présente étude, l’état d’agrégation du lot exact injecté Aβ1-42 n’a pas été caractérisé indépendamment par la fluorescence de la thioflavine T, le SDS-PAGE/Western blotting, ou la microscopie électronique en transmission. Par conséquent, le terme « Aβ1-42 agrégé » dans ce protocole fait référence à Aβ1-42 préparé dans des conditions d’incubation induisant l’agrégation.

Pour l’établissement du modèle, les souris ont été anesthésiées par injection intrapéritonéale de pentobarbital sodium à 10 % à une dose de 0,04 mL/10 g de poids corporel. Une anesthésie adéquate a été confirmée par l’absence de retrait pédalier et de réflexes cornéens. Chaque souris a ensuite été fixée sur un appareil stéréotaxique, et le cuir chevelu a été rasé et désinfecté à l’iodophore ou à 75 % d’éthanol. Une incision médiane a été réalisée pour exposer le crâne, et la brème a été identifiée au stéréomicroscope. Le crâne a été ajusté de sorte que le bregma et le lambda soient placés sur le même plan horizontal.

Les injections latérales bilatérales des ventricules ont été effectuées en utilisant les coordonnées suivantes par rapport au bregma : antéropostérieur, −0,50 mm ; médiolatérale, ±1,00 mm ; et dorsoventral, à −3,00 mm de la surface du crâne. Un volume total de 2 μL de solution agrégée d’Aβ1-42 a été injecté lentement (2 μL/min) dans chaque ventricule latéral à l’aide d’une micro-seringue. L’injection a été réalisée à une vitesse constante et basse afin de réduire les lésions tissulaires et le reflux. Après l’injection, l’aiguille était laissée en place environ 5 minutes, puis retirée lentement. Les souris témoins ont reçu un volume égal de solution stérile normale aux mêmes coordonnées et en suivant la même intervention chirurgicale. Après l’injection, l’incision du cuir chevelu était fermée à l’aide de points de suture ou de pinces pour la plaie, et les souris placées dans une cage de récupération chauffée jusqu’à ce qu’elles reprennent connaissance. La récupération postopératoire, le poids corporel, la cicatrisation des plaies, le comportement de toilettage, l’activité locomotrice et les signes de douleur ou de détresse étaient surveillés quotidiennement.

L’intervention médicamenteuse a été initiée 2 semaines après l’injection stéréotaxique, une fois que le modèle a été considéré comme stable. Le triptolide a été dissous dans une solution saline normale contenant 4 % de propylène glycol et administré intrapéritonéalement une fois par jour pendant 30 jours consécutifs. Le groupe traité par triptolide a reçu le triptolide à 0,2 mg/kg par jour, tandis que le groupe LY294002 plus triptolide co-traitement a reçu le triptolide avec l’inhibiteur PI3K LY294002 à 0,3 mg/kg une fois par jour pendant 30 jours consécutifs. Le groupe témoin et le groupe de modèles de type AD induit par Aβ1-42 ont reçu des volumes égaux de solution de véhicule en utilisant le même schéma^{d’injection 16}.

Test du labyrinthe aquatique de Morris
L’apprentissage spatial et la mémoire ont été évalués à l’aide du labyrinthe d’eau de Morris 24 heures après l’administration finale des médicaments. Le labyrinthe d’eau consistait en un bassin circulaire rempli d’eau maintenue à 22 °C ± 1 °C. Des indices visuels ont été placés autour de la piscine et maintenus inchangés tout au long de l’expérience. Pendant la phase de navigation par place, la plateforme cachée était fixée dans le quadrant cible. Avant les tests quotidiens, les souris étaient autorisées à s’acclimater à la salle de test pendant environ 30 minutes.

Le test de navigation a été effectué pendant 6 jours consécutifs. À chaque épreuve, la souris était délicatement placée dans l’eau, face au mur de la piscine depuis l’un des quadrants de départ, et autorisée à chercher la plateforme cachée pendant jusqu’à 60 secondes. Si la souris trouvait la plateforme dans les 60 secondes, elle était autorisée à rester sur la plateforme pendant 15 secondes. Si la souris ne parvenait pas à localiser la plateforme dans les 60 secondes, elle était guidée vers la plateforme et laissée y rester pendant 20 secondes pour faciliter la consolidation de la mémoire spatiale. Chaque souris subissait 4 essais par jour, et la latence d’évasion, la distance de nage et la vitesse de nage étaient enregistrées à l’aide d’un système automatisé de suivi vidéo.

Le septième jour, la plateforme a été retirée pour l’essai de la sonde. La souris était placée dans l’eau depuis le quadrant opposé à l’emplacement original de la plateforme et autorisée à nager librement pendant 60 secondes. Le nombre de passages à niveau et le pourcentage de temps passé dans le quadrant cible ont été enregistrés. Après chaque essai, la souris était séchée et remise dans une cage chauffée pour éviter l’hypothermie^17,18.

Collecte de tissus
Après des tests comportementaux, les souris ont été profondément anesthésiées par injection intrapéritonéale de 10 % de pentobarbital sodium à une dose de 0,04 mL/10 g de poids corporel. Huit souris de chaque groupe ont été sélectionnées au hasard pour l’extraction des protéines de l’hippocampe. Leurs cerveaux ont été rapidement retirés sur la glace, et les tissus bilatérals de l’hippocampe ont été disséqués sur une surface glacée. Les échantillons hippocampiques étaient placés dans des cryoviaux pré-marqués, congelés instantanément dans de l’azote liquide, puis stockés à −80 °C jusqu’à l’extraction des protéines.

