Comparaison des résultats de l'analyse de l'ADN des spermatozoïdes à l'aide de différentes stratégies de sélection en cytométrie de flux

Summary

Le passage polygonal (PGG) et le passage en forme de croix (CFG) sont des méthodes de cytométrie en flux pour détecter l'intégrité de l'ADN des spermatozoïdes. PGG mesure l'indice de fragmentation de l'ADN (DFI) et l'indice élevé de coloration de l'ADN (HDS). CFG rapporte un DFI sévère, un DFI léger et un DFI global. Cette étude vise à comparer les résultats et les corrélations entre eux.

Abstract

L'intégrité de l'ADN des spermatozoïdes est un facteur clé pour assurer une fécondation réussie, le développement de l'embryon et la poursuite de la grossesse. L'évaluation de la structure du chromatine des spermatozoïdes (SCSA) utilisant la cytométrie en flux après dénaturation de l'ADN et coloration à l'orange d'acridine est considérée comme la méthode de référence pour évaluer l'ADN des spermatozoïdes. Deux stratégies de passerelle pour l'évaluation par cytométrie en flux de l'indice de fragmentation de l'ADN des spermatozoïdes (DFI) ont été rapportées dans la littérature : le gating polygonal (PGG) et le gating en forme de croix (CFG). L'objectif de la présente étude était de comparer les relations des résultats des tests entre PGG et CFG, et d'analyser leurs corrélations avec les paramètres de l'analyse de base du sperme. Les données obtenues indépendamment par les deux méthodes ont été comparées en utilisant une analyse statistique, y compris les graphiques de Bland-Altman et l'analyse de régression. Un total de 121 patients masculins ambulatoires subissant une évaluation de la fertilité dans le centre de reproduction de notre hôpital ont été sélectionnés par une méthode d'échantillonnage complètement aléatoire. Le DFI des spermatozoïdes et les indicateurs connexes ont été détectés par cytométrie en flux en utilisant respectivement PGG et CFG. Les résultats ont démontré que les valeurs DFI obtenues par les deux méthodes montraient un bon accord. Les coefficients de corrélation entre DFIp de la méthode PGG et DFIm, DFIs et DFIc de la méthode CFG étaient respectivement de 0,6497, 0,9404 et 0,9667 (tous p < 0,01). Un indice de coloration d'ADN élevé (HDS) a montré une légère corrélation négative avec DFIs (r = -0,3042, p < 0,05). Le pourcentage de spermatozoïdes en mouvement progressif était négativement corrélé avec DFIp, DFIs et DFIc (r = -0,3824, -0,3794, -0,3574, respectivement, tous p < 0,05). Aucune corrélation significative n'a été observée entre HDS et volume de sperme, concentration des spermatozoïdes, nombre total de spermatozoïdes ou PR (%). Ces résultats indiquent que DFIs sont plus étroitement associés à la fertilité masculine, suggérant que la méthode CFG, qui fournit ce paramètre, peut être plus appropriée pour l'évaluation clinique des dommages à l'ADN des spermatozoïdes.

Introduction

L'intégrité de l'ADN des spermatozoïdes fait référence à l'intégrité et à la stabilité fonctionnelle de la structure moléculaire de l'ADN dans le noyau du spermatozoïde. Plus précisément, elle est caractérisée par une conformation normale de la chromatine, des séquences de bases intactes sans rupture ou dommages oxydatifs, et la capacité à transmettre avec précision l'information génétique à la progéniture. Pendant la spermatogenèse, lorsque le stress oxydatif augmente¹, le remodelage de la chromatine est anormal², ou le spermatozoïde est affecté par des toxines environnementales³, l'intégrité de l'ADN des spermatozoïdes sera endommagée, entraînant un désappariement des bases, une perte, une modification, l'ajout d'ADN et la formation de liaisons croisées, des ruptures simple et double brin, etc. De plus, l'ADN des spermatozoïdes endommagé peut altérer la fertilité masculine et affecter négativement les résultats de la grossesse dans le cadre de la procréation médicalement assistée (PMA)⁴, tout en augmentant le risque de fausses couches récurrentes⁵. En 2021, l'Association Européenne d'Urologie (EAU) a recommandé l'inclusion du test DFI dans le système d'évaluation de la fertilité masculine⁶.

