Article de méthode

Isolement et purification des îlots pancréatiques à partir de rats de Lewis grâce à la digestion enzymatique et à la séparation par gradient de densité

DOI :

10.3791/70414

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3 avril 2026

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1Center for BioNanoengineering, Houston Methodist Research Institute, 2School of Medicine and Health Sciences, Tecnologico de Monterrey, 3Department of Applied Science and Technology, Politecnico di Torino, 4Diabetes Research Institute, University of Miami Miller School of Medicine, 5Department of Surgery, Houston Methodist Hospital, 6Department of Radiation Oncology, Houston Methodist Hospital

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit une méthode standardisée pour la prélèvement chirurgical, la digestion enzymatique et la purification par gradient de densité des îlots pancréatiques de rat Lewis, permettant des préparations à haut rendement et à haute pureté pour une utilisation directe dans des études de transplantation ou in vitro .

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les îlots pancréatiques sont essentiels tant pour la transplantation clinique que pour les études précliniques visant à comprendre les mécanismes et la progression du diabète. Cependant, les progrès dans ces domaines sont souvent limités par la disponibilité d’îlots de haute qualité, car les stratégies thérapeutiques émergentes nécessitent des préparations plus grandes, plus propres et plus standardisées. Cet article présente un protocole standardisé à haut débit pour la prélève chirurgicale, la digestion enzymatique et la purification par gradient de densité des îlots pancréatiques issus des rats Lewis. La méthode combine la perfusion intraductale du pancréas avec un mélange enzymatique défini, la digestion conjointe de plusieurs pancréas et la séparation basée sur la densité afin de maximiser le rendement tout en minimisant la fragmentation et en éliminant le besoin de sélection manuelle régulière. Le rendement des îlots est quantifié à l’aide de deux approches complémentaires : une méthode traditionnelle de comptage basée sur des aliquotes, couramment utilisée en milieu clinique, et une méthode semi-automatisée basée sur l’imagerie de toute la préparation. Dans une isolation représentative à partir de 12 pancréas, le comptage manuel a donné environ 3 300 équivalents d’îlots (IEQ) et 2 700 îlots absolus par pancréas (~39 600 IEQ totaux), avec une répartition de taille de 62 % (50-100 μm), 17 % (100-150 μm), 10 % (150-200 μm), 5 % (200-250 μm) et 6 % (>250 μm). En comparaison, l’analyse automatisée de préparation globale a rapporté 16 350 QI totaux (1 362 QI/pancréas), mettant en lumière une variabilité inhérente à la quantification basée sur les aliquotes. Les préparations ont atteint une pureté de 98 % par coloration au dithizone, et la viabilité des îlots a été maintenue à 98 % in vitro les jours 3 et 7 après l’isolement. L’évaluation fonctionnelle par sécrétion d’insuline stimulée statiquement par glucose a montré une augmentation de 10 fois la libération d’insuline après une stimulation d’une heure avec 16,7 mM de glucose. Dans l’ensemble, ce protocole offre une approche reproductible et efficace pour générer des préparations d’îlots de haute pureté, fonctionnellement intactes, pouvant être utilisées immédiatement sans nettoyage supplémentaire. Les îlots conservent une fonction robuste en culture jusqu’à sept jours, ce qui permet une flexibilité pour des tests in vitro à grande échelle ainsi que pour des études de transplantation in vivo .

Introduction

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La transplantation d’îlots pancréatiques représente une stratégie viable pour restaurer la production d’insuline endogène chez les personnes atteintes de diabète de type 1 (DT1)1. Au-delà du DT1, la biologie des îlots est de plus en plus pertinente pour le diabète de type 2 (DT2), une affection caractérisée par une dysfonction progressive et une perte des cellules β, ainsi que pour les patients subissant une pancréatectomie partielle ou totale pour pancréatite chronique, tumeurs pancréatiques ou traumatismes. Dans ces contextes, l’accès à des îlots de haute qualité est essentiel pour faire progresser les thérapies cellulaires, modéliser l’échec cellulaire β, étudier les interactions îlot-immunité et îlot-stromal, et développer des approches régénératricesémergentes 2. Par conséquent, des procédures robustes et reproductibles d’isolement des îlots sont essentielles pour soutenir à la fois la recherche mécanistique et le développement translationnel dans un large éventail de troubles endocriniens pancréatiques.

Bien que les îlots représentent moins de 2 % de la masse pancréatique, ils jouent un rôle disproportionné dans l’homéostasie du glucose. Leur vulnérabilité intrinsèque à l’hypoxie, à la surdigestion enzymatique, au stress oxydatif et au cisaillement mécanique les rend particulièrement sensibles aux blessures liées àl’isolement 3,4,5. Même des écarts subtils de température, d’oxygénation ou de manipulation tissulaire peuvent altuer le couplage stimulus-sécrétion β cellule ou déclencher une apoptose, en raison de défenses antioxydantes limitées et d’une forte demandemétabolique 6,7. En conséquence, la plupart des protocoles conventionnels mettent l’accent sur une utilisation rapide en aval, généralement dans les 24 à 48 heures suivant la récolte, tant en clinique qu’expérimental,dans les contextes 8,9,10,11,12. Bien que ce cadre « d’utilisation immédiate » minimise la détérioration, il limite la flexibilité expérimentale, entrave les études longitudinales et complique les efforts pour accumuler un nombre suffisant d’îlots pour de grands essais in vitro ou des expériences de transplantation in vivo.

Parmi les modèles de rongeurs, les rats Lewis sont largement utilisés pour la recherche sur les îlots en raison de leur origine génétique consanguine, de leur profil immunitaire stable et de leurs caractéristiques physiologiquesreproductibles 14. Les différences dépendantes de la souche en termes de rendement, de réactivité et de résilience des îlots sont bien documentées. De Groot et al. ont démontré que les îlots de rats Lewis présentent une sécrétion d’insuline stimulée par le glucose supérieure à d’autres souches, soulignant leur adéquation pour des études fonctionnelles, métaboliques et detransplantation 15. Des travaux supplémentaires ont confirmé leur fiabilité pour la recherche immunologique et allo-/xénotransplantation 14,15,16. Cependant, dans les laboratoires, la variabilité du rendement, de la pureté et de la fonction des îlots reste un obstacle important. Une grande partie de cette variabilité provient d’incohérences dans le mélange d’enzymes, les techniques de perfusion intraductale, la manipulation du pancréas, le timing de la digestion et la stratégiede purification 17.

Pour remédier à ces limites, nous avons développé un protocole reproductible étape par étape pour la prélèvement chirurgical, la digestion enzymatique et la purification par gradient de densité des îlots pancréatiques issus de rats Lewis. Ce flux de travail est optimisé pour maximiser le rendement, minimiser la fragmentation et préserver la viabilité fonctionnelle. Il est important de noter qu’elle établit des repères clairs, incluant les équivalents d’îlots (IEQ), la viabilité dans le temps, la pureté et la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose, qui permettent aux chercheurs de distinguer de manière fiable les isolements réussis des isolementssous-optimaux 18,19,20. En améliorant à la fois le rendement et la longévité, le protocole renforce la flexibilité expérimentale et peut réduire le nombre d’animaux donneurs requis, soutenant ainsi une conception expérimentale plus éthique et évolutive.

Distincte de nombreuses approches traditionnelles, la méthode actuelle démontre que les îlots de rats de Lewis peuvent être maintenus en culture jusqu’à 7 jours avec une viabilité et une fonction préservées, ce qui élargit leur utilité pour des études in vitro prolongées. Le protocole intègre en outre une stratégie de traitement groupé rationalisée capable de traiter jusqu’à 30 pancréas en un seul lot, permettant une digestion uniforme et réduisant la variabilité entre échantillons. Avec une pureté endocrinienne atteignant 98 %, la procédure élimine le besoin d’un triage manuel laborieux et réduit les risques de contamination microbienne. Comparé aux méthodes de digestion en une seule étape ou en masse qui produisent fréquemment des préparations impures ou mécaniquementcompromises 13, ce flux de travail à haut débit produit de manière fiable un grand nombre d’îlots propres et de qualité transplantation, adaptés aux tests in vitro , au profilage métabolique et aux études de transplantation in vivo .

Protocole

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Toutes les procédures ont été approuvées par le Houston Methodist Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC, protocole #IS00007362) et menées conformément au Guide des National Institutes of Health for the Care and Use of Laboratory Animals et à la loi sur le bien-être animal.
REMARQUE : Les matériaux et instruments utilisés tout au long du protocole se trouvent dans le Tableau des matériaux.

1. Préparation avant la récolte et le jour de l’isolement

  1. Préparez les solutions suivantes dans des conditions aseptiques à l’intérieur d’un cabinet de biosécurité (voir Tableau 1) et conservez toutes les solutions à 4 °C jusqu’à utilisation.
    Solution de rinçage de la pénicilline-streptomycine (Pen-Streptococ).
    Un média de lavage.
    Amortissement des tampons.
    Culture des îlots médiatiques.
    Tampon de Krebs.
  2. Stérilisez les outils et équipements par autoclavage.
    1. Pack chirurgical de prélèvement du pancréas autoclave : rideaux chirurgicaux, gaze, pinces tissulaires dent-rat, pinces plates, pinces fines courbées, ciseaux cutanés, ciseaux micro-disséquants, deux petits hémostaux et un hémostat courbé.
      REMARQUE : Autoclave pour prélèvement de deux pancréas pour les packs chirurgicaux s’il y a deux opérateurs chirurgicaux.
    2. Pack chirurgical de nettoyage du pancréas autoclave : pinces fines courbées et ciseaux micro-disséquables.
    3. Autoclave une feuille de feuille d’aluminium de 30 cm x 30 cm.
    4. Autoclave 1-6 600 mL et 1 L de gobelets, selon le nombre de pancréas à traiter ( voir Tableau 2).
    5. Autoclave un tamis de 500 μm.
    6. Autoclave deux aiguilles spinales de 14 G, au cas où l’une d’elles se boucherait avec du pancréas non digéré.
    7. Autoclave un tube de seringue pour chaque seringue de 50 mL requise (voir Tableau 3).
  3. Préparez le bain-marie pour la digestion.
    1. Remplissez le bain-marie équipé d’un vibrateur orbital avec de l’eau ultrapure autoclavée jusqu’à ce qu’il soit à 3/4 de pouce au-dessus du niveau de la plateforme.
    2. Ajoutez 3 ml de solution antimicrobienne et gardez le couvercle fermé pour minimiser la contamination.

2. Préparatifs le jour de la récolte et de l’isolement

  1. Préparez des seringues à gradient.
    1. Retirez les solutions de gradient d’îlots 1,108 g/cm³, 1,096 g/cm³ et 1,069 g/cm³ préparées et utilisées dans les étapes suivantes ainsi que l’étape 5.2 de « Purification des îlots » du stockage à 4 °C, et laissez-les s’équilibrer à la température ambiante (environ 1 h).
      REMARQUE : Le volume de gradient requis variera selon le nombre de pancréas à traiter ; se référer au tableau 3 pour garantir des volumes décongelés adéquats de certains gradients.
    2. Préchargez et étiquetez les seringues de 50 mL avec des gradients de 1,096 g/cm³ et 1,069 g/cm³.
      1. Mélangez vigoureusement les solutions de gradient de densité de 1,069 et 1,096 g/cm³.
      2. Chargez les volumes appropriés, selon le tableau 3, dans des seringues de 50 mL équipées de tubes chirurgicaux et d’une aiguille de 16 G.
      3. Après le remplissage, bouchez les aiguilles pour maintenir la stérilité et mettez les seringues de côté pour une utilisation ultérieure dans l’étape 5.5 de la « Purification des îlots ».
    3. Conservez un gradientde 3 g/cm à température ambiante jusqu’à une utilisation ultérieure.
  2. Préparez une solution enzymatique de dissociation de travail (WDM), chargez dans des seringues pour la perfusion et des béchers autoclavés.
    1. Travailler dans des conditions stériles dans un cabinet de biosécurité et garder toutes les solutions sur glace.
    2. Dégeler des aliquotes de collagénase, thermolysine et DNase I sur glace.
    3. Diluez des réactifs enzymatiques dans un bécher stérile de 1 L en utilisant le WDM pour obtenir les concentrations finales suivantes : collagénase 0,15 mg/mL, thermolysine 5 μg/mL, et DNase I 0,1 mg/mL (Tableau 2).
    4. Mélangez doucement le WDM en faisant un mouvement tourbillonnant 10 fois. Ne pas mélanger avec une pipette ; Conserver l’activité enzymatique en les faisant doucement tourner.
    5. Un par un, chargez 10 mL de la solution enzymatique WDM dans chaque seringue de 10 mL à l’aide d’une aiguille de 16 G pour un remplissage rapide, puis remplacez par une aiguille de 25 G x 1/2" avec bouchon pour une perfusion pancréasale ultérieure.
    6. Enveloppez les seringues chargées avec du papier aluminium autoclavé et laissez-les poser sur de la glace jusqu’à utilisation.
    7. Distribuez l’excédent de WDM de manière égale dans des béchers stériles de 600 mL pour retenir le pancréas récolté selon le Tableau 2. Couvrez chaque bécher de papier aluminium stérile et laissez-le sur la glace (Tableau 2).
  3. Préparez l’espace de travail en culture cellulaire.
    1. Allumez le vibrateur de bain-marie orbital, réglé à 130 tr/min et 37 °C. Laissez ainsi pendant la récolte du pancréas.
    2. Placez les objets suivants sous lumière UV dans l’armoire de biosécurité pendant 1 heure pour une stérilisation supplémentaire.
      Tamis stérile de 500 μm.
      Bécher stérile de 1 L.
      Pompe à seringue.
    3. Assurez-vous que l’incubateur de culture cellulaire est réglé à 25 °C 5 % de CO2.
    4. Réglez la centrifugeuse à 4 °C, avec l’accélération et la décélération à 9.
  4. Rassemblez les matériaux pour le prélèvement et rendez-vous en salle d’opération.
    1. Nettoyant désigné pour le pancréas :
      1. Rassemblez un grand seau à glace pour contenir le nombre requis de béchers WDM de 600 mL et la solution de rinçage du pancréas ( voir Tableau 1 et Tableau 2).
      2. Rassemblez 1 boîte de Petri stérile pour chaque 6 pancréas à transformer.
      3. Rassemblez 1 ciseau micro-disséquable stérile et 2 petites pinces courbées et délicates.
    2. Moissonneur désigné pour le pancréas :
      1. Rassemblez une trousse chirurgicale stérile de prélèvement.
      2. Rassemblez des gants chirurgicaux stériles.
      3. Rassemblez un bac à glace avec des seringues WDM de 10 mL préchargées, scellées dans du papier aluminium autoclavé.
  5. Dans la salle d’opération, préparez la station de prélèvement du pancréas.
    1. Allumez le stérilisateur à billes de verre pour stériliser les outils chirurgicaux en les immergeant pendant 1 minute dans le stérilisateur entre chaque animal. Les instruments peuvent être refroidis rapidement par immersion dans un PBS stérile 1x.
    2. Placez un tampon absorbant sous le champ de vision du microscope pour détecter tout sang ou solution enzymatique WDM qui fuit.
    3. Réglez le microscope sur un grossissement total de 6,3x entre les lentilles oculaires et objectives.
    4. Ouvrez la trousse chirurgicale et enfilez des gants chirurgicaux stériles en utilisant une technique aseptique.
    5. Procédez à la prélève chirurgicale.
  6. Dans la salle d’opération, préparez la station de nettoyage du pancréas.
    1. Verser suffisamment de solution de Pen-Strep pour remplir la moitié d’une boîte de Pétri de 100 mm (environ 6 mL) afin d’immerger le pancréas isolé et de la poser sur la glace.
    2. Ouvrez la trousse chirurgicale et enfilez des gants chirurgicaux stériles en utilisant une technique aseptique.
  7. Dans la salle d’opération, préparez la chambre d’euthanasie.
    1. Placez les bacs de réservoir dans une cage vide, propre et re-scellable.
    2. Remplissez les plateaux à moitié remplis d’isoflurane.
    3. Placez le plateau perforé sur les réservoirs pour éviter les déversements pendant que les rats sont placés à l’intérieur.
    4. Scellez le dessus de la chambre avec le couvercle de la cage.
  8. Passez à la récolte du pancréas.

3. Récolte du pancréas

  1. Placez les rats un par un dans la chambre d’euthanasie sur le plateau pour éviter une surdose rapide d’isoflurane.
    REMARQUE : Le temps d’euthanasie requis pour le rat varie, surtout à mesure que l’isoflurane s’évapore.
  2. Confirmez l’absence de pouls et de respiration pour chaque rat.
  3. Confirmez l’euthanasie par une méthode secondaire qui ne perturbe pas la cavité abdominale (par exemple, une ponction cardiaque).
    REMARQUE : D’autres méthodes primaires d’euthanasie sont acceptées ; Cependant, une surdose d’isoflurane est préférée, car une euthanasie rapide minimise l’hypoxie des îlots.
  4. Vaporisez le poil abdominal de chaque rat avec 70 % d’éthanol pour s’emmêler et éviter les poils lâches dans le champ chirurgical.
  5. Placez le rat euthanasié allongé sous le microscope avec la tête distale par rapport à l’opérateur. Assurez-vous que la cavité abdominale supérieure est sous le champ de vision du microscope.

Figure 1
Figure 1 : Exposition chirurgicale et perfusion intraductale du pancréas du rat. Illustration des étapes clés de l’exposition et de la perfusion du pancréas à travers le sphincter d’Oddi. (A) Euthanasie d’un rat Lewis avec la cavité abdominale ouverte. (Aa) Pose de pince du canal biliaire commun et de la veine hépatique. (B) Vue agrandie du duodénum montrant des hémostaux marquant la région du sphincter d’Oddi. (Bb) Aiguille de perfusion positionnée dans le canal pancréatique principal. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

  1. Récolter le pancréas (rôle du moissonneur) :
    1. Réaliser une incision en « V », à l’aide de ciseaux cutanés, en partant de la symphyse pubienne vers chaque cage thoracique latérale pour accéder à la cavité abdominale ( voir Figure 1A).
    2. Rétractez les intestins grêles et gros du côté gauche de l’animal à l’aide de pinces plates pour dégager l'« espace de travail » de la cavité abdominale.
    3. Dépliez le duodénum à l’aide de pinces plates et d’hémostrates courbés. Assurez-vous que le canal biliaire commun et la veine porte hépatique sont dans le champ de vision du microscope.
    4. Rétractez le céphale hépatique et pinchez le canal biliaire commun et la veine hépatique à l’aide des hémostats courbés. Pincer 1 à 2 mm du foie (voir Figure 1Aa).
      REMARQUE : Les étapes 3.6.1-3.6.4 et 3.6.8 peuvent être effectuées par visualisation directe. Utilisez le microscope pour toutes les autres étapes afin d’assurer une manipulation délicate des tissus.
    5. Sous la vue du microscope, à l’aide de la pince plate et des hémostats plats, mobilisez doucement le contenu du duodénum pour éliminer le sphincter d’Oddi.
      REMARQUE : Assurez-vous que le contenu en duodénum est déplacé du site d’insertion prévu de l’aiguille.
    6. Isolez la région entourant le sphincter d’Oddi en serrant doucement le duodénum avec les hémostats plats à environ 5 mm de chaque côté du sphincter. Assurez-vous d’une compression minimale pour préserver l’intégrité des tissus ( voir Figure 1B).
    7. À l’aide d’une seringue WDM stérile, insérez soigneusement l’aiguille à travers la paroi duodénale, faites-la passer par le sphincter d’Oddi, puis avancez dans le canal pancréatique principal pour la perfusion ( voir Figure 1Bb).
      1. Dès que l’aiguille traverse le sphincter d’Oddi, en maintenant une pression constante, perfusez 7 à 10 mL de WDM dans le pancréas à un débit d’environ 500 μL/s jusqu’à ce que le pancréas soit complètement distendu.
        REMARQUE : Assurez-vous que le biseau est relevé et que l’aiguille est parallèle au canal pancréatique pour minimiser les traumatismes. Commencez à injecter immédiatement après l’insertion. Cela aidera à dilater le sphincter et le conduit, facilitant ainsi l’avancement de l’aiguille. Le pancréas est considéré comme complètement distendu lorsque la queue du pancréas, située près de la rate, devient visiblement perfusée.
    8. Exciser le pancréas en le disséquant doucement pour l’extraire des structures environnantes dans l’ordre suivant : rate, estomac, gros intestin, duodénum et mésentère.
      REMARQUE : Utilisez une dissection contondante pour minimiser les dommages tissulaires. Procéder séquentiellement pour maintenir une orientation anatomique et réduire la tension sur les connexions vasculaires et canalales.
      1. Retirez les deux hémostaux plats du duodénum.
      2. Utilisez la pince plate pour pincer le ligament splénopancréatique (qui relie le pancréas à la rate) et appliquez une traction douce.
      3. À l’aide de pinces de dissection fine courbées, mobilisez soigneusement et séparez le pancréas des attaches splénique adjacentes.
      4. Détacher le pancréas de l’estomac en soulevant le tissu pancréatique avec des pinces fines courbes et en appliquant une contre-traction douce avec une pince plate.
      5. Ensuite, avec la pince plate, appliquez une traction ferme pour éliminer le gros intestin du pancréas.
      6. Soulevez l’intestin grêle à l’aide de pinces plates et disséquez le mésentère du pancréas à l’aide de pinces fines courbes.
      7. Soulevez doucement le pancréas perfondu avec la pince plate et utilisez les ciseaux fins à dissection pour couper les dernières attaches au tissu conjonctif.
    9. Transférez immédiatement le pancréas excisé dans une boîte de Petri contenant une solution de rinçage glacée, puis prélevez immédiatement le pancréas suivant, pendant que le nettoyant commence le nettoyage du pancréas.
  2. Nettoyez le pancréas (rôle de nettoyeur pancréasé) :

Figure 2
Figure 2 : Nettoyage du pancréas de rat perfusé. Visualisation séquentielle du pancréas avant et après l’extraction de tissu non essentiel. (A) Pancréas perfusé immédiatement après la dissection, avec le tissu adipeux adjacent, les ganglions lymphatiques et les structures conjonctives visibles. (B) Pancréas perfusé avec des repères anatomiques majeurs indiqués. (C) Pancréas nettoyé après l’élimination de tissu excédentaire, montrant l’apparence finale avant la digestion. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

  1. Utilisez les pinces fines courbes et les ciseaux de dissection fine pour découper soigneusement les ganglions lymphatiques, le tissu adipeux, le mésentère et les gros vasculaires du pancréas perfusé, si présents ( voir Figure 2).
  2. Transférez le pancréas nettoyé dans un bécher stérile de 600 mL contenant 25 mL de WDM froid. Couvrir le bécher avec du papier aluminium stérile pour préserver la propreté entre le transfert de l’atelier chirurgical à celui de culture cellulaire.
    1. Remplacez la solution de rinçage dans la boîte de Petri tous les 6 pancréas pour éviter toute contamination.
    2. Notez le moment où le premier pancréas est posé sur la glace. Cela servira à documenter le temps d’ischémie froide.
  1. Une fois que tous les pancréas sont prélevés et nettoyés, passez rapidement à la phase de digestion dans l’espace de travail de culture cellulaire.