Les quatre souris restantes de chaque groupe ont été utilisées pour des analyses histologiques et immunohistochimiques. Sous anesthésie profonde, les souris ont été perfusées transcardiquement avec du sérum physiologique tamponné phosphate jusqu’à ce que le foie devienne pâle, suivi d’un paraformoldéhyde à 4 %. Les cerveaux ont été soigneusement retirés et post-fixés dans 4 % de paraformoldéhyde à 4 °C pendant 24 heures. Après fixation, les tissus cérébraux ont été soumis à la plateforme expérimentale de pathologie, où l’implantation de paraffine et le coupage subséquent ont été effectués. Le paraformaldéhyde était manipulé dans une hotte chimique, et les déchets contenant du paraformoldéhyde étaient collectés séparément conformément aux exigences institutionnelles d’élimination des déchets chimiques.

Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine
Les tissus cérébraux incrustés dans la paraffine ont été découpés en sections coronales de 4 μm contenant l’hippocampe. Les sections ont été cuites à 60 °C pendant 1 heure, déparaffinées deux fois dans du xylène pendant 10 minutes chacune, puis réhydratées à travers des solutions d’éthanol graduées (100 %, 95 %, 85 % et 75 %), suivies d’eau distillée (5 minutes à chaque étape). Après réhydratation, les sections étaient teintées à l’hématoxyline pendant 10 minutes, rincées à l’eau courante, brièvement différenciées en alcool acide (2 s), si nécessaire, puis blanchies dans de l’eau courante. Les coupes ont ensuite été contre-colorées à l’éosine pendant 5 minutes, déshydratées à l’éthanol gradué, dégagées en xylène deux fois pendant 5 minutes chacune, puis montées avec de la résine neutre.

La morphologie de l’hippocampe a été observée au microscope optique. Des images ont été obtenues dans la même sous-région hippocampique pour tous les groupes, en utilisant les paramètres de grossissement et d’imagerie de 20×. Les lésions neuronales ont été évaluées sur la base de la densité neuronale, de la pyknose nucléaire et de l’organisation désordonnée à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images par un chercheur aveuglé à l’attribution du groupe¹⁹.

Immunohistochimie Aβ
Pour l’immunohistochimie Aβ, les sections de paraffine ont été déparaffinées et réhydratées comme décrit pour la coloration de l’hématoxyline et de l’éosine. La récupération d’antigènes a été réalisée dans un tampon EDTA à pH 8,0 en chauffant les sections dans un four à micro-ondes à haute puissance pendant 3 minutes à deux reprises. Les sections ont été laissées refroidir à température ambiante puis lavées trois fois avec du PBS pendant 5 minutes chacune. L’activité de la peroxydase endogène a été bloquée avec du peroxyde d’hydrogène à 3 % pendant 15 minutes à température ambiante, suivie d’un lavage au PBS trois fois pendant 5 minutes chacune. La liaison non spécifique a été bloquée avec un sérum de chèvre normal à 5 % pendant 30 minutes à température ambiante. Les sections ont été incubées toute la nuit à 4 °C avec un anticorps primaire contre Aβ dilué à 1:200 dans PBS. Après l’incubation, les sections ont été lavées trois fois avec du PBS pendant 5 minutes chacune, puis incubées avec un anticorps secondaire conjugué à HRP pendant 60 minutes à température ambiante. Après le lavage avec PBS, un substrat DAB a été appliqué, et le développement des couleurs a été surveillé au microscope. La réaction a été arrêtée avec de l’eau distillée dès que la coloration brun-positive est devenue visible. Les coupes étaient contre-colorées à l’hématoxyline, déshydratées par de l’éthanol gradué, dégagées au xylène et montées avec une résine neutre. Des images ont été capturées dans la même sous-région hippocampique pour tous les groupes, utilisant des réglages de microscope identiques à un grossissement de 20×. L’immunocoloration Aβ a été quantifiée à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images. Le seuil de coloration positif a été maintenu constant sur toutes les images, et le dépôt Aβ a été calculé comme la surface de coloration positive divisée par le nombre total de cellules dans chaque champ microscopique.

Extraction des protéines de l’hippocampe et analyse du western blot
Les tissus glacés de l’hippocampe ont été maintenus sur glace et homogénéisés dans un tampon de lyse RIPA glacé contenant des inhibiteurs de protéase et de phosphatase. Les homogénéats ont été incubés sur la glace pendant 30 minutes et ont été tourbillonnés de façon intermittente pour assurer une lyse suffisante. Les lysats ont ensuite été centrifugés à 12 000 × g pendant 15 minutes à 4 °C, et les surnatants ont été collectés pour l’analyse des protéines. Les concentrations de protéines ont été déterminées à l’aide d’un kit de test protéique BCA selon les instructions du fabricant. En résumé, des standards BSA et des échantillons de protéines ont été préparés en double, mélangés avec un réactif BCA de travail, incubés à 37 °C pendant 30 minutes, puis mesurés à 562 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques. Les concentrations de protéines ont été calculées selon la courbe standard, et tous les échantillons ont été ajustés à la même concentration finale avant l’électrophorèse²⁰.