À l'heure actuelle, l'intégrité de l'ADN des spermatozoïdes est principalement évaluée en détectant l'indice de fragmentation de l'ADN des spermatozoïdes (DFI). Le test de structure de la chromatine des spermatozoïdes (SCSA) par cytométrie en flux est la méthode principale pour évaluer le DFI⁷. Deux méthodes de gating en cytométrie en flux pour la détection du DFI des spermatozoïdes ont été rapportées dans la littérature. L'une est la méthode de gating polygonale (PGG), qui peut rapporter simultanément deux indicateurs clés, tels que le DFI des spermatozoïdes et HDS⁸. PGG est une approche SCSA classique caractérisée par un coefficient de variation de détection plus faible et une meilleure répétabilité⁹. Cependant, elle ne peut pas distinguer la gravité des dommages à l'ADN. Le deuxième type est la méthode de gating en croix (CFG), qui peut rapporter le marqueur de dommages graves de l'ADN des spermatozoïdes (DFIs), le marqueur de dommages légers de l'ADN des spermatozoïdes (DFIm) et le DFI total de la méthode de gating en croix (DFIc). DFIc est égal à la somme des DFIs et DFIm. Comparée aux technologies actuelles pour évaluer l'intégrité de l'ADN des spermatozoïdes, la méthode CFG peut refléter la gravité des dommages à l'ADN des spermatozoïdes¹⁰.

Pour déterminer quelle méthode est la plus appropriée pour évaluer la qualité des spermatozoïdes, cette étude a utilisé à la fois la méthode PGG et la méthode CFG pour mesurer le DFI et les paramètres connexes dans les spermatozoïdes. La corrélation entre les résultats de ces deux méthodes et les paramètres d'analyse conventionnelle du sperme a été comparée. À notre connaissance, c'est la première étude à analyser la corrélation des résultats de détection entre les deux méthodologies, PGG et CFG.

Protocol

Cette étude a été approuvée par le Comité d'Éthique Médicale de l'Hôpital Huai'an First People's Hospital affilié à l'Université Médicale de Nanjing (Numéro d'approbation : KY-2024-181-01). Un consentement éclairé a été obtenu des patients dont les échantillons ont été utilisés dans cette étude. Schéma global du flux de travail présenté dans la Figure 1. Les détails des réactifs et des équipements utilisés sont décrits dans le Tableau des Matériels.

Paramètres du CFG pour le cytomètre en flux
Après traitement acide, la chromatine nucléaire des spermatozoïdes avec ADN endommagé montre de l'ADN simple brin, tandis que la chromatine nucléaire des spermatozoïdes avec ADN non endommagé conserve sa structure double brin intacte. Le colorant fluorescent acridine orange (AO) se lie à l'ADN simple brin et émet une fluorescence rouge lorsqu'il est excité par un laser à 488 nm. Lorsqu'il est lié à l'ADN double brin, il émet une fluorescence verte lorsqu'il est excité par un laser à 488 nm. En se basant sur le nombre de signaux fluorescents rouges et verts capturés par le cytomètre en flux, le rapport de la fluorescence rouge au total de la fluorescence rouge et verte est calculé, ce qui représente l'IFD des spermatozoïdes.

Les paramètres du CFG ont été mis en œuvre selon l'aperçu fourni par Yang et al.¹⁰. Le cytomètre en flux doit être configuré en utilisant la fluorescence verte la plus faible et la fluorescence rouge la plus élevée mesurées dans les spermatozoïdes normaux colorés par AO comme références de limite (Figure 2). Voici une liste des caractéristiques cellulaires de chaque quadrant dans le CFG :
Le quadrant Q1 est indicatif de spermatozoïdes normaux. Il a été observé que l'ADN des spermatozoïdes était intact et la quantité de liaison de l'AO était minimale, résultant en une fluorescence verte.
Les spermatozoïdes du quadrant Q2 ont un ADN partiellement fragmenté et apparaissent orange sous la microscopie à fluorescence. Un tel ADN peut être réparable, ces spermatozoïdes sont classés comme ayant une fragmentation d'ADN légère (FDL)¹⁰.
Le quadrant Q3 est défini comme la fluorescence non spécifique qui a subi une soustraction.
Les spermatozoïdes du quadrant Q4 ont un ADN fragmenté et apparaissent rouges sous la microscopie à fluorescence, indiquant une fragmentation d'ADN sévère (FDS).

Il est proposé que les spermatozoïdes des quadrants Q2 et Q4 contiennent tous deux de l'ADN fragmenté, et leur somme est définie comme IFDc.

Paramètres du PGG pour le cytomètre en flux
La porte polygonale pour l'analyse cytométrique en flux a été établie suivant la méthode décrite par Evenson et al.⁸. Comme indiqué dans la Figure 3, les caractéristiques cellulaires associées à chaque porte sont les suivantes :
P3 est indicatif du pourcentage de cellules avec de l'ADN dénaturé.
P4 représente les spermatozoïdes avec une forte teinture d'ADN (HDS). Ce groupe de spermatozoïdes manque l'échange normal histone-protamine.
Les populations cellulaires prédominantes situées en dehors des portes P3 et P4 consistent en des spermatozoïdes normaux, présentant une fluorescence rouge réduite et émettant principalement une fluorescence verte.

Collecte et analyse des échantillons de sperme
Les 121 échantillons de sperme proviennent des hommes qui ont visité le Centre de Reproduction de l'Hôpital Huai'an First affilié à l'Université Médicale de Nanjing. Les échantillons de sperme ont été collectés par masturbation après une période d'abstinence de 2 à 7 jours. L'analyse de routine du sperme a été strictement menée conformément aux exigences du Manuel de Laboratoire de l'OMS pour l'Examen et le Traitement du Sperme Humain^11,12. Les analyses de concentration et de motilité des spermatozoïdes ont été réalisées à l'aide d'un système d'analyse assistée par ordinateur (CASA). Chaque échantillon a été analysé deux fois. Les résultats ont été rapportés en moyenne uniquement lorsque la différence entre les deux résultats était dans l'intervalle de confiance à 95 % ; sinon, un rééchantillonnage et une nouvelle analyse ont été effectués.

Analyse de l'IFD
Calculer le volume d'échantillon requis pour l'échantillon de sperme afin que la concentration finale des spermatozoïdes dans le réactif A du kit de cytométrie en flux soit de 2 à 3 x 10⁶/mL. Méthode de calcul : En supposant que la concentration de spermatozoïdes dans l'échantillon de sperme original est de M x 10⁶/mL, alors le volume de sperme requis (µL) = 150/M. Ajouter le volume de sperme calculé dans un tube de cytomètre en flux, puis ajouter 50 µL de réactif A et mélanger doucement. Ajouter 100 µL de réactif B, mélanger doucement et incuber pendant 30 s à température ambiante. Immédiatement ajouter 300 µL de réactif C et mélanger doucement. Détecter l'échantillon en utilisant CFG et PGG sur le cytomètre en flux, et analyser au moins 5000 spermatozoïdes.

Analyse statistique
Les données ont été soumises à une analyse statistique en utilisant GraphPad Prism 6.0. Des graphiques de Bland-Altman ont été construits pour évaluer le niveau d'accord entre PGG et CFG en calculant la moyenne et les différences. Les différences entre les deux méthodes ont été tracées par rapport à leurs valeurs moyennes. De plus, la méthode de Pearson a été utilisée pour analyser la corrélation entre PGG et CFG. Il a été déterminé qu'une valeur p inférieure à 0,05 était statistiquement significative.

Results

Parmi les 121 participants à l'étude (âge moyen : 32,5 ± 4,9 ans ; âges allant de 26 à 44 ans), 28 ont été diagnostiqués avec une asthénozoospermie et 4 avec une oligozoospermie. Les caractéristiques démographiques de base et les paramètres d'analyse du sperme sont résumés dans le Tableau 1.

Comme le montre la Figure 4, le tracé de Bland-Altman a révélé que les résultats de l'indice de fragmentation de l'ADN des spermatozoïdes obtenus par les méthodes PGG et CFG présentaient une excellente cohérence (r = 0,9667, p = 0,0000). Seuls deux échantillons présentaient des écarts supérieurs à +10 %, et trois échantillons présentaient des écarts inférieurs à -10 %, avec des proportions respectives de 1,7 % et 2,5 %.

Le Tableau 2 montre une forte corrélation positive entre le DFIp de PGG et chacun des trois paramètres dérivés de CFG : DFIm, DFIs et DFIc. Les coefficients de corrélation étaient respectivement de 0,6497, 0,9404 et 0,9667, et les valeurs p étaient toutes inférieures à 0,05. Les résultats HDS détectés par la méthode PGG présentaient une corrélation négative significative avec les DFIs et DFIc détectés par la méthode CFG. Les coefficients de corrélation étaient respectivement de -0,3042 et -0,2120, et les valeurs p étaient toutes inférieures à 0,05. L'enquête n'a révélé aucune corrélation entre HDS et DFIm (la valeur p était supérieure à 0,05).

Comme le montre le Tableau 3, le pourcentage de spermatozoïdes en mouvement progressif  était significativement et négativement corrélé avec DFIp, DFIm, DFIs et DFIc (toutes les valeurs p étaient inférieures à 0,05), mais non corrélé avec HDS (la valeur p était supérieure à 0,05). Le volume du sperme présentait une corrélation positive significative avec DFIp, DFIs et DFIc (toutes les valeurs p étaient inférieures à 0,05), mais pas avec HDS (la valeur p était supérieure à 0,05). On n'a pas trouvé de corrélation entre la concentration de spermatozoïdes et le nombre total de spermatozoïdes et les résultats de l'analyse de PGG et de CFG (la valeur p était supérieure à 0,05).

La méthode CFG démontre une excellente cohérence avec PGG pour l'évaluation de DFI. CFG permet de discriminer le degré de dommages à l'ADN, et ses paramètres DFI sont significativement corrélés avec la motilité des spermatozoïdes. Les indicateurs de dommages sévères à l'ADN des spermatozoïdes, connus sous le nom de DFIs, sont plus adaptés à une utilisation généralisée dans la pratique clinique de routine.

Disponibilité des données :
Les ensembles de données produits et/ou analysés au cours de cette recherche intègrent des données cliniques au niveau du patient et ne sont pas divulgués au public en raison de considérations institutionnelles de confidentialité et d'éthique. Après avoir soumis une demande raisonnable et obtenu l'approbation du Comité d'éthique de l'Hôpital populaire n° 1 Huai'an affilié à l'Université médicale de Nanjing, l'auteur correspondant est autorisé à fournir des données anonymisées et des résultats d'analyse. Cette étude n'a pas impliqué le développement d'un code personnalisé.

Figure 1: Schéma général du flux de travail. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2: Gating en croix (CFG) de la cytométrie en flux pour détecter DFI. Q1 – Spermatozoïdes normaux. Q2 – Fragmentation légère de l'ADN (DFIm). Q3 – fluorescence non spécifique qui a été soustraite. Q4 – Fragmentation sévère de l'ADN (DFIs). Les spermatozoïdes avec des dommages à l'ADN tombent à la fois dans Q2 et Q4. Leur somme représente la population totale de spermatozoïdes fragmentés en ADN (DFIc). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3: Gating polygonal (PGG) de la cytométrie en flux pour détecter DFI. P3 : spermatozoïdes avec ADN dénaturé. P4 : teinture élevée de l'ADN (HDS) Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4: Diagrammes de Bland-Altman des résultats des tests PGG et CFG pour DFI. X - axe : Moyenne des résultats de mesure obtenus par la méthode PGG et la méthode CFG. Y - axe : Différence dans les résultats de mesure entre la méthode PGG et la méthode CFG Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Item	Moyenne±SD	Étendue
Âge (années)	32,5±4,9	26-44
Jours d'a

Discussion

La 6e édition du Manuel de laboratoire de l'OMS pour l'examen et le traitement du sperme humain¹² recommande quatre méthodes pour évaluer l'intégrité de l'ADN des spermatozoïdes : le TUNEL (étiquetage des extrémités terminales par la transferase déoxynucléotidique (dUTP)), les essais d'électrophorèse sur gel en cellule unique (Comet), le SCSA et le test de dispersion de la chromatine des spermatozoïdes (SCD). Parmi celles-ci, le SCSA a été largement adopté dans les laboratoires d'andrologie en raison de l'utilisation de la cytométrie en flux pour l'analyse, qui offre un débit élevé, l'efficacité et l'objectivité, ainsi que la capacité à rapporter simultanément des paramètres tels que le DFI et le HDS⁷. Selon une enquête mondiale⁷, près d'un quart (24,1 %) des cliniciens de la reproduction dans le monde ont choisi le SCSA comme méthode pour évaluer l'intégrité de l'ADN des spermatozoïdes.

L'étape la plus cruciale de la procédure SCSA est l'établissement des portes cytométriques en flux appropriées. La méthode PGG traditionnelle peut détecter à la fois les fragments rompus (DFI) des brins d'ADN et les spermatozoïdes avec un marquage anormalement élevé d'ADN (HDS), caractérisés par l'absence d'échange normal d'histones et de protamines¹³. Cependant, elle ne peut pas distinguer les ruptures simple brin des ruptures double brin dans l'ADN des spermatozoïdes. Ces dernières années, Yang et al.¹⁰ ont établi une méthode CFG pour analyser le DFI des spermatozoïdes à l'aide de la cytométrie en flux, qui peut distinguer la gravité des dommages à l'ADN des spermatozoïdes. L'étape clé de cette méthode consiste à mettre en place une porte en croix pour le cytomètre de flux. La méthode CFG présente une excellente répétabilité (le coefficient de variation était inférieur à 5 %) et une plage linéaire pour la détection du DFI de 8,93 % à 53,90 %. Cette méthode rapporte trois indicateurs - DFIm, DFIs et DFIc - mais ne fournit pas de résultats HDS¹⁰.

Cette étude a constaté que le DFI total de la méthode CFG (DFIc) était en bon accord avec celui de la méthode PGG (DFIp). L'analyse de corrélation a révélé que les coefficients de corrélation de DFIs et DFIp étaient significativement plus élevés que ceux de DFIm. Ni la concentration en spermatozoïdes ni le nombre total de spermatozoïdes ne corrélaient avec les résultats de la méthode CFG ou PGG. PR (%) et les quatre types de DFI (DFIm, DFIs, DFIc, DFIp) étaient tous significativement corrélés négativement. PR (%) était significativement corrélé négativement avec les quatre types de DFI (DFIm, DFIs, DFIc, DFIp). La corrélation avec DFIm (r = -0,1975) était significativement plus faible que celle de DFIs, DFIc et DFIp (r = -0,3794, -0,3574, -0,3824, respectivement). Ces résultats sont cohérents avec ceux rapportés par Yang et al.¹⁰. De plus, DFIs et DFIc ont montré de bonnes corrélations avec le volume séminal, alors que DFIm ne l'a pas fait. Bien que l'utilité clinique d'un indicateur qui s'aligne étroitement avec les paramètres séminaux de base puisse être limitée, cette découverte suggère que l'index de dommages sévères à l'ADN des spermatozoïdes (DFIs) peut refléter des aspects pathologiques distincts de la spermatogenèse. Plus important encore, comme le montre notre analyse de corrélation, DFIs a démontré une association significativement plus forte avec le pourcentage de spermatozoïdes en mouvement progressif par rapport à DFIm, soutenant davantage son potentiel en tant qu'indicateur complémentaire dans les évaluations de la fertilité masculine au-delà de l'analyse conventionnelle du sperme.

HDS représente la proportion de spermatozoïdes immatures manquant l'échange normal d'histones et de protamines. Le précurseur de la protamine 1 dans les spermatozoïdes HDS conserve les acides aminés terminaux qui sont typiquement clivées⁸, empêchant potentiellement une condensation appropriée de la chromatine et entraînant une augmentation de la coloration au rouge acridine des dsDNA. Des études antérieures ont souligné l'importance de HDS dans la description des défauts de chromatine dans les spermatozoïdes. Les recherches de Lin et al.¹⁴ et Virro et al.¹⁵ indiquent que le taux de fausse couche de la fécondation in vitro (FIV) est significativement plus élevé chez les hommes avec HDS > 15%. Cependant, des découvertes récentes suggèrent que HDS peut ne pas indiquer de manière fiable l'immaturité nucléaire en raison de sa faible corrélation avec les résultats de coloration CMA3, AB et TB¹⁶. Ainsi, HDS pourrait ne pas convenir comme indicateur de la fertilité masculine¹⁷. Cette étude ne montre également aucune corrélation significative entre HDS et les paramètres séminaux de base, y compris le volume séminal, la concentration en spermatozoïdes et la motilité. Par conséquent, HDS n'est pas recommandé comme marqueur de l'intégrité de l'ADN des spermatozoïdes¹⁸.

Au cours du processus de détection du DFI, des incohérences dans les limites de fluorescence peuvent survenir. Ce phénomène est principalement attribué à des variations significatives de la concentration et de la motilité des spermatozoïdes entre différents échantillons. Pour résoudre ce problème, il est recommandé d'utiliser des portes appropriées pour exclure les spermatozoïdes morts, les débris et d'autres signaux non spécifiques. