Ce protocole détaille l’imagerie calcique in vivo des neurones hypothalamiques à l’aide d’un microscope miniaturisé (miniscope) chez des souris se comportant librement lors de manipulation de l’état social (isolement social et retrouvailles sociales). Cette méthode permet d’imager, à résolution neuronale unique, de l’activité hypothalamique représentant le besoin social et la satiété, permettant des études mécanistes de l’homéostasie sociale.
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Article de méthode
In Vivo Imagerie calcique avec un microscope miniaturisé dans l’hypothalamus pour comprendre les comportements sociaux chez la souris
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le comportement social chez les vertébrés est strictement régulé par des circuits hypothalamiques. Des types de neurones hypothalamiques définis moléculairement ont récemment été identifiés comme codant les besoins sociaux de manière homéostatique. Ici, nous décrivons un protocole étape par étape pour réaliser l’imagerie calcique in vivo dans le noyau préoptique médian hypothalamique (MPN) à l’aide d’un microscope miniaturisé monté sur la tête (miniscope) chez des souris en comportement libre. Cette méthode permet des enregistrements longitudinaux de la dynamique des populations neuronales lors de l’isolement social et des retrouvailles, permettant ainsi des études mécanistes des besoins sociaux et de la satiété sociale à résolution d’un seul neurone. Plus précisément, les souris adultes reçoivent des injections stéréotaxiques d’un virus adéno-associé (AAV) exprimant un indicateur de calcium codé génétiquement dans le MPN, suivies de l’implantation d’une lentille à indice de gradient (GRIN) et d’une plaque de base miniscope. Après la récupération, les souris sont habituées à l’imagerie du miniscope et soumises à un isolement social programmé et à une réunion, durant lesquels les activités neuronales sont imagées. Les signaux calciques sont synchronisés avec les comportements animaux pour une analyse plus approfondie. Ce protocole fournit des conseils complets pour l’imagerie calcique in vivo avec miniscope dans l’hypothalamus de la souris lors des comportements sociaux. Il peut être facilement adapté à l’imagerie dans d’autres régions profondes du cerveau et dans différents contextes comportementaux. Cette approche fait le lien entre l’activité neuronale au niveau cellulaire et le comportement social, faisant progresser notre compréhension de la base neuronale du comportement complexe chez les animaux en mouvement libre.
Introduction
La capacité à maintenir des liens sociaux est fondamentale pour la survie animale 1,2,3. L’isolement social prolongé induit de l’anxiété, des déficits cognitifs et des changements métaboliques, tandis que la réunion restaure l’engagement social et les besoinssociaux 4,5,6. Le rebond observé du comportement social après un isolement social à court terme suggère la présence d’un mécanisme homéostatique7, analogue à la régulation de la faim 8,9 ou de lasoif 10,11,12. Cependant, les substrats neuronaux qui médiatisent l’homéostasie sociale restent mal compris.
Des travaux récents ont révélé que des populations neuronales hypothalamiques distinctes codent respectivement le besoin social et la satiétésociale. 7. L’imagerie calcique in vivo a montré qu’une population de neurones glutamatergiques génétiquement définis dans le noyau préoptique médian (MPN) devient active lors de l’isolement (neuronesd’isolement MPN), tandis qu’une autre population de neurones GABAergiques devient active lors de la réunion (neurones deréunion MPN). L’activation optogénétiquedes neurones d’isolation MPN imite un état d’isolement social, et l’activation optogénétique des neuronesde réunion MPN atténue le rebond social, suggérant leurs rôles opposés dans la régulation des besoins sociaux. Ces populations interagissent réciproquement et se connectent à des circuits neuronaux cérébraux, formant une boucle de rétroaction qui module dynamiquement les besoins sociaux.