20 μg de protéines totales de chaque échantillon hippocampique ont été séparées par 12 % de SDS-PAGE et transférées sur les membranes de PVDF. L’électrophorèse était réalisée à 80 V pour l’empilement et à 120 V pour la séparation. Les protéines ont été transférées vers des membranes PVDF activées dans le méthanol par transfert humide à 100 V pendant 90 minutes à 4 °C. Après le transfert, les membranes étaient bloquées avec 5 % de BSA pendant 1 heure à température ambiante. Les membranes ont ensuite été incubées toute la nuit à 4 °C avec des anticorps primaires contre la Géphyrine (dilution 1:1000), la Géphyrine phosphorylée (dilution 1:500), la Collybistine (dilution 1:1000), PI3K (dilution 1:1000), Akt (dilution 1:1000), Akt phosphorylé (dilution 1:1000), GSK-3β (dilution 1:1000), GSK-3β phosphorylé (dilution 1:1000), LC3 (dilution 1:1000), P62 (dilution 1:1000) et β-actine (dilution 1:5000). Après lavage avec TBST, les membranes ont été incubées avec des anticorps secondaires conjugués à HRP pendant 1 h à température ambiante (dilution 1:5000). Les bandes protéiques ont été visualisées à l’aide d’un substrat chimiluminescent ECL et capturées avec un système d’imagerie chimioluminescente. Les intensités des bandes ont été quantifiées à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images. Les niveaux totaux d’expression protéique ont été normalisés en β-actine. Des images Western blot non recadrées à haute résolution ont été incluses dans les matériaux supplémentaires.

Données statistiques
L’analyse statistique a été réalisée à l’aide de logiciels d’analyse statistique et de génération de graphes. Les données étaient exprimées en moyenne ± SD, comme indiqué dans les légendes des figures. Des tests comportementaux et la quantification d’images ont été réalisés par des enquêteurs aveuglés à l’allocation de groupes. La latence d’évasion lors de la phase d’entraînement du labyrinthe aquatique de Morris a été analysée à l’aide d’ANOVA à mesures répétées bidirectionnelles, avec le groupe et le jour d’entraînement comme facteurs. Les données des essais par sonde, la quantification histologique, la quantification immunohistochimique et la densitométrie Western blot ont été analysées à l’aide d’un test ANOVA unidirectionnel. La signification statistique a été définie comme p < 0,05. La notation standard de signification était utilisée comme suit : *p < 0,05, **p < 0,01, et ***p < 0,001. Les tailles exactes des échantillons étaient indiquées dans les légendes correspondantes des figures. Les souris mâles et femelles étaient réparties uniformément entre les groupes expérimentaux. Cependant, l’analyse statistique stratifiée par sexe n’a pas été réalisée car l’étude n’a pas été conçue ou propulsée pour détecter les effets spécifiques au sexe. Cette limitation est reconnue dans la section Discussion.

Résultats

Apprentissage et mémoire altérés chez des souris de type AD induites par Aβ1-42 et amélioration partielle après un traitement au triptolide

Pour établir un modèle murin de type AD induit par Aβ1-42, l’Aβ1-42 agrégé a été injecté stéréotaxialement dans les ventricules latéraux bilatéraux des souris C57BL/6J. Après l’établissement du modèle, les souris ont été traitées avec des véhicules, du triptolide ou du triptolide combiné à l’inhibiteur PI3K LY294002. L’apprentissage spatial et la mémoire ont ensuite été évalués à l’aide du labyrinthe aquatique de Morris.

Pendant la phase de navigation par place de 6 jours, la latence d’évasion a diminué progressivement dans tous les groupes, indiquant que les souris ont acquis la tâche d’apprentissage spatial par un entraînement répété (Figure 1A). Cependant, les souris de type AD induites par Aβ1-42 ont montré des latences d’évasion systématiquement plus longues que les souris témoins, notamment lors des jours d’entraînement plus tardifs, ce qui suggère un apprentissage spatial altéré. Le traitement au triptolide a raccourci la latence d’échappement par rapport au groupe modèle de type AD induit par Aβ1-42, tandis que le co-traitement avec LY294002 a affaibli cette amélioration. Ces résultats indiquent que le triptolide a partiellement amélioré le trouble de l’apprentissage spatial induit par Aβ1-42, et cet effet a été atténué par l’inhibition de PI3K.

Les pistes de natation représentatives ont également soutenu ces changements comportementaux (Figure 1B). Les souris témoins ont montré un schéma de recherche plus direct, orienté vers la cible, autour de l’emplacement de la plateforme, tandis que les souris de type AD induites par Aβ1-42 ont affiché une trajectoire de nage dispersée et inefficace. Les souris traitées au triptolide ont montré un meilleur comportement de recherche, avec des trajectoires plus concentrées autour de la zone ciblée. En revanche, les souris traitées avec LY294002 et triptolide ont montré une recherche moins efficace que celles traitées uniquement avec le triptolide. Lors de l’essai de la sonde réalisé après le retrait de la plateforme, les souris de type AD induites par Aβ1-42 ont traversé la position initiale de la plateforme moins de fois que les souris témoins, indiquant une rétention spatiale de mémoire altérée (Figure 1C). Le traitement au triptolide a augmenté le nombre de passages à niveau, tandis que LY294002 co-traitement a réduit cet effet. De même, le pourcentage de temps passé dans le quadrant cible a été réduit chez les souris de type AD induite par Aβ1-42 par rapport aux souris témoins, augmenté après le traitement au triptolide, puis diminué à nouveau après LY294002 co-traitement (Figure 1D).

Ensemble, ces résultats comportementaux démontrent que l’injection bilatérale intracérébrale d’Aβ1-42 agrégé induisait des déficits d’apprentissage spatial et de mémoire chez la souris. Le triptolide a partiellement inversé ces troubles comportementaux, tandis que LY294002 atténuait l’effet protecteur du triptolide, suggérant que la signalisation PI3K/Akt pourrait contribuer aux effets comportementaux observés dans ce modèle.

L’injection d’Aβ1-42 a induit une lésion neuronale de l’hippocampe et un dépôt d’Aβ, qui ont été atténués par le triptolide

Pour vérifier davantage l’établissement de changements pathologiques similaires à la maladie d’Alzheimer induits par l’Aβ1-42 et évaluer l’effet du triptolide sur la lésion hippocampique, des colorations de l’hématoxyline et de l’éosine ainsi que l’immunohistochimie de l’Aβ ont été réalisées sur des sections cérébrales de chaque groupe.

La coloration HE a montré que les neurones du groupe témoin étaient densément et régulièrement disposés, avec une morphologie cellulaire et une structure nucléaire relativement claires (Figure 2A). En revanche, les souris de type AD induites par Aβ1-42 présentaient des lésions neuronales hippocampiques évidentes, caractérisées par un arrangement cellulaire désordonné, une densité neuronale réduite et une condensation nucléaire accrue. Le traitement par triptolide a partiellement amélioré la morphologie neuronale de l’hippocampe, avec une disposition cellulaire plus préservée et une pyknose nucléaire moins apparente comparée au groupe modèle induit par Aβ1-42. Cependant, le cotraitement avec LY294002 atténuait l’effet protecteur du triptolide, comme en témoigne une désorganisation et une lésion neuronales plus prononcées comparé au groupe traité par triptolide.

Une immunohistochimie Aβ a ensuite été réalisée pour évaluer le dépôt d’Aβ dans l’hippocampe (Figure 2B). Une coloration minimale Aβ-positive a été observée dans le groupe témoin, tandis que le groupe modèle de type AD induit par Aβ1-42 a montré une augmentation marquée des signaux bruns Aβ-positifs. Le traitement au triptolide a réduit la coloration Aβ-positive par rapport au groupe modèle, indiquant que le triptolide atténuait le dépôt d’Aβ dans ce modèle. En revanche, les souris traitées avec LY294002 plus triptolide ont montré une coloration Aβ-positive accrue comparée à celles traitées uniquement avec le triptolide. L’analyse quantitative a également confirmé ces observations histologiques. La zone de signal Aβ-positive normalisée au nombre total de cellules dans chaque champ microscopique a été augmentée dans le groupe modèle de type AD induit par Aβ1-42 par rapport au groupe témoin, réduite après traitement au triptolide, puis partiellement augmentée après LY294002 co-traitement (Figure 2B).

Ces résultats indiquent que l’injection d’Aβ1-42 a induit une lésion neuronale de l’hippocampe et une accumulation d’Aβ, tandis que le triptolide a partiellement atténué ces changements pathologiques. L’inversion observée après LY294002 co-traitement suggère que la signalisation PI3K/Akt pourrait contribuer à l’effet protecteur du triptolide.

Le triptolide a rétabli l’expression de la géphyrine et de la collybistine dans l’hippocampe et a modulé la signalisation PI3K/Akt/GSK-3β

Pour déterminer si les changements comportementaux et histologiques étaient accompagnés d’altérations des protéines inhibitrices associées à la synapse et de leur signalisation régulatrice en amont, des lysats hippocampiques de chaque groupe ont été analysés par Western bloting. Comparées au groupe témoin, les souris de type AD induites par Aβ1-42 ont montré une nette diminution de l’expression de la géphyrine hippocampique, tandis que les niveaux phosphorylés de gephyrine ont été augmentés (Figure 3A). Le traitement au triptolide a partiellement rétabli l’expression totale de la Gephyrine et réduit les niveaux phosphorylés de Gephyrine. En revanche, LY294002 co-traitement a affaibli l’effet du triptolide, comme l’ont montré une expression réduite de la Gephyrine et une augmentation de la Gephyrine phosphorylée par rapport au groupe traité par triptolide. Ces résultats suggèrent que la pathologie induite par l’Aβ1-42 était associée non seulement à une diminution de l’abondance de la Gephyrine dans l’hippocampe, mais aussi à une phosphorylation accrue de la Gephyrine, tandis que le triptolide inversait partiellement ces altérations.

La collybistine a montré un schéma d’expression similaire à celui de la Gephyrine totale. Les souris de type AD induites par Aβ1-42 ont montré une expression de collybistine hippocampique diminuée par rapport aux souris témoins, tandis que le traitement au triptolide a rétabli l’expression de la collybistine. LY294002 co-traitement a partiellement inversé cet effet (Figure 3B). Ces résultats indiquent que le triptolide a préservé l’expression des protéines d’échafaudage associées à la synapse inhibitrice dans l’hippocampe, et cet effet a été atténué par l’inhibition de PI3K. La voie de signalisation PI3K/Akt/GSK-3β a ensuite été examinée afin d’élucider davantage les changements moléculaires sous-jacents à la phosphorylation de la Gephyrine. Dans le groupe modèle de type AD induit par Aβ1-42, l’expression de PI3K et le rapport p-Akt/Akt étaient réduits par rapport au groupe témoin, indiquant une activité de signalisation PI3K/Akt altérée (Figure 3B). Le rapport p-GSK-3β/GSK-3β a également été réduit dans le groupe de modèles. Parce que la phosphorylation de GSK-3β au site inhibiteur reflète la suppression de l’activité de GSK-3β, cette réduction suggère une activité relativement accrue de GSK-3β dans l’hippocampe de type AD induit par Aβ1-42. Le traitement au triptolide a augmenté l’expression de PI3K, rétabli le rapport p-Akt/Akt et élevé le rapport p-GSK-3β/GSK-3β. Ces effets ont été atténués par LY294002 co-traitement.