4. Digestion du pancréas

  1. Mettez en pause les rotations du shaker orbital et fixez le(s) bécher(s) couvert(s), contenant le pancréas, dans les supports désignés du bain-marie.
  2. Rapidement, redémarrez le vibrateur orbital réglé à 130 tr/min et lancez un minuteur de 10 minutes pour le temps de digestion (voir Figure 3A).
    NOTE : Notez ce point comme la fin de la période d’ischémie froide. Consignez chaque récolte d’îlots avec son temps total correspondant d’ischémie froide dans un registre de laboratoire.
  3. À la 5e minute, faites tourner manuellement le bécher dans le sens des aiguilles d’une montre, puis dans le sens antihoraire pour faciliter la dissociation des tissus.
  4. À la marque des 8 minutes, récupérez la solution de trempe du stockage frigorifique et transférez-la dans l’armoire de biosécurité pour une utilisation immédiate ultérieure ( voir Tableau 1).
  5. À la marque des 10 minutes, transférer et immerger rapidement les béchers dans la glace pour ralentir l’activité enzymatique ( voir Figure 3B).
    REMARQUE : À partir de ce moment, manipulez tous les tissus, cellules et solutions sur de la glace pour les préserver jusqu’à l’étape 4.20 en utilisant les gradients de densité à température ambiante.
  6. Transférez l’extérieur du bécher et le plateau dans un placard de biosécurité.
  7. Ajoutez un tampon de trempe à un rapport 1:1 avec la solution dans le bécher pour arrêter la digestion (environ 75-100 mL par bécher).
  8. Aspirez et expulsez la suspension tissulaire doucement et de façon répétée à l’aide d’une seringue de 50 mL équipée d’une aiguille spinale de 14 g pour dissocier les gros fragments tissulaires ( voir Figure 3C).
  9. Transférez la suspension dans des tubes coniques de 200 mL.
  10. Rincez le bécher avec 5 mL de substrat à lavage et décantez dans le tube conique de 200 mL contenant la digestion de l’îlot pour collecter les restes de digestion.
  11. La centrifugeuse se digère à 200 × g pendant 5 minutes à 4 °C. Veillez à utiliser des adaptateurs et coussins adaptés pour la bouteille centrifugeuse pour la sécurité.
  12. Découssez soigneusement le surnageant et resuspendez le pellet dans 100 mL de substrat à lavage à l’aide de la même aiguille spinale de 14 g qu’auparavant.
  13. Filtrez la suspension à travers un tamis stérile de 500 μm placé sur un bécher stérile de 600 mL pour éliminer tout gros tissu non digéré.
    REMARQUE : Si la perfusion et le nettoyage du pancréas ont été effectués de manière optimale, un minimum de tissu adipeux et aucun pancréas non perfusé resteront sur le tamis.
  14. Rincez le tamis avec 10 mL de substrat de nettoyage pour récupérer les tissus piégés.
  15. Transférez le filtrat dans de nouveaux tubes coniques de 200 mL.
  16. Centrifugez à 200 × g pendant 5 minutes à 4 °C.
  17. Décantez le surnageant et resuspendez la pellete dans un milieu de lavage de 100 mL à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL.
    REMARQUE : Assurez-vous d’une perte cellulaire minimale en pré-humidifiant les pointes de pipette avec un tampon contenant FBS avant l’exposition aux îlots.
  18. Centrifugez à 600 × g pendant 5 minutes à 4 °C.
  19. Aspirez soigneusement le surnageant pour obtenir un pellet sec.
  20. Réglez la température de la centrifugeuse à 22 °C en préparation de la séparation du gradient.
    REMARQUE : Cela peut être accéléré en faisant tourner la centrifugeuse à 2000 x g pendant 15 minutes à 22 °C, sans échantillons.

5. Purification des îlots

  1. Consultez le tableau 3 pour déterminer le nombre de tubes coniques de 50 mL requis.
    REMARQUE : Consultez le tableau 3 pour répartir uniformément le volume total des granules, afin de répartir environ 2 à 3 mL de digestion des granules dans chaque tube de gradient. Si une séparation faible des bandes d’îlots est observée plus tard, utilisez des tubes à gradient supplémentaires pour améliorer la résolution de séparation.
  2. Préhumidifier une pointe de pipette sérologique de 10 mL avec la solution de gradient de densité de 1,108 g/cm³ pour empêcher les îlots d’adhérer à la surface interne de la pointe.
  3. Resuspendez chaque granule de tissu dans 15 mL de solution en gradient de 1,108 g/cm³ pour 2 mL de volume de pellets à l’aide de la pipette sérologique pré-humidifiée de 10 mL. Bien que le volume total dépasse 10 mL, la plus petite largeur de pipette facilite un mélange plus contrôlé et une dissociation efficace des granules. Mélangez doucement jusqu’à ce qu’il soit uniforme.
  4. Distribuez 15 mL de la suspension de la cellule au fond de chaque tube conique de 50 mL avec précaution, en évitant le contact avec les parois du tube pour assurer des niveaux de gradient propres.
  5. En utilisant les seringues à gradient préchargées, superposez séquentiellement 10 mL de gradient de 1,096 g/cm³, suivis de 10 mL de gradient de 1,069 g/cm³.
  6. Dispensez chaque gradient à un débit de 5 mL/min à l’aide d’une pompe à seringue, en positionnant la pointe de l’aiguille de 16 G contre la paroi interne du tube pour éviter le mélange de gradient.
  7. Centrifugez les tubes à 700 × g pendant 15 minutes à 22 °C, avec l’accélération de la centrifugeuse réglée à 3 et la décélération à 0 pour éviter le mélange de gradient.
    REMARQUE : Compte tenu du temps de décélération prolongé, l’ensemble du cycle de centrifugation dure environ 45 minutes. Surveillez attentivement le temps, car les îlots doivent être collectés rapidement pour éviter le mélange de gradients et les dommages cellulaires potentiels. Si nécessaire, préparez un ou plusieurs tubes de contrepoids par poids, et non par volume, pour tenir compte des différences de densité. Après avoir retiré les tubes, réinitialisez la centrifugeuse à 4 °C, puis accélérez et décélérez à 9 pour les étapes suivantes.
  8. Après centrifugation, identifiez la couche d’îlots située aux interfaces entre les couches de gradient 1,069-1,096 g/cm³ et 1,096-1,108 g/cm³ (voir Figure 3D).
  9. Aspirez et éliminez soigneusement tout tissu collecté à la couche supérieure à l’aide d’une pipette Pasteur préhumidifiée avec un substrat de lavage.
  10. Humidifier une autre pipette Pasteur, recueillir la couche d’îlots, puis la transférer dans un tube conique pré-refroidi de 200 mL contenant 5 mL de substrat de lavage.
  11. Augmentez le volume du tube conique pré-refroidi de 200 mL à 200 mL avec un produit de lavage.
  12. Centrifugez à 600 × g pendant 5 minutes et décantez le surnageant.
  13. Résuspendez le pellet dans 30 mL de substrat à lavage à l’aide d’une pointe sérologique préhumidifiée de 10 mL.
  14. Transférez la resuspension dans un nouveau tube conique de 50 mL à l’aide d’une pointe sérologique préhumidifiée de 10 mL pour un meilleur pelletage sur les îlots.
  15. Rincez le même tube conique de 200 mL avec 20 mL de substrat de lavage et transférez dans le tube conique de 50 mL contenant les îlots restants.
  16. Centrifugez la conique de 50 mL avec îlots et milieu de lavage à 300 × g pendant 5 minutes à 4 °C.
  17. Décantez le surnageant et resuspendez la pellete d’îlot dans 50 mL de milieux de culture d’îlots ( voir Tableau 1).
    REMARQUE : Retirez les aliquotes de 100 μL lors de cette étape si vous comptez des îlots avec la méthode de quantification manuelle.
  18. Placez uniformément les îlots en boîtes de Pétri de 100 mm non traitées par culture tissulaire, en utilisant une plaque pour chaque cinq pancréas de rat Lewis traités.
    1. Calculez le volume total de milieux d’îlots requis à l’aide de la formule (nombre de pancréas ÷ 5 × 10 mL).
    2. Résuspendez la pastille d’îlot à moitié du volume calculé du milieu, puis répartissez uniformément la suspension sur le nombre déterminé de plaques.
    3. Rincez le tube conique de 50 mL contenant les îlots résiduels avec la moitié restante du média calculé et pipettez ce lavage sur les mêmes plaques pour atteindre un volume final de 10 mL par bol ( voir Figure 3E).
  19. Incubez toute la nuit à 25 °C dans 5 % de CO₂. Ajoutez 3 mL de substrat de culture d’îlots toutes les 24 heures à côté de chaque boîte de Petri, puis faites doucement tourner pour reconstituer le substrat.
  20. Procédez au comptage des îlots (étape 6).