Ici, nous présentons un protocole détaillé dont l’objectif global est de permettre aux chercheurs d’enregistrer la dynamique du calcium en profondeur du cerveau à une résolution neuronale unique chez des souris en mouvement libre lors de comportements sociaux éthologiquement pertinents tels que l’isolement social et la réunion13. La combinaison de cette technique d’imagerie avec des paradigmes sociaux éthologiquement pertinents offre une opportunité sans précédent d’étudier la représentation neuronale d’états sociaux distincts. La raison d’être du développement de cette méthode adaptée découle du besoin de visualiser comment le besoin social et la satiété sont dynamiquement représentés dans les structures cérébrales profondes telles que la MPN. Bien que l’utilisation du miniscope ait déjà étédécrite 14, 15, 16, son utilisation lors d’interactions sociales sans restriction, en particulier celles impliquant des transitions entre isolement et retrouvaille, nécessite des adaptations techniques et comportementales spécifiques pour maintenir la stabilité optique, minimiser les artefacts de mouvement et garantir une expression comportementale naturaliste.
Comparée à la photométrie à fibres, l’approche basée sur miniscope offre une résolution cellulaire, permettant de distinguer différents types de neurones fonctionnels dans la même région. Il permet des enregistrements à long terme d’animaux en interaction libre, ce qui est essentiel pour étudier la dynamique neuronale socialement motivée. Des études antérieures utilisant la microendoscopie à un photon se sont principalement concentrées sur le cortex ou l’hippocampe dorsal lors de tâches spatialesou sensorielles 14, 15, 16. Notre protocole étend ces avancées à des régions sous-corticales plus profondes lors de comportements sociaux complexes, fournissant un modèle pour étudier les circuits affectifs dans des conditions naturalistes.
Le protocole est optimisé pour des régions cérébrales allant jusqu’à ~5 mm de profondeur, utilisant l’implantation de lentilles GRIN et des indicateurs de calcium génétiquement codés. Les considérations clés incluent la précision chirurgicale, le positionnement des lentilles, la conception du paradigme comportemental et l’analyse des données associées. Cette méthode peut être adaptée à d’autres zones cérébrales profondes et à des contextes comportementaux. Ce protocole guide les utilisateurs à travers toutes les étapes critiques : préparation chirurgicale, administration virale, implantation de lentilles, conception comportementale, fixation de miniscopes, imagerie et analyse des données (Figure 1A-E). Nous anticipons que ce flux de travail accessible et détaillé permettra l’étude des populations neuronales profondes du cerveau à travers un large éventail de comportements naturalistes.
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Protocole
Toutes les procédures ont été approuvées par le comité d’éthique animale de l’Université Westlake avec le protocole animalier #25-076-LD-9. Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux directives des Ressources animales de laboratoire de l’Université Westlake. Tout l’équipement et les matériaux utilisés dans ce protocole sont listés dans le tableau des matériaux.
1. Chirurgie d’injection virale
- Placez la souris dans une chambre d’induction d’anesthésie avec 2-3 % d’isoflurane.
REMARQUE : Une induction réussie de l’anesthésie est confirmée par l’absence de réflexe de pincement des orteils et la présence d’une respiration régulière et profonde. - Après 2-3 minutes, ou une fois le réflexe de redressement disparu, transférez rapidement l’animal vers l’instrument stéréotaxique. Fixez le nez dans le cône d’anesthésie et maintenez l’anesthésie avec 1-1,5 % d’isoflurane pendant toute la durée de l’opération (Figure 1B). Le débit d’oxygène est généralement réglé entre 0,8 et 1,2 L/min.
REMARQUE : Surveillez la fréquence respiratoire de l’animal et les autres signes physiologiques. Si la fréquence respiratoire de l’animal augmente et présente des moustaches et d’autres signes de réveil, augmentez la concentration d’isoflurane à 2-3 %. - Fixez les dents incisives de la souris à travers la barre incisive de l’instrument stéréotaxique. Serrez la pince de nez pour fixer la tête.
- Insérez soigneusement deux barres d’oreilles dans les conduits auditifs externes jusqu’à ce qu’ils reposent solidement, assurant ainsi une fixation stable et rigide de la tête (Figure 1B).
REMARQUE : (1) Un placement incorrect qui comprime les tissus du cou peut provoquer une détresse respiratoire ou une fixation instable. (2) Si l’animal montre des signes de respiration laborieuse ou de difficulté lors de la fixation, relâcher et repositionner immédiatement les barres d’oreilles, car cela indique une possible compression des voies respiratoires. (3) Assurez-vous que les deux barres d’oreilles soient à la même hauteur. C’est essentiel pour un nivellement précis du crâne par la suite. - Appliquez une pommade ophtalmique sur les deux yeux de la souris pour éviter que les yeux ne sèchent.
- Enlever les poils de la tête avec une crème dépilatoire. Essuyez soigneusement la zone avec des lingettes à l’éthanol à 75 % pour éliminer les résidus de crème et de poils.
- Désinfectez la peau exposée avec des lingettes à l’éthanol à 75 % et du bétadine. Utiliser des ciseaux chirurgicaux fins pour réaliser une incision sagittale médiane à travers le cuir chevelu. Rétractez la peau pour exposer complètement le crâne sur la région cérébrale cible. Nettoyez doucement la surface du crâne avec un coton-tige pour enlever le périoste.
REMARQUE : Exposer une zone suffisamment grande du crâne est nécessaire pour fournir un ancrage solide au ciment dentaire, assurant la stabilité à long terme de l’implant. - Montez une pipette en verre sur le support stéréotaxique pour mesurer la surface du crâne. Au stéréomicroscope, localisez la pointe de la pipette à la bregma (l’intersection des points sagittal et coronal) et fixez-la comme origine (X = 0, Y = 0, Z = 0, Figure 1C).
- Déplacez la pointe de la pipette à des positions latérales de ±2 mm par rapport au bregma et ajustez le niveau du crâne jusqu’à ce que la différence de hauteur entre ces deux points soit inférieure à ±0,03 mm.
- Ensuite, déplacez la pipette vers le lambda (l’intersection des sutures sagittale et lambdoïde) et ajustez l’inclinaison antéropostérieure jusqu’à ce que la différence de hauteur entre bregma et lambda soit d’environ ±0,03 mm (Figure 1C).
REMARQUE : (1) Une évaluation visuelle préalable et un ajustement du crâne pourraient considérablement simplifier le processus de nivellement fin. (2) Sécher la surface du crâne à l’air comprimé avant le nivellement améliore la visibilité des sutures crâniennes. - Utilisez une perceuse portative avec une tête de foreuse de 0,8 mm pour réaliser une craniotomie sur la région cérébrale cible (par exemple, pour les souris C57BL6/J). Les coordonnées sont à 0 mm antérieur-postérieur (AP), à 0,3 mm (ML) et à 4,8 mm au niveau dorsal-ventral (DV) pour cibler la région MPN ; pour les souris FVB/NJ, la craniotomie est réalisée à AP +0,4 mm-+0,5 mm, ML 0,3 mm et DV -4,8 mm) (Figure 1C).
REMARQUE : En cas de saignement, augmentez temporairement la concentration d’isoflurane à 2-2,5 %. Utilisez une pointe de coton stérile ou une éponge hémostatique pour absorber le sang, puis appliquez immédiatement du sérum physiologique stérile. Retournez l’isoflurane au niveau de maintien (1-1,5 %) après l’hémostasie et retirez l’excès de liquide. - Après une craniotomie, effectuer une injection stéréotaxique du virus exprimant l’indicateur calcique dans la région cérébrale ciblée.
- Diluez l’AAV-hSyn-jGCaMP7f, un virus adéno-associé utilisé pour exprimer un indicateur de calcium codé génétiquement dans les neurones et permettre l’imagerie de l’activité neuronale via des signaux calciques, à un titre final d’environ 5 × 10¹² génomes viraux par millilitre avant injection.
- Remplissez d’abord une pipette en verre d’huile minérale, puis la solution virale, en veillant à l’absence de bulles d’air. Positionnez la pipette aux coordonnées de la cible à la surface du crâne et abaissez-la lentement à la profondeur de la cible.
- Injecter le virus unilatéralement à un rythme lent et constant (par exemple, 30 nL/min), avec un volume total de 400 nL7, afin d’assurer l’infection d’un nombre suffisant de neurones dans la région MPN. Cette quantité peut être ajustée en fonction de la taille spécifique des régions cérébrales et de l’existence de contraintes supplémentaires, telles que le système Cre-loxP.
- Une fois terminée, laissez la pipette en place pendant 10 à 15 minutes pour faciliter une diffusion virale adéquate et minimiser le reflux le long de la trajectoire d’injection, avant d’être progressivement retirée.
REMARQUE : (1) Les aliquotes virales avec des titres appropriés et cohérents sont essentielles pour une expression réussie et constante chez les animaux. Un titre excessivement élevé peut provoquer une neurotoxicité, tandis qu’un titre insuffisant conduit à une expression faible et à un faible rapport signal/bruit pour l’imagerie. (2) Une vitesse d’injection lente et un temps d’attente suffisant avant de retirer la pipette sont essentiels pour minimiser les dommages tissulaires et prévenir le reflux viral, garantissant une expression virale précise et robuste dans la zone ciblée. - Après l’injection du virus, recoudez la peau au-dessus du crâne avec des sutures absorbables.
- Injectez du carprofène (5 mg/kg) par voie sous-cutanée immédiatement après l’opération pour l’analgésie, avec une surveillance continue et une administration supplémentaire au cours des 3 jours suivants.
- Hébergez la souris individuellement après une chirurgie d’injection virale pendant au moins 2 à 3 semaines afin de permettre une récupération suffisante de l’animal et une expression virale.
REMARQUE : L’implantation du cristallin GRIN (Section 2) peut être réalisée le jour même que l’injection virale ou 2 à 3 semaines après l’injection. Dans ce protocole, nous décrivons la méthode en deux étapes, qui permet à l’expérimentateur d’évaluer l’expression virale lors de l’implantation du cristallin GRIN.
2. Implantation de lentille GRIN
- Répétez les étapes 1.1-1.10 pour rouvrir la craniotomie. Grattez la surface du crâne avec un scalpel pour mieux saisir le ciment dentaire à l’étape 2.8. Pour la nouvelle craniotomie, le diamètre doit être légèrement supérieur à celui du cristallin GRIN (généralement ~1 mm) afin de permettre une implantation fluide. Dégagez méticuleusement tous les débris osseux après le forage.
- Pour atténuer la compression tissulaire lors de l’implantation du cristallin GRIN, insérez une pipette en verre dans la région cérébrale cible et déplacez lentement la pipette de manière médiolatérale pour créer une incision. Cette micro-découpe mesure ~1 mm de long afin de créer de l’espace pour implanter la lentille GRIN (Figure 2A).
REMARQUE : Cette étape est cruciale pour le succès de l’ensemble du protocole. - Avant d’implanter la lentille GRIN, désinfectez la lentille avec 75 % d’éthanol, puis lavez-la avec du sérum physiologique stérile, et essuyez-la doucement avec du papier de verre.
- Tenez l’objectif GRIN avec un porte-objectif et fixez le miniscope sur le dessus de l’objectif.
- Positionnez l’ensemble de l’ensemble au niveau de la brème et réglez toutes les coordonnées à zéro (c’est-à-dire X = 0, Y = 0, Z = 0). Ensuite, positionnez-la aux coordonnées X-Y de la cible au-dessus de la craniotomie.
- Humidifier la surface du crâne avec du sérum physiologique stérile. Descendez très lentement la lentille GRIN dans le tissu cérébral à un rythme d’environ 100 μm/min jusqu’à ce qu’elle atteigne la cible (Figure 2B).
REMARQUE : (1) Si l’implantation du cristallin GRIN est réalisée 2 à 3 semaines après l’injection virale, lors de l’insertion du cristallin, allumez le miniscope pour observer les changements de fluorescence en temps réel. À mesure que la lentille approche de la région cible, le signal fluorescent global dans le champ de vision devient plus lumineux, et ce changement peut être lu directement en temps réel à partir de l’histogramme du signal grâce au logiciel d’imagerie (Figure 2C, D). (2) Veillez à éviter les saignements lors de l’implantation, car les caillots sanguins dégradent considérablement la qualité du signal. (3) Si le saignement est inévitable et sévère, retirer le cristallin GRIN, nettoyer le cristallin et le réimplanter une fois le saignement cessé. - Après l’implantation du cristallin, séchez soigneusement la surface du crâne en absorbant le liquide résiduel et en soufflant avec de l’air comprimé.
- Appliquez soigneusement du ciment dentaire pour ancrer la base de la lentille GRIN au crâne et construisez une casquette complète qui couvre le crâne exposé (Figure 2B). Veillez à éviter que le ciment ne contacte les tissus musculaires environnants. Ensuite, desserrez délicatement le porte-objectif et retirez-le avec le miniscope.
REMARQUE : (1) Mélangez du ciment dentaire dans une dalle refroidie sur glace pour ralentir le processus de solidification et offrir un temps de travail plus long. (2) Il est recommandé d’ajouter une barre de tête derrière l’objectif pour tenir la souris pendant la connexion du miniscope. (3) Soyez très prudent à ne pas appliquer le ciment sur le porte-objectif ou le miniscope. - Préparez l’adhésif silicone en deux parties en mélangeant ses deux liquides ensemble. Appliquez-le sur le dessus de la lentille GRIN pour former un joint protecteur contre la poussière et les rayures pendant la période de récupération.
- Après l’implantation du cristallin GRIN, hébergez la souris individuellement pour éviter d’éventuels dommages au cristallin par ses compagnons de cage pendant la récupération.
3. Installation de la plaque de base
- Deux à trois semaines après l’implantation de la lentille GRIN, la pose de la plaque de base est effectuée. Anesthésiez et fixez la souris dans l’instrument stéréotaxique comme décrit ci-dessus.
- Retirez le joint en silicone du dessus de la lentille GRIN et nettoyez doucement la surface de la lentille avec un morceau de mouchoir pour lentilles.
- Fixez la plaque de base au miniscope. Montez l’ensemble de la plaque de base microscope sur le bras manipulateur stéréotaxique via un support.
- Connectez le miniscope à la boîte d’acquisition des données et activez l’imagerie en direct.
- Alignez l’objectif du miniscope et la lentille GRIN implantée en ajustant finement le manipulateur pour obtenir un alignement optique coaxial précis entre le miniscope et la lentille GRIN.
- Positionnez l’objectif du miniscope parallèle à la surface supérieure de l’objectif GRIN et assurez-vous que la bordure de l’ensemble de la lentille GRIN est incluse dans la fenêtre d’imagerie avec un aspect parfaitement circulaire, et que le centre de la lentille soit au centre de la fenêtre d’imagerie.
- Abaissez le miniscope à une distance de travail optimale pour obtenir des images claires des neurones dans le plan focal cible.
- Utilisez du ciment dentaire pour relier et encapsuler la plaque de base sur le capuchon de ciment existant (Figure 2B).
REMARQUE : (1) Une étape cruciale consiste à élever le miniscope d’une petite distance empiriquement déterminée (environ 50-100 μm) avant la fixation finale afin de compenser le déplacement potentiel du plan focal causé par le retrait du ciment lors de la solidification. (2) Soyez extrêmement prudent pour empêcher le ciment dentaire de toucher les parties du miniscope qui doivent être détachées après la pose de la plaque de base. - Une fois le ciment dentaire complètement solidifié, desserrez le support, déconnectez soigneusement le microscope de la plaque de base, puis vissez immédiatement un bouchon sur la plaque de base pour protéger l’interface optique.
- Hébergez individuellement la souris pendant 3 à 5 jours après l’installation de la plaque de base, puis réunissez la souris avec ses compagnons de cage pendant au moins une semaine avant manipulation de l’état social (par exemple, isolement social).
4. Habituation et réglage des paramètres d’imagerie
- Habituez les souris implantées à une coiffe temporaire pour la fixation du miniscope et à l’installation d’imagerie 2 à 3 fois avant les séances formelles.
- Pour monter le miniscope sur la plaque de base, attachez la tête des souris implantées, retirez le capuchon de la plaque de base et attachez le miniscope à la plaque de base via une interface magnétique. Ensuite, serrez la vis latérale pour fixer le miniscope. Effectuez une imagerie calcique pendant 10 minutes, période durant laquelle l’animal se déplace librement dans l’aire d’enregistrement ou la cage.
- Introduisez des stimuli, tels qu’un toucher doux et une nouvelle souris, lors de cette séance pilote d’imagerie. Analysez les données (voir détails dans la section 6) pour vérifier si des signaux mononeuronaux pouvaient être extraits. Lors de l’habituation, déterminez les réglages d’imagerie optimaux en ajustant le plan focal du miniscope sur sa distance de travail afin de maximiser le nombre de neurones observés et la netteté de l’image.