Ensemble, ces résultats suggèrent que la pathologie de type DA induite par Aβ1-42 était associée à une diminution de l’expression de la géphyrine et de la collybistine dans l’hippocampe, une phosphorylation accrue de la géphyrine et une altération de la phosphorylation inhibitrice médiée par PI3K/Akt de GSK-3β. Le triptolide a partiellement inversé ces changements moléculaires, tandis que LY294002 atténué les effets du triptolide, soutenant l’implication de la signalisation PI3K/Akt/GSK-3β dans la régulation de la géphyrine hippocampique et de la collybistine dans ce modèle.

Le triptolide atténuait les anomalies protéiques liées à l’autophagie dans l’hippocampe de souris de type AD induite par Aβ1-42

Pour déterminer si la pathologie de type AD induite par Aβ1-42 et le traitement par triptolide étaient associés à des modifications des protéines liées à l’autophagie, l’expression de LC3 et p62 a été examinée dans les lysats hippocampiques par Western blotting. Comparées au groupe témoin, les souris de type AD induites par Aβ1-42 ont montré un rapport LC3-II/I accru, indiquant une accumulation accrue de LC3-II associée aux autophagosomes. Parallèlement, l’expression de p62 a également été élevée dans le groupe modèle, suggérant une accumulation de substrats liés à l’autophagie dans l’hippocampe. Le traitement au triptolide a réduit à la fois le rapport LC3-II/I et l’expression de p62 par rapport au groupe modèle de type AD induit par Aβ1-42. Ces résultats indiquent que le triptolide a atténué l’accumulation anormale de protéines liées à l’autophagie induite par Aβ1-42. En revanche, LY294002 cotraitement a augmenté le rapport LC3-II/I et l’expression de p62 par rapport au traitement triptolide seul, suggérant que l’inhibition de PI3K atténuait l’effet du triptolide sur les changements protéiques liés à l’autophagie (Figure 4).

Dans l’ensemble, le groupe témoin a fourni le profil comportemental, histologique et moléculaire de base, tandis que le groupe modèle de type AD induit par Aβ1-42 a confirmé que l’administration intracérébroventriculaire d’Aβ1-42 a entraîné un trouble cognitif, une lésion neuronale hippocampique, un dépôt d’Aβ, une réduction des protéines inhibitrices associées à la synapse, des modifications de la signalisation PI3K/Akt/GSK-3β et une accumulation de protéines liées à l’autophagie. La comparaison entre le groupe modèle induit par Aβ1-42 et celui traité par triptolide a montré que le triptolide inversait partiellement ces anomalies. La comparaison entre le groupe traité par triptolide et le groupe co-traitement LY294002 plus triptolide a également montré que l’inhibition de PI3K atténuait les effets du triptolide. Ces résultats soutiennent l’hypothèse de travail selon laquelle le triptolide module les changements dans la géphyrine hippocampique, la collybistine et les protéines liées à l’autophagie dans un modèle de type AD induit par Aβ1-42 via un mécanisme associé à PI3K/Akt/GSK-3β.

DISPONIBILITÉ DES DONNÉES :

Toutes les données brutes nécessaires pour reproduire les résultats de cette étude sont fournies sous forme de Fichier Supplémentaire 1 et Fichier Supplémentaire 2. Cela inclut les images originales de western blot et de gel, les données de blot non recadrées, les valeurs numériques brutes utilisées pour les analyses statistiques, ainsi que les graphiques générés. (Fichier Supplémentaire 1 et Fichier Supplémentaire 2) Ces fichiers fournissent les données brutes soutenant les résultats quantitatifs rapportés dans la Figure 1–4.