Figure 3
Figure 3 : Digestion du pancréas et purification des îlots isolés. Images représentatives des étapes séquentielles allant de la digestion du pancréas en pool à la purification des îlots. (A) Concentration de pancréas perfusés avant la digestion enzymatique. (B) Pancréas fragmentés après digestion enzymatique. (C) Suspension uniforme des tissus, post-mécanique. (D) Tubes à gradient de densité avant centrifugation (à gauche) et après centrifugation (à droite), avec la bande d’îlots visible à l’interface du gradient entourée. (E) Image de champ clair des îlots du jour 0 immédiatement après la collecte. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

6. Comptage des îlots

  1. Collectez la quantification manuelle des îlots.
    1. À l’étape 5.16, retirez trois aliquotes de 100 μL de la suspension des îlots à l’aide d’une pipette de 200 μL et des pointes normales de 200 μL.
      REMARQUE : Assurez-vous que les îlots sont également suspendus dans le milieu grâce au mélange de pipettes, lorsque des aliquotes sont prises pour mesure.
    2. Transférer chaque aliquote dans sa propre boîte de Petri grillée de 2 mm × 2 mm contenant 1 mL de PBS à 1×.
    3. Comptez les îlots sous un microscope inversé, en les cataloguant par diamètre avec un insert de lentille réticule d’oculaire.
      REMARQUE : Tous les îlots ne seront pas circulaires ; respecter les mesures horizontales ou verticales pendant le comptage.
    4. Calculez le nombre total d’équivalents d’îlots de 150 μm à l’aide du tableau de conversion standardisé (voir Tableau 4).
      REMARQUE : Comparez le QI de chaque échantillon. Si le QI des aliquotes diffère de plus de 30 %, procédez à la moyenne des aliquotes les plus similaires.

7. Précautions de sécurité

  1. Effectuer toutes les interventions chirurgicales et de manipulation des tissus dans des conditions aseptiques à l’intérieur d’un cabinet de biosécurité, lorsque cela est approprié. Utilisez des équipements de protection individuelle (EPI), y compris des lunettes de sécurité, des blouses de laboratoire, des gants et des masques chirurgicaux, lors de la manipulation des réactifs et des tissus.
  2. Effectuer la prélèvement du pancréas dans des conditions stériles avec des outils chirurgicaux et des équipements de protection adéquats. Manipuler l’isoflurane et d’autres anesthésiques conformément aux directives de l’établissement pour éviter toute exposition à l’inhalation.
  3. Éliminer les tissus animaux, les objets tranchants et les déchets biologiques en conformité avec les protocoles de biosécurité institutionnels. Maintenir les réactifs enzymatiques et les matériaux biologiques sur la glace, sauf indication contraire afin de préserver l’activité et la viabilité.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les résultats suivants représentent une isolation typique d’îlots réalisée selon la méthode décrite, avec douze pancréas de rat Lewis traités en parallèle.

Répartition des rendements et des tailles

Comptage manuel des aliquotes et conversion IEQ

Deux aliquotes indépendantes de 100 μL ont été obtenues à partir de la suspension mixte des îlots, comme décrit dans la section « Comptage des îlots », étape 6.1, et comptées par compartiments de diamètre (50-100 μm, 100-150 μm, 150-200 μm, 200-250 μm, 250-300 μm, 250-300 μm). Les comptages ont été convertis en équivalents d’îlots (IEQ ; référence de 150 μm) à l’aide de tables d’équivalence standard et extrapolés au volume total de suspension (voir Figure 4A). Sur l’isolation de l’essai (n = 12), le rendement était de 3330 IEQ/pancréas avec un diamètre médian de l’îlot dans la boîte de 50-100 μm. Répétez les aliquotes concordées par 18,8 % par bin (coefficient de variation), indiquant une variation modérée mais attendue grâce à l’utilisation de méthodes de comptage manuelles. Au cours des 14 précédentes isolations d’îlots, cette méthode a produit en moyenne 1353 IEQ/pancréas (SD 607).

Quantification automatisée de la plaque entière

Pour évaluer l’IEQ manuel, des images en champ clair ont été obtenues en D1 à l’aide d’un microscope et assemblées pour générer des composites à plat entier (objectif 4× ; exposition 1/100 s). Le dimensionnement automatisé et la quantification des objets ont été réalisés en utilisant Fiji et un codage avec un seuil de taille prédéfini de 50 à 600 μm. Les images ont d’abord été prétraitées pour réduire la variation de fond et améliorer l’uniformité du contraste. Les structures des îlots ont été identifiées en fonction des différences d’intensité par rapport aux tissus environnants, générant des masques d’objets binaires. Les îlots adjacents ou partiellement en contact étaient séparés pour éviter la sous-estimation du nombre d’objets. Les objets hors de la plage de taille spécifiée ont été exclus pour éliminer les débris et les tissus non islots. Pour chaque objet retenu, des paramètres morphométriques, y compris la surface et les diamètres des axes x et y, ont été extraits. Les îlots étaient ensuite regroupés par diamètre, et l’IEQ était calculé en multipliant le nombre d’îlots dans chaque boîte de taille par le facteur de conversion correspondant. Le dimensionnement automatisé a donné 98 832 objets au total, avec des diamètres moyens des axes x et y de 117 μm et 116 μm respectivement, et un total estimé à 16 350 QI, ce qui est fortement corrélé avec une QI manuelle mesurée à D0 (Spearman r = 0,937, p = 0,0048 ; voir Figure 4A-C).

Perte de cellules des îlots

Des images de la plaque entière ont été prises 2 heures après la purification puis à nouveau au jour 1 (D1), en utilisant la même méthodologie dans la « quantification automatisée de la plaque entière » pour évaluer la stabilisation précoce des îlots (« shedding »). Le nombre d’objets a changé de 0,9 % et l’IEQ de -6,11 % entre 2 h et D1 ( voir Figure 4D). La comparaison par paires des diamètres des îlots entre D0 et D1 a montré une diminution médiane statistiquement significative de 2 μm (test de Wilcoxon signed-rank, p = 0,0136, n = 2820). Cependant, l’ampleur de ce changement est peu susceptible d’avoir une signification biologique ou clinique.

Figure 4
Figure 4 : Évaluation quantitative de la répartition de la taille des îlots, de la corrélation et de la chute précoce des îlots. Résumé graphique des mesures des îlots obtenues par analyses manuelles et automatisées. (A) Distribution de la taille des îlots du jour 0 (D0) basée sur la quantification manuelle à travers des compartiments IEQ équivalents aux îlots standardisés. (B) Jour 1 (D1) Distribution de la taille des îlots déterminée par des mesures automatisées basées sur des images dans les mêmes compartiments standardisés de taille IEQ. (C) Corrélation des comptages entre la quantification manuelle de D0 et la quantification automatisée de D1 à travers les compartiments de taille IEQ. (D) Diagramme en boîte de la répartition des diamètres des îlots entre D0 et D1 pour des mesures automatisées de la même plaque. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Pureté (contenu endocrinien vs. exocrine)

Coloration à la dithizone (DTZ)

Sur D1, une aliquote d’îlots (n = 451) a été colorée avec DTZ pendant 30 s à température ambiante et immédiatement imagée à l’aide de microscopie en champ clair (objectif 4× ; exposition 1/20 s). Aux Fidji, les pixels de fond ont été supprimés de sorte que la surface restante corresponde à la surface totale des îlots. Les régions tissulaires exocrines DTZ négatives, identifiées par un contraste de couleur plus foncé, étaient sélectionnées manuellement à l’aide d’un outil lasso, et la zone de chaque région d’intérêt était automatiquement enregistrée en pixels. La pureté endocrinienne a été calculée comme le pourcentage de pixels DTZ positifs par rapport au total des pixels des îlots, donnant une pureté de 98,56 ± 0,38 % (Figure 5A).

Viabilité et performance fonctionnelle

Sécrétion d’insuline stimulée par le glucose (GSIS)

À chaque moment (D1, D3, D7), 15 îlots de taille correspondante étaient choisis à la main et placés dans des puits individuels d’une plaque à 24 puits, préparés en quadruplicate. Les îlots ont été incubés à 37 °C 5 % deCO2 dans un tampon de Krebs selon un protocole de stimulation de glucose faible-élevé-bas : d’abord en glucose bas (2,8 mM, 60 min), suivis d’un taux élevé de glucose (16,7 mM, 60 min, voir Tableau 1). Les fractions d’effluent ont été collectées à la fin de chaque période d’incubation, et les concentrations d’insuline ont été quantifiées à l’aide d’un test ELISA sur l’insuline de rat. Les indices de stimulation ont été calculés comme le ratio de sécrétion d’insuline lors de conditions de glucose élevé à basse. Les indices de stimulation étaient de 9,37, 8,34 et 6,7, respectivement aux jours 1, 3 et 7, sans différences significatives (Figure 5B).

Taches vivantes/mortes

Aux D1, D3 et D7, 15 îlots ont été soigneusement sélectionnés et teintés avec le kit de viabilité Live/Dead selon les instructions du fabricant. En résumé, des îlots ont été incubés dans la solution de coloration Live/Dead pendant 30 minutes à 25 °C, puis imagés sous des réglages de microscope cohérents pour garantir la comparabilité entre les temps (objectif 4X ; exposition 1/30 s, filtres Texas Red et GFP). La viabilité a été quantifiée à l’aide d’un script Python utilisant scikit-image pour la segmentation des îlots et la mesure de fluorescence. Les îlots ont été identifiés en combinant les canaux de fluorescence vert et rouge, en appliquant la méthode de seuil de Li pour générer un masque binaire, et en utilisant la segmentation des bassins versants pour séparer les îlots en contact. Les objets ont été filtrés par surface pour exclure les débris et les artefacts. Pour chaque îlot, la viabilité était calculée comme le pourcentage de densité intégrée vivante (pixels verts) par rapport à la densité intégrée totale (pixels verts plus rouges). Les résultats ont montré une viabilité de 68 ± 9 % à D1, 98,2 ± 0,6 % à D3 et 100 % à D7. Un échantillon témoin positif traité à 70 % d’éthanol pendant 10 minutes a montré une viabilité de 2,7 ± 7,2 % (voir Figure 5C-F).

Figure 5
Figure 5 : Évaluation de la pureté, de la viabilité et de la réactivité fonctionnelle des îlots. Images représentatives et résumés quantitatifs des caractéristiques des îlots isolés au fil du temps. (A) Image représentative en champ lumineux de 10× des îlots colorés à la dithizone (DTZ), montrant des îlots endocriniens teintés de rouge et des tissus exocrines non colorés. (B) Valeurs de sécrétion d’insuline stimulée par le glucose (GSIS) de l’indice de stimulation à glucose élevé/faible glucose (HG/LG) pour les jours 1, 3 et 7. (C-E) Images fluorescentes vivantes/mortes des îlots au jour 1 (C), jour 3 (D) et jour 7 (E). (F) Image fluorescente vivante/morte d’îlots témoins positifs traités à l’éthanol. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

(A) Supports de lavage
ComposantConcentration finaleMontant (mL)
RPMI 1640-500 mL
Sérum fœtal bovin10%50 mL
Streptococcique de la pénétocoque (10 000 U/mL)1%5,5 mL
HEPES25 mM12,5 mL provenant d’un stock 1M
L-glutamine2 mM5 mL provenant d’une crosse de 200 mM
(B) Médias de la culture des îlots
ComposantConcentration finaleQuantité (mL ou g)
RPMI 1640, pas de glucose-500 mL
Sérum fœtal bovin10%50 mL
Streptococcique de la pénétocoque (10 000 U/mL)1%5,5 mL
HEPES20 mM11 mL provenant d’un stock 1M
Sodium Pyruvate1 mM5,5 mL à partir de 100 mM
Glucose5,5 mM2,75 mL à partir de 200 g/L
(C) Solution de rinçage de pénicilline-streptomycine
ComposantConcentration finaleQuantité (mL ou g)
Solution saline, 0,9 %-500 mL
Streptomycine pénicilline (10 000 U/mL)2%10 mL
(D) Tampon d’extinction
ComposantConcentration finaleQuantité (mL ou g)
HBSS-500 mL
Sérum fœtal bovin20%100 mL
HEPES (1 M)2.50%2,5 mL
(E) Tampon de Krebs
ComposantConcentration finaleQuantité (mL ou g)
dH2O-975 mL
NaCl115 mM6,72 g
NaHCO324 mM2,02 g
KCl5 mM0,3728 g
HEPES (1 M)25 mM25 mL
MgCl21 mM0,0952 g
BSA0.10%1 g
CaCl22,5 mM0,2775 g

Tableau 1 : Liste des solutions. Détails de composition et de préparation pour toutes les solutions utilisées tout au long du protocole d’isolation et de purification des îlots. Chaque sous-section liste les composants, les concentrations finales, les volumes de préparation et les numéros de catalogue. (A) Substrat de lavage, utilisé pour rincer et laver les tissus pendant la digestion et la purification. (B) Milieux de culture d’îlots, utilisés pour l’entretien et la viabilité après l’isolement des îlots. (C)Solution de rinçage pénicilline-streptycine, utilisée pour stériliser et rincer les crécréas récoltés. (D) Tampon de tremption, utilisé pour interrompre la digestion enzymatique et préserver la viabilité cellulaire. (E) Tampon de Krebs, utilisé lors des tests de sécrétion d’insuline stimulée par le glucose (GSIS).

Nombre de pancréasCollagénase (15,38 mg/mL)Thermolysine (1 mg/mL)ADNase (100 mg/mL)Tampon de fonctionnement600 mL de béchers à utiliserVolume/Beaker
304,5 mL2,25 mL450 μL450 mL525 mL
243,6 mL1,8 mL360 μL360 mL425 mL
203 mL1,5 mL300 μL300 mL325 mL
162,4 mL1,2 mL240 μL240 mL225 mL
121,8 mL0,9 mL180 μL180 mL225 mL
101,5 mL0,75 mL150 μL150 mL225 mL
Concentration finale.0,15 mg/mL5 mg/mL0,1 mg/mL

Tableau 2 : Solution enzymatique digestive par quantité de pancréas. Des volumes de collagénase, de thermolysine et de DNase ont été nécessaires pour préparer le Milieu de Dissociation Working (WDM) pour différents nombres de pancréas de rats. Les concentrations finales de chaque enzyme sont listées en bas du tableau.

Nombre de pancréasTubes numéros 50 mLVolume/ seringueNombre de 1,096 seringuesNombre de 1,068 seringues
3010 tubes50 mL22
248 tubes40 mL22
206 tubes30 mL22
164 tubes40 mL11
124 tubes40 mL11
102 tubes20 mL11

Tableau 3 : Charge en gradient par quantité pancréastique. Nombre de tubes coniques de 50 mL et de volumes de gradient correspondants nécessaires à la purification des îlots en fonction du nombre de pancréas traités.