- Réglez la puissance d’éclairage à ~10 % de la valeur maximale et le gain du capteur à ~10-20 % de la valeur maximale pour obtenir des signaux clairs sans saturation. Image à la résolution spatiale de 1280 x 800 avec un taux d’échantillonnage de 20 Hz. Enregistrez ces réglages pour chaque animal et réutilisez ces paramètres lors des séances d’imagerie suivantes.
5. Tests comportementaux sociaux pour l’imagerie calcique sur miniscope
- Essai de réunion sociale (Figure 3A)
- Isolez la souris implantée dans un miniscope pendant 1, 3 ou 5 jours avant l’imagerie. Réaliser l’imagerie calcique lors de la phase de départ, la réunion et la réisolation.
- Référence : Connectez la souris au miniscope et enregistrez pendant 10 minutes, pendant lesquelles la souris reste isolée.
- Réunion : Ajoutez un ancien camarade de cage à la chambre d’enregistrement et enregistrez pendant 10 minutes.
- Réisolement : Retirez le colocataire après les 10 minutes de retrouvaille, puis imagez pendant encore 10 minutes pendant le réisolement.
- Essai d’isolement social (Figure 3B)
- Isoler la souris implantée dans un miniscope pendant 6 heures, et enregistrer les signaux calciques au début de chaque heure pendant 15 minutes.
- Ajoutez un ancien camarade de cage à la chambre d’enregistrement et enregistrez pendant 10 minutes à la fin de toute la séance d’imagerie pour identifier les neurones significativement modulés par la réunion sociale (voir les détails dans les sections 6 et 7).
REMARQUE : (1) Ce programme d’imagerie spécifique est utilisé pour minimiser le photoblanchiment du signal et permettre la surveillance de l’activité neuronale durant les 6 premières heures d’isolement social. (2) Le miniscope est connecté tout au long de la procédure. (3) Cette approche permet de suivre le même ensemble neuronal sur toute la séance d’imagerie. (4) Nourriture et hydrogel sont fournis lors de l’imagerie.
6. Prétraitement des données
- Importez des vidéos d’imagerie brutes dans le logiciel de traitement des données.
- Réduisez spatialement et temporellement la vidéo originale lorsque nécessaire pour réduire la charge de calcul nécessaire à l’analyse des données.
REMARQUE : Pour cette analyse, les données d’imagerie brutes sont capturées à une résolution spatiale de 1280 x 800 à 20 Hz ; Réduire spatialement la vidéo par un facteur 4 et la réduire temporellement par un facteur 2. - Appliquer un filtre passe-bande spatiale avec la soustraction moyenne globale pour réduire le bruit de haute fréquence et la dérive de fond basse fréquence.
- Corrigez les artefacts de mouvement en utilisant l’algorithme de correction de mouvement dans le logiciel de traitement des données. Inspectez visuellement le film corrigé de mouvement afin d’assurer la stabilité des somates neuronales et un minimum d’artefacts résiduels de mouvement.
- Cliquez sur le bouton « Identifier les cellules » et choisissez « CNMFe » dans la liste pour extraire les traces d’activité calcique des neurones individuels avec l’algorithme CNMF-E17 (Factorisation de matrice non négative contrainte pour données microendoscopiques).
- Cliquez sur le bouton règle dans le logiciel de traitement des données et mesurez les diamètres des soma (en pixels) à partir de neurones représentatifs. Saisissez la taille moyenne dans la case « Diamètre moyen de la cellule (pixels) ». Puis cliquez sur le bouton Appliquer pour exécuter CNMF-E.
- Ajustez les paramètres d’initialisation du CNMF-E lorsque la détection cellulaire est insuffisante, que des composants non cellulaires excessifs apparaissent ou qu’une sursegmentation survient.
- Inspectez tous les composants extraits et acceptez-les/rejetez-les en fonction de la morphologie cellulaire et de la dynamique du calcium biologiquement plausible. Excluez les composants aux formes irrégulières et pointues. Excluez les traces dominées par le bruit ou les artefacts de mouvement.
REMARQUE : (1) Les figures 2E et 2F montrent deux neurones acceptés avec une morphologie neuronale claire ainsi que les transitoires calciques typiques. (2) Les figures 2G et 2H montrent deux neurones rejetés avec des fluctuations de base prononcées et dépourvus de transitoires calciques typiques. - Exporter les traces de fluorescence des neurones acceptés à partir du logiciel de traitement des données pour l’identification en aval des neurones modulés par l’état social (Section 7).
7. Identifier les neurones modulés par l’état social
- Utilisez MATLAB ou Python pour analyser davantage les données prétraitées.
- Alignez les traces d’activité calcique des neurones acceptés aux horodatages comportementaux.
- Trouvez le moment de la réunion sociale dans la vidéo de comportement. Pour chaque neurone, segmentez l’activité dans une période d’isolement social pré-réunion de 300 s et une période de retrouvailles sociales de 300 s.
- Pour chaque neurone, quantifiez la distribution de l’activité calcique pendant les périodes d’isolement et de réunion.
- Effectuer l’analyse de la caractéristique de fonctionnement du récepteur (ROC)18 pour évaluer la capacité de l’activité neuronale à discriminer entre les états d’isolement et de réunion, ce qui donne une valeur AUC qui calcule la surface sous la courbe ROC.
- Évaluez la signification statistique à l’aide d’un test de permutation. Pour chaque neurone, les valeurs d’activité calcique sont circulairement distribuées entre les états comportementaux dans des compartiments temporels d’un s pendant 1 000 fois afin de générer une distribution nulle des valeurs AUC. Les neurones dont les valeurs d’AUC observées dépassent le 95e percentile de leur distribution nulle mélangée sont considérés comme significativement modulés par l’état social.
- Classifier les neurones significativement modulés selon la direction de modulation. Classez les neurones inhibés par la réunion comme les neurones d’isolation et activés par la réunion comme neurones de la réunion (Figure 4).
8. Vérification post-expérience
- On perfusait les souris et faisait une histologie standard pour vérifier la trajectoire du cristallin GRIN et l’expression virale (voir un exemple d’imagerie histologique à la Figure 2I).
- Utilisez le PFA à 4 % pour fixer toute la tête de la souris avec l’implant, puis retirez la lentille GRIN pour visualiser une piste claire de la lentille.
REMARQUE : N’incluez que les données des animaux avec une cible correcte.
9. Dépannage et conseils pratiques
- Fixez une barre de tête avec du ciment dentaire derrière le miniscope pour faciliter le montage et le retrait du miniscope.
REMARQUE : La barre de tête ne doit pas être trop longue et peut être placée dans un angle légèrement incliné pour éviter toute interférence avec le comportement social. - Hébergez individuellement les souris implantées pendant la période de récupération suivant l’opération pendant au moins une semaine. Cela laisse suffisamment de temps aux souris pour récupérer et évite les dommages causés par d’autres souris.
- Réunissez les souris implantées avec leurs anciens camarades une fois qu’elles sont complètement rétablies. Vérifiez et resserrez régulièrement les capuchons de couverture. Préparez des capuchons de couverture supplémentaires et remplacez-les lorsqu’ils sont perdus lors de l’entretien de l’animal.
- Vérifiez les signaux calciques 3 à 4 semaines après l’injection du virus GCaMP. Si les signaux sont trop faibles ou flous, une période de récupération plus longue améliore parfois la qualité des signaux.
- Faites attention aux surfaces de l’objectif soit du côté GRIN soit du côté du miniscope. Gardez les objectifs propres et exempts de rayures. Couvrez l’objectif quand vous ne l’utilisez pas.
- Avant l’imagerie, ajustez la longueur du câble de signal pour qu’elle soit assez longue pour que l’animal atteigne les coins de l’arène d’imagerie et assez courte pour permettre des interactions sociales fluides.
- Protégez le câble avec une couche de matériau résistant lorsque nécessaire pour éviter les morsures d’autres souris lors des interactions sociales. Vérifiez régulièrement le câble de signal pour surveiller s’il est tordu par une interaction sociale intense.
- Pour identifier le même ensemble neuronal à partir de séances d’imagerie consécutives (par exemple, dans la Figure 3B), les vidéos d’imagerie brute pouvaient être concaténées afin d’extraire des traces de calcium.
- Pour synchroniser plusieurs signaux, par exemple les vidéos comportementales et les signaux calciques, des entrées TTL courantes et des lampes torches synchronisées sont généralement utilisées pour aligner différents fichiers d’enregistrement.
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Résultats
Identification des populations neuronales
Nous avons exprimé le virus GCaMP et implanté une lentille GRIN dans le MPN d’une souris C57BL/6J. Après l’opération, la souris s’est rétablie individuellement et a été réunie avec ses compagnons de cage pendant au moins une semaine. La souris a ensuite été hébergée seule pendant 3 jours avant la séance d’imagerie calcique. Lors de l’imagerie, une base d’isolement de 10 minutes a d’abord été enregistrée, suivie d’une réunion s...
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Discussion
Ce protocole détaille une approche intégrée combinant l’imagerie calcique in vivo dans un miniscope avec des paradigmes comportementaux sociaux pour évaluer le profil d’activité des neurones hypothalamiques. Il permet l’imagerie du calcium à long terme, à résolution cellulaire, provenant de structures cérébrales profondes lors d’interactions sociales naturelles. Les sections suivantes abordent les étapes cruciales, la signification méthodologique, les limites et le potentiel fut...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent ne pas avoir d’intérêt financier concurrent ni de conflit d’intérêts. ChatGPT a été utilisé dans le processus d’édition du manuscrit, avec une relecture minutieuse et détaillée par tous les auteurs.
Remerciements
Nous tenons à remercier la professeure Catherine Dulac pour son soutien à la formation initiale des expériences sur miniscopes et Yang Sun pour son aide dans la réalisation de la chirurgie. Ce travail a été soutenu par le financement initial de l’Université Westlake et le financement de la NOMIS Foundation, du Tan-Yang Center for Autism Research de l’Université Harvard, du Jane Coffin Childs Medical Research Award à D.L., et de la bourse postdoctorale Charles A. King Trust à D.L. Nous remercions tous les membres du Liu Lab pour leurs commentaires sur le manuscrit.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| AAV2/9-hSyn-jGCaMP7f-WPRE-pA | Taitool | S0587-9 | Vecteurs viraux, chirurgie |
| Éponge gélatine hémostatique absirbable | FUKANGSEN | FKS-A | Chirurgie |
| Solution de bétadine (10 % iodé Povidone) 500 mL | HYNAUT | Q13702855HNW002 | Chirurgie |
| Caméra pour la vidéo comportementale | DAHENG | MER2-160-227-U3C | Comportement |
| Carprofène | MCE | HY-B1227 | Chirurgie |
| Instruments stéréotaxiques numériques | Propulsion | 68803 | Chirurgie |
| Éthanol (75 %) | Sinopharm chemical reagent co., Ld | 801769610 | Chirurgie |
| Pommade pour les yeux | FODU | H37022025 | Chirurgie |
| Logiciel de traitement de données Inscopix (IDPS) | Inscopix | 1000-006551 | Analyse des données |
| Isoflurane | Propulsion | R510-22-10 | Chirurgie |
| Pack adhésif Kwik-Sil de 2 | Instruments de précision mondiaux | KWIK-SIL | Chirurgie |
| Microdrill | Propulsion | 78001 | Chirurgie |
| Extracteur de micropipettes MP-1000 | Propulsion | MP-1000 | Chirurgie |
| Solutions multifonctionnelles d’anesthésie animale | Propulsion | TAIJI-IE | Chirurgie |
| Pompe à microinjection de nanolitres | Propulsion | R-480 | Chirurgie |
| Miniscope nVista 3.0 | Inscopix | 1000-004323 | Imagerie |
| Pince optalmique | Propulsion | F12006-10 | Chirurgie |
| Ciseaux d’opération | Propulsion | S14001-15 | Chirurgie |
| Kit d’implant ProView | Inscopix | 1000-004238 | Chirurgie et imagerie |
| Ciment en résine (Super-liaison) | Sun Medical | Super bond C & B | Chirurgie |
| Ensemble de 5 caches de base | Inscopix | 1050-004639 | Imagerie |
| Jeu de 5 plaques de base | Inscopix | 1050-004638 | Imagerie |
| Ensemble de 5 objectifs GRIN, diamètre de 0,6 mm, longueur de 7,3 mm | Inscopix | 1050-004626 | Chirurgie et imagerie |
| Microscope stéréo-taxe | Murzider | MSD205A | Chirurgie |
| Solution saline stérile | QIDUKELIN | R1B25071902 | Chirurgie |
Références
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