Figure 1 : Le triptolide a partiellement amélioré l’apprentissage spatial et les déficits de mémoire chez les souris de type DA induites par Aβ1-42. (A) Latence d’évasion pendant la phase de navigation de 6 jours du labyrinthe aquatique de Morris. (B) Trajectoires de nage représentatives lors de l’essai de sonde. (C) Nombre de passages à niveau au-dessus de l’emplacement original du quai après le retrait du quai. (D) Pourcentage du temps passé dans le quadrant cible pendant l’essai de la sonde. Les données sont présentées en moyenne ± SD. La latence d’échappement a été analysée par ANOVA à mesures répétées bidirectionnelles, et les données des essais par sonde ont été analysées par un test ANOVA unidirectionnel. Ctr, groupe de contrôle ; AD, groupe de modèles de type AD induit par Aβ1-42 ; TP, groupe traité au triptolide ; Groupe de co-traitement LY, LY294002 plus triptolide. n = 6 par groupe. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 2 : Le triptolide a atténué la lésion neuronale de l’hippocampe et le dépôt d’Aβ chez des souris de type AD induites par Aβ1-42. (A) Images représentatives de coloration par hématoxyline et éosine des sections hippocampiques de chaque groupe. Barre d’échelle = 50μm. (B) Images représentatives de coloration immunohistochimique Aβ et analyse quantitative du dépôt Aβ-positif dans l’hippocampe. Barre-échelle = 50μm. Les données sont présentées en moyenne ± DS. L’analyse statistique a été réalisée à l’aide d’un test ANOVA unidirectionnel. Ctr, groupe de contrôle ; AD, groupe de modèles de type AD induit par Aβ1-42 ; TP, groupe traité au triptolide ; Groupe de co-traitement LY, LY294002 plus triptolide. n = 3 par groupe. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 3 : Le triptolide a restauré l’expression de la géphyrine et de la collybistine dans l’hippocampe et a modulé la signalisation associée à PI3K/Akt/GSK-3β chez des souris de type AD induite par Aβ1-42. (A) Images représentatives de Western blot et analyse quantitative de l’expression totale de la Gephyrine et de la Gephyrine phosphorylée dans les lysats de l’hippocampe de chaque groupe. (B) Images représentatives de Western blot et analyse quantitative de la collybistine, PI3K, Akt, Akt phosphorylée, GSK-3β et GSK-3β phosphorylée dans les lysats hippocampaux. La collybistine et la PI3K ont été normalisées en β-actine. Les rapports phosphorylés Akt et GSK-3β phosphorylés ont été quantifiés respectivement en rapports p-Akt/Akt et p-GSK-3β/GSK-3β. Les données sont présentées en moyenne ± DS. L’analyse statistique a été réalisée à l’aide d’un test ANOVA unidirectionnel. Ctr, groupe de contrôle ; AD, groupe de modèles de type AD induit par Aβ1-42 ; TP, groupe traité au triptolide ; Groupe de co-traitement LY, LY294002 plus triptolide. n = 3 par groupe. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 4 : Le triptolide a atténué les anomalies protéiques liées à l’autophagie dans l’hippocampe de souris de type AD induites par Aβ1-42. Images représentatives de Western blot et analyse quantitative de l’expression de LC3-I/II et p62 dans les lysats hippocampiques de chaque groupe. Le rapport LC3-II/I a été calculé en divisant l’intensité de la bande LC3-II par l’intensité de la bande LC3-I, et l’expression de p62 a été normalisée en β-actine. Les données sont présentées en moyenne ± DS. L’analyse statistique a été réalisée à l’aide d’un test ANOVA unidirectionnel. Ctr, groupe de contrôle ; AD, groupe de modèles de type AD induit par Aβ1-42 ; TP, groupe traité au triptolide ; Groupe de co-traitement LY, LY294002 plus triptolide. n = 3 par groupe. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Fichier supplémentaire 1 : Images de Western blot non recadrées. Les bandes utilisées pour la quantification sont indiquées, et les marqueurs de poids moléculaire sont affichés lorsque disponibles. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 2 : Valeurs numériques brutes utilisées pour les analyses statistiques dans cet article. Ce fichier contient les ensembles de données numériques bruts utilisés pour générer les graphiques quantitatifs de la Figure 1 à 4, incluant les mesures comportementales du labyrinthe d’eau de Morris, la quantification immunohistochimique Aβ et les valeurs de densitométrie par Western blot. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

La proposition mécaniste centrale de cette étude est que la pathologie induite par Aβ1-42 supprime la signalisation PI3K/Akt, réduit la phosphorylation inhibitrice de GSK-3β, favorise la phosphorylation de la Gephyrine, diminue l’expression de la Gephyrine et de la Collybistine dans l’hippocampe, et contribue à l’accumulation de protéines liées à l’autophagie, tandis que le triptolide contrebalance partiellement ces changements via une voie associée à PI3K/Akt/GSK-3β. Cette étude montre que la pathologie de type DA induite par Aβ1-42 s’accompagne d’un apprentissage spatial et de la mémoire altérés, d’une lésion neuronale hippocampique, d’une augmentation du dépôt d’Aβ, d’une expression réduite de la Gephyrine et de la Collybistine, d’une phosphorylation accrue de la Gephyrine, d’une signalisation modifiée de PI3K/Akt/GSK-3β, et d’accumulation de protéines liées à l’autophagie. Le triptolide a partiellement inversé ces anomalies comportementales, histologiques et moléculaires, tandis que LY294002 atténué ses effets. Ces résultats soutiennent un modèle dans lequel le triptolide protège les protéines inhibitrices de l’hippocampe associées à la synapse, au moins en partie, grâce à la régulation médiée par PI3K/Akt/GSK-3β de la phosphorylation de la géphyrine et des modifications des protéines liées à l’autophagie. Il convient de noter que le modèle d’injection intracérébroperculaire Aβ1-42 reflète principalement la neurotoxicité induite par Aβ et une pathologie similaire à la DA, plutôt que la progression chronique complète et multifactorielle de l’AD^{humain 21}.

La géphyrine et la collybistine sont des composantes centrales de l’organisation synaptique inhibitrice. La gephyrine ancre les récepteurs inhibiteurs des neurotransmetteurs aux sites postsynaptiques, tandis que la collybicine favorise le regroupement et la localisation de la membrane Gephyrine. Une expression réduite de ces protéines peut donc perturber la stabilité synaptique inhibitrice et contribuer à une altération de la fonction du réseau^{hippocampique 8}. Dans cette étude, Aβ1-42 a réduit l’expression de la géphyrine et de la collybistine dans l’hippocampe, tandis que le triptolide a restauré les deux protéines. L’augmentation de la Géphyrine phosphorylée constitue un mécanisme plausible de perte de Géphyrine, car la phosphorylation à Ser270 a été liée à la dispersion de la Géphyrine, à la réduction du regroupement et à la déstabilisation des protéines. La réduction parallèle de l’expression de PI3K, de la phosphorylation d’Akt et de la phosphorylation inhibitrice de GSK-3β suggère que Aβ1-42 affaiblit la signalisation PI3K/Akt et pourrait augmenter l’activité de GSK-3β, ce qui est cohérent avec une phosphorylation accrue de la Gephyrine. Inversement, le triptolide a restauré la phosphorylation d’Akt, augmenté la phosphorylation inhibitrice de GSK-3β et réduit la phosphorylation de la Gephyrine, tandis que LY294002 affaiblit ces effets. Ces résultats suggèrent que le triptolide pourrait préserver l’expression de la géphyrine et de la collybistine grâce à la régulation de la phosphorylation de la géphyrine associée à PI3K/Akt/GSK-3β. Cependant, comme des lysats hippocampiques entiers ont été utilisés, ces résultats reflètent des changements dans l’abondance et la phosphorylation des protéines hippocampiques plutôt que des preuves directes de localisation^{synaptique 22,23}.

Des anomalies liées à l’autophagie peuvent également contribuer aux changements moléculaires observés dans ce modèle. L’autophagie est importante pour la protéostase neuronale, mais une dégradation autophagique altérée dans la MA peut entraîner l’accumulation d’autophagosomes et de substrats protéiques^{pathologiques 24,25}. Dans la présente étude, Aβ1-42 a augmenté à la fois le rapport LC3-II/I et l’expression de p62, suggérant l’accumulation de substrats LC3-II associés à l’autophagosome et liés à l’autophagie. Le triptolide a réduit les deux marqueurs, tandis que LY294002 a partiellement inversé cet effet, suggérant que le triptolide pourrait atténuer l’accumulation de protéines liée à l’autophagie via un mécanisme dépendant de PI3K/Akt. Avec les changements dans la signalisation de la géphyrine, de la collybiste et de PI3K/Akt/GSK-3β, ces résultats élargissent la compréhension des effets neuroprotecteurs du triptolide au-delà des actions anti-inflammatoires ou neuroprotectrices générales, suggérant que le triptolide pourrait également influencer les protéines d’échafaudage associées à la synapse inhibitrices, la signalisation kinase et les voies liées à la protéostase dans la pathologie de type AD^{associée à Aβ 26}.

Plusieurs étapes cruciales déterminent le succès et la reproductibilité de ce protocole. Premièrement, l’état d’agrégation d’Aβ1-42 doit être soigneusement contrôlé et vérifié avant l’injection, car la préparation peptidique peut fortement influencer les résultats pathologiques. Deuxièmement, une injection stéréotaxique précise dans les ventricules latéraux est essentielle ; le reflux, un mauvais placement de l’aiguille ou une vitesse d’injection excessive peuvent entraîner une exposition variable à Aβ et des résultats comportementaux ou histologiques incohérents. Troisièmement, les tests dans le labyrinthe d’eau Morris nécessitent des indices visuels stables, une température de l’eau constante et une surveillance de la vitesse de nage afin d’exclure toute altération motrice comme facteur de confusion. Quatrièmement, la quantification histologique et immunohistochimique doit être réalisée à l’aide de régions hippocampiques d’intérêt prédéfinies et d’une analyse aveugle. Enfin, les résultats du Western blot dépendent d’une charge protéique égale, d’une concentration appropriée en gel, d’un transfert efficace et de l’utilisation d’images de blot non recadrées pour confirmer la spécificité de la bande.

Plusieurs limitations doivent être prises en compte. Premièrement, le modèle d’injection Aβ1-42 ne reproduit pas la progression chronique, la pathologie de la tau, les modifications vasculaires ou la complexité neuroimmune de la maladie d’Alzheimer humaine. Deuxièmement, bien que les souris mâles et femelles aient été réparties uniformément entre les groupes, l’étude n’a pas été alimentée pour une analyse stratifiée par^{sexe 27}. Troisièmement, les lysats hippocampiques entiers ne peuvent pas déterminer si des changements de la Gephyrine et de la Collybistine se produisent spécifiquement aux synapses inhibitrices. Quatrièmement, le mécanisme proposé PI3K/Akt/GSK-3β–Gephyrin reste associatif, car l’activité de GSK-3β et la phosphorylation de Gephyrin Ser270 n’ont pas été directement manipulées. Enfin, LC3-II/I et p62 sont des lectures statiques de Western blot et ne peuvent pas définir entièrement le flux autophagique dynamique. Les études futures devraient utiliser la fractionnement synaptosomique, la co-localisation immunofluorescente avec des marqueurs postsynaptiques inhibiteurs, des approches de gain ou de perte de fonction GSK-3β, des constructions mutantes Gephyrine Ser270, et des tests de flux basés sur des inhibiteurs lysosomals. Une validation dans les modèles transgéniques chroniques de la DA transgénique, les modèles liés à la tau et les systèmes neuronaux d’origine humaine sera également nécessaire pour déterminer si cette voie est largement pertinente pour la pathologie de la^{DA 14}. Une autre limitation est que l’état d’agrégation de la préparation exacte Aβ1-42 utilisée pour l’injection stéréotaxique n’a pas été validé indépendamment par la fluorescence de thioflavine T, la SDS-PAGE/Western blotting ou la microscopie électronique en transmission. Bien que le peptide ait été préparé à l’aide d’une procédure d’incubation prolongée à 37 °C, couramment utilisée pour favoriser l’agrégation d’Aβ1-42, la variation d’un lot à l’autre dans l’état d’agrégation peut influencer les résultats pathologiques. De futures études devraient valider ce flux de travail dans les modèles transgéniques chroniques de la DA, les modèles liés à la tau et les systèmes neuronaux d’origine humaine. D’autres expériences devraient inclure la validation directe de l’état d’agrégation Aβ1-42, l’évaluation de la précision de l’injection stéréotaxique par vérification par colorant ou anatomique, le fractionnement synaptosomique, la co-localisation immunofluorescente avec des marqueurs postsynaptiques inhibiteurs, des approches de gain ou de perte de fonction GSK-3β, des expériences mutantes Gephyrine Ser270, et des tests de flux autophagique basés sur des inhibiteurs lysosomals. Des études de dose-réponse et de sécurité du triptolide sont également nécessaires avant de pouvoir envisager des applications translationnelles

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Anti-Gephyrin antibody	12681	Peoteintech	Anticorps primaire pour la détection par Western blot de la Gephyrin totale.
Anti-phosphorylated-Gephyrin  antibody	147011	Synaptic Systems	Anticorps primaire pour la détection par Western blot de la Gephyrin phosphorylée.
Anti-Collybistin antibody	ab316963	abcam	Anticorps primaire pour la détection par Western blot de la Collybistin.
Anti-PI3K antibody	27921	Peoteintech	Anticorps primaire pour la détection par Western blot de la PI3K.
Anti-Akt antibody	9272	Cell Signaling Technology	Anticorps primaire pour la détection par Western blot de l'Akt totale.
Anti-phosphorylated Akt antibody	4060	Cell Signaling Technology	Anticorps primaire pour la détection par Western blot de l'Akt phosphorylée.
Anti-GSK-3β antibody	12456	Cell Signaling Technology	Anticorps primaire pour la détection par Western blot de la GSK-3β totale.
Anti-phosphorylated GSK-3β antibody	5558	Cell Signaling Technology	Anticorps primaire pour la détection par Western blot de la GSK-3β phosphorylée.
Anti-β actin antibody	66009	Peoteintech	Anticorps de contrôle du chargement pour la normalisation des Western blot.
Anti-LC3 antibody	11972	Cell Signaling Technology	Anticorps primaire pour la détection par Western blot de LC3-I et LC3-II.
Anti-p62 antibody	5114	Cell Signaling Technology	Anticorps primaire pour la détection par Western blot de p62/SQSTM1.
Anti-Aβ1-42 antibody	ab150155	abcam	Anticorps primaire pour la détection de Aβ1-42.
HRP-conjugated secondary antibody (anti-mouse IgG)	7076S	Cell Signaling Technology	Anticorps secondaire pour les anticorps primaires de souris en Western blotting.
HRP-conjugated secondary antibody (anti-rabbit IgG)	7074S	Cell Signaling Technology	Anticorps secondaire pour les anticorps primaires de lapin en Western blotting.
Anti-Aβ antibody	GT622,	Invitrogen,	Anticorps primaire pour l'immunohistochimie de Aβ.
Aβ1-42	9001	Shanghai Duma Technology Co., Ltd.	Peptide amyloïde-β utilisé pour préparer la solution d'injection induisant l'agrégation.
triptolide	BD9097	Shanghai Bide Pharmaceutical.	Composé de test administré par voie intrapéritonéale.
LY294002	ab120243	abcam	Inhibiteur de PI3K utilisé pour le groupe de co-traitement.
paraformaldéhyde	P0099	Beyotime	Fixateur pour perfusion transcardique et post-fixation des tissus.
xylène	108298	Merck	Réactif de déparaffinisation et de clarification des tissus.
éthanol	100983	Merck	Réactif de réhydratation et de déshydratation pour les coupes paraffinées.
propylène glycol	294004	Merck	Composant du vecteur pour la préparation de la solution médicamenteuse.
inhibiteurs de protéase et de phosphatase	P1045	Beyotime	Additif du tampon de lyse utilisé pour préserver les protéines et les états de phosphorylation.
RIPA lysis buffer	P0013	Beyotime	Tampon de lyse pour l'extraction des protéines totales à partir du tissu hippocampique.
EDTA antigen retrieval buffer	ab93680	abcam	Tampon de récupération d'antigène à chaud pour l'immunohistochimie.
pentobarbital sodium	P3761	Sigma	Anesthésique utilisé pour la chirurgie et la collecte de tissus.
Sérum de chèvre	ZLI-9056	ZSGB-BIO	Réactif de blocage pour l'immunohistochimie.
Mémbranes PVDF	ISEQ00010	Merck Millipore	Mémbrane utilisée pour le transfert Western blot.
Morris water maze	VX80	Shanghai Xinruan Information Technology Co., Ltd.	Appareil comportemental et système de suivi vidéo pour l'évaluation de l'apprentissage spatial et de la mémoire.
chemiluminescence imaging system	Doc™ XR+ 1708195	Bio-rad	Système d'imagerie pour l'acquisition de signaux Western blot par chimiluminescence.
appareil stéréotaxique	/	Stoelting Technology Co., Ltd	Appareil utilisé pour l'injection intracérébroventriculaire stéréotaxique.
BCA protein assay kit	P0006	Beyotime	Kit d'analyse colorimétrique pour la mesure de la concentration totale des protéines.
microplate reader	Synergy2	Biotek	Lecteur d'absorbance utilisé pour la mesure du test BCA.
ImageJ	version 9.0.1	National Institutes of Health	Logiciel d'analyse d'images pour l'histologie, l'immunohistochimie et la densitométrie Western blot.
GraphPad Prism	version 8.5	GraphPad Software	Logiciel d'analyse statistique et de génération de graphiques.