Plage de diamètre des îlots (μm)Nombre de particules d’îlots (IA)Facteur de conversion IEQIEQ par plage
50-100a* 0.167a * 0,167
101-150b* 0.648b * 0,648
151-200c* 1.685c * 1,685
201-250d* 3.500d * 3.500
251-300e* 6.315e * 6.315
301-350f* 10.352f * 10.352
> 350g* 15.833g * 15.833

Tableau 4 : Conversion d’équivalence des îlots. La conversion des diamètres des îlots varie en équivalents standardisés des îlots (IEQ). Le tableau liste les compartiments de diamètre d’îlots observés, le nombre de particules d’îlots par plage, le facteur de conversion IEQ correspondant pour chaque plage de taille, et la contribution IEQ résultante par plage.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit une approche à haut débit pour isoler et purifier les îlots pancréatiques des rats Lewis. Le succès de la méthode dépend de plusieurs étapes critiques qui préservent collectivement l’intégrité et la fonction des îlots. Parmi ceux-ci figurent la perfusion intraductale précise et complète du pancréas, le nettoyage soigneux du pancréas perfusé, ainsi que le temps exact de digestion enzymatique. Une perfusion cohérente de l’organe entier est cruciale pour obtenir une distension uniforme du pancréas et assurer une distribution uniforme du mélange collagénase-thermolysine-DNase, qui agit respectivement pour digérer la matrice extracellulaire, améliorer la pénétration enzymatique et réduire la viscosité médiée parl’ADN 21,22. La sous-perfusion peut entraîner une digestion incomplète des tissus et la perte d’une partie importante des îlots, car le tissu sous-digéré est filtré par le tamis. De même, un retrait insuffisant du tissu adipeux ou vasculaire avant la digestion peut introduire des impuretés non endocriniennes qui réduisent la pureté. Enfin, une digestion prolongée entraîne la déségrégation des îlots due à une rupture excessive de la matrice extracellulaire, tandis qu’une digestion sous-optimale produit des tissus non digérés résistants à la digestion mécanique par aiguille spinale. Ces étapes représentent les pièges techniques les plus fréquents et doivent être soigneusement surveillées lors de la formation et de l’optimisation.

Bien que cette méthode ait été conçue spécifiquement pour les rats Lewis, elle peut probablement être adaptée à d’autres souches ou espèces par une réoptimisation mineure du temps de digestion et du ratioenzymatique 23,24,25,26. Certains laboratoires peuvent choisir d’ajuster le ratio de collagénase, de thermolysine et de DNase I dans le Milieu de Dissociation de Travail (WDM) afin d’optimiser le rendement selon les caractéristiques spécifiques de leur lot enzymatique ou de leur tissu. Pour ce faire, les laboratoires peuvent suivre attentivement le guide étape par étape du fabricant pour l’optimisation des enzymes et des tissus et, dans tous les cas, éviter d’ajouter des composants tels que 0,1 M EDTA, cystéine, mercaptoéthanol, inhibiteurs de protéase, sérum ou albumine, car ceux-ci pourraient inhiber la collagénase, la thermolysine et l’activité enzymatique DNase1 27. Bien qu’aucun temps de travail définitif pour le mélange enzymatique avant la dissociation n’ait été publié, des données antérieures montrent que la conservation prolongée au froid du pancréas affecte négativement le rendement et la fonction desîlots 28. Empiriquement, nous avons constaté que, dans notre protocole, les isolements réussis étaient systématiquement obtenus lorsque le temps total d’ischémie froide, défini comme l’intervalle entre la pose du premier pancréas sur la glace pour le nettoyage et son transfert dans le bain-marie à 37 °C, était maintenu sous 1,5 heure. Une optimisation supplémentaire de ce paramètre peut être justifiée selon l’application utilisateur final.

Malgré sa robustesse, ce protocole présente plusieurs limites pratiques et techniques. Premièrement, le mélange enzymatique (collagénase, thermolysine et DNase I) et les gradients de densité sont essentiels pour une dissociation tissulaire efficace et l’isolement des îlots, tout en imposant un coût important. Notre sélection de la combinaison enzymatique a été informée par les caractéristiques structurelles de la matrice extracellulaire pancréatique et la nécessité d’équilibrer une dissociation tissulaire efficace avec la préservation de l’intégrité des îlots. Chaque composant enzymatique joue un rôle distinct : la collagénase cible les collagènes fibrillaires et de la membrane basale pour libérer les îlots ; la thermolysine, une protéase neutre, fend les protéines de la matrice non collagénique et les molécules d’adhésion cellule-cellule, réduisant l’exposition nécessaire à la collagénase ; et la DNase I minimise la viscosité causée par l’ADN libéré par les celluleslysées 29,30,31. Bien que des formulations d’enzymes digestives à moindre coût soient disponibles dans le commerce, leur pureté est variable et peut compromettre la performanceenzymatique 13,23. Étant donné que la collagénase est isolée à partir de cultures bactériennes, des étapes supplémentaires de purification réduisent la contamination par les endotoxines mais augmentent considérablement le coût13,23.

Pour la collagénase, nous recommandons des préparations avec une activité d’environ 2 000 à 4 000 unités Wünsch par flacon, ce qui favorise une dissociation efficace à dosage modéré tout en évitant une digestion prolongée. Notamment, le mélange doit inclure un ratio équilibré de collagénase de classe I à classe II, correspondant à une fraction de collagénase II/collagénase totale d’environ 0,3-0,5. Ce ratio assure une forte activité collagénolytique tout en limitant la dégradation excessive de la matrice extracellulaire non collagéniteuse. De plus, le mélange de collagénase doit être complété par un niveau modéré d’activité protéasée neutre (environ 150 000 à 250 000 unités) et de DNase, pour les raisons déjà évoquées.

D’un point de vue contrôle qualité, chaque lot doit inclure une documentation d’une faible charge en endotoxines (≤50 EU/mg de protéines), une haute pureté enzymatique (≥85 % par HPLC) et une activité vérifiée de lot à lot, car la pureté et la composition des enzymes peuvent varier considérablement selon le fabricant. Enfin, des variations dans la composition des lots peuvent affecter la consistance de la digestion et le rendement des îlots, nécessitant la validation interne spécifique à chaque lot. Cette validation peut être réalisée en suivant les conditions de digestion standardisées décrites dans ce protocole et en évaluant ensuite l’efficacité digestive et la morphologie des îlots. Les indicateurs de performance sous-optimale des enzymes incluent une dissociation tissulaire incomplète, des îlots avec des bordures irrégulières ou rugueuses, ou la nécessité d’un cisaillement mécanique excessif pour obtenir la séparation, auquel cas une titration du temps de digestion peut être nécessaire.

Des considérations similaires s’appliquent aux gradients de densité. Nous avons sélectionné un gradient à base de polysacchrose, un copolymère saccharose-épichlorohydrine non ionique et fortement hydrophile qui forme des gradients stables allant jusqu’à 1,2 g/mL et possède un long historique d’isolementd’îlots 32,33. L’iodixanol est une alternative bien validée, et des études sur des îlots humains montrent que les gradients à base d’iodixanol peuvent améliorer la récupération des îlots tout en maintenant leur viabilité et leur fonction 34,35,36,37. Cependant, les données sur les rongeurs sont non concluantes, certaines études rapportant de meilleurs résultats utilisant l’iodixanol tandis que d’autres démontrent une meilleure viabilité et fonction avec des gradients à base de polysacchrose32,35. Il est essentiel de recommander l’utilisation de solutions de gradient fabriquées commercialement et contrôlées de qualité afin d’améliorer la reproductibilité dans les laboratoires. Les gradients à base de polysaccharose sont largement disponibles à des densités optimales pour l’isolement des îlots, tandis que les gradients d’iodixanol sont généralement préparés par dilution interne, introduisant une variabilité supplémentaire. Une seconde limitation est que la prélèvement chirurgical nécessite un haut niveau de compétence technique, en particulier pour la perfusion intraductale via le sphincter d’Oddi et l’excision rapide du pancréas. Même des retards ou un désalignement mineurs peuvent entraîner des lésions tissulaires, des fuites, une perfusion inégale ou une ischémie chaude prolongée, ce qui peut compromettre le rendement et la viabilité des îlots. Pour atténuer cette limitation, le protocole inclut des descriptions procédurales détaillées et des aides graphiques originales avec des repères anatomiques codés par couleur pour faciliter la compréhension. Les nouveaux opérateurs sont encouragés à se familiariser avec la technique de perfusion avant d’effectuer des isolements complets, et il est conseillé de pratiquer sur les carcasses avant de tenter des récoltes vivantes.

Troisièmement, pour une efficacité maximale, ce protocole nécessite un travail d’équipe coordonné. Lors de la prélèvement du pancréas et de la digestion enzymatique, trois opérateurs formés sont généralement nécessaires : l’un pratiquant la chirurgie stérile, un nettoyant le pancréas dans des conditions stériles, et un pour la circulation et l’euthanasie des animaux dans des conditions non stériles. Après la digestion, les étapes de purification en aval peuvent généralement être effectuées par moins d’opérateurs une fois la compétence atteinte. Bien que cette coordination représente une demande logistique initiale, elle permet d’isoler de nombreux îlots de plusieurs animaux en un délai relativement court, améliorant ainsi le débit global par rapport à des flux de travail moins coordonnés. Bien que ce protocole soit techniquement exigeant et gourmande en ressources, ces limitations sont communes à toutes les méthodes d’isolement des îlots. En mettant l’accent sur des conditions de digestion standardisées, une formation structurée et une exécution coordonnée, cette approche à haut débit peut réduire le temps et la main-d’œuvre par isolement et produire des résultats cohérents et reproductibles lorsqu’elle est réalisée par une équipe formée.

Comparée aux protocoles d’isolation conventionnel des îlots de rongeurs, cette méthode offre des avantages substantiels en termes de débit, de reproductibilité et de cohérence. Les digestions traditionnelles monoorganiques reposent fortement sur le picking manuel et produisent souvent une puretévariable 13. En revanche, notre protocole utilise une digestion groupée et une purification par gradient de densité, réduisant considérablement le temps de préparation et la variabilité entre échantillons tout en maintenant une viabilité élevée des îlots et une réactivité fonctionnelle. Les îlots isolés ont été globalement caractérisés pour leur morphologie (coloration de dithizone), leur viabilité (test vivant/mort) et leur fonction (sécrétion d’insuline stimulée par le glucose), confirmant la robustesse de la méthode. Collectivement, ce flux de travail standardisé permet la génération de préparations abondantes, propres et fonctionnelles d’îlots adaptées aux applications en aval, incluant l’encapsulation, la transplantation et la modélisation microphysiologique 38,39,40. Il est important de noter que les îlots de rats de Lewis isolés avec cette technique ont inversé le diabète dans des modèles précliniques, soulignant la pertinence translationnelle de cette approche reproductible et évolutive41.

Déclarations de divulgation

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A.G. est cofondateur et conseiller scientifique principal de Continuity Biosciences, LLC. A.G., J.P-M. et C.Y.X.C. sont des inventeurs de propriétés intellectuelles sous licence de Continuity Biosciences, LLC. Tous les autres auteurs déclarent ne pas avoir d’intérêts concurrents.

Remerciements

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Cette étude a été soutenue par les National Institutes of Health (NIH) R01DK133610-01 (A.G., N.K.) et NIH NIDDK R01DK132104 (A.G.), Breakthrough T1D SRA-2021-1078-S-B (AG) et SRA-2022-1224-S-B (A.G., N.K.), ainsi que par la Vivian L. Smith Foundation.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
21 G x 2 in. BD PrécisionAiguille glissanteBD305129
500 & micro ; m Cadre en laiton et tamis en acier inoxydable 304, 3 » de diamètre x 1 » de profondeur (Numéro de tamis 35)McMaster-Carr34735K525
Seringues stériles Air-Tite, verrou LuerFisher Scientific14-817-178
Biogel PI UltraTouch MMö ; Inlycke42665
Bonn Scissors ; Droit ; Pointes tranchantes ; Longueur de pale de 15 mm ; Longueur totale de 3 1/2"RobozRS-5840
Braintree Scientific GERMINATOR 500 DRY STERILFisher ScientificNC9956482
Série Cell-IQ 5,8 pi³. Incubateur de laboratoire CO2PHCBIMCO-170AICUVHL-PA
Plat de culture Corning 100 mm Non traité à TCCorning430591
Sérum fœtal bovin de Corning, 500 mL, régulier, testé de sécurité USDA (inactivation thermique)Corning35011CV
Gradient de l’îlot de Corning 1,069 (densité 1,069 g/cm3)Corning99-815-CISDemande spéciale de la part de l’entreprise
Gradient des îlots de Corning 1,096 (densité 1,096 g/cm3)Corning99-691-CISDemande spéciale de la part de l’entreprise
Gradient de l’îlot de Corning 1,108 (densité 1,108 g/cm3)Corning99-692-CISDemande spéciale de la part de l’entreprise
Sous-coussinets Covidien TendersorbFisher Scientific22-225-102
DNase I Grade IIRoche10104159001
Falcon  ; Tubes centrifugeuses coniques de 50 mLFisher Scientific14-432-22
Feuille d’aluminium Fisherbrand, rouleau à écartement standardFisher Scientific01-213-100
Fisherbrand  ; Éponges non tissées en gazeFisher Scientific22-028-559
Béchers en verre réutilisables Fisherbrand à faible porteFisher ScientificFB101600
Mircoscope de fluorescence   ; BZ-X810KeyenceBZ-X810
Glucose SolutionGibcoA2494001
Porte-aiguille micro HalseyOutils scientifiques finement12500-12
HBSS, calcium, magnésium, pas de rouge phénoléGibco14025092
HEPES (1 M)Gibco15630080
Pinces hémostatiques Classic Crile 5-1/2 pouce de longueurMcKesson1231217
Pinces Hudson (Ewald)RobozRS-5238
Monoject à aiguille hypodermique de 1,5 pouce de longueur, paroi régulière de calibre 16 sans sécuritéMcKesson43481
L-Glutamine (200 mM)Gibco25030081
Liberase T-Flex, qualité de rechercheRoche5989132001
Kit de viabilité VIVANT/MORT/Cytotoxicité, pour cellules de mammifèresInvitrogen  ; L3224
Logiciel MATLABMathWorkshttps://www.mathworks.com/pricing-licensing.html?prodcode=ML
NE-4000 Pompe à seringue programmable à deux canauxPompe à seringueNE-4000-US
AIGUILLE, HYPO FORCE DISP 27GX1/2" (100/BX) EXLINTMcKesson408877
Culture cellulaire/Plaques de Petri NuncThermo-Sciences174926
Microscope à contraste de phase inversé Olympus CKX41OlympeCKX41-B
PBS, pH 7,4Gibco10010023
Pénicilline Streptomycine (10 000 U/mL)Gibco15140122
RPMI 1640Gibco11875093
RPMI 1640, pas de glucoseGibco11879020
Pyruvate de sodium (100 mM)Gibco11360070
Pyruvate de sodium (stock de 100 mM)Gibco11360070
Sorval ST 16RThermo-Sciences75004381
Aiguille de seringue 304 en acier inoxydableMilipore SigmaZ117013-1EA
DRAPE CHIRURGICAL, JETABLE, 36 IN X 100 YDCovetrus10408
Ciseaux chirurgicaux - ToughCutOutils scientifiques finement14054-13
Pinces de pansement pour pouce de 4,5", délicate de 1,3 mm de largeur de pointeRobozRS-8120
Tube centrifugeuse Thermo Scientific Nunc 200 mLThermo-Sciences14-962-17
Adaptateurs et coussins pour bouteilles centrifugeuses Thermo Scientific NuncThermo-Sciences12-565-283B
TSDUB15 15L Dubnoff Baigne-Marie SecouanteFisher Scientific300610298
TX-400 Rotor à seau oscillant 4 x 400 mLThermo-Sciences75003181
Tygon S-50-HLTygonAAXoooo3
Kit ELISA d’insuline ultra-sensible pour ratsChimie en Cristal90060

Références

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Mots-clés

Purification d lotslots de rats Lewistransplantation d lotsviabilit des lotsmarquage la dithizones cr tion d insuline stimul e par le glucosefonction des cellules b ta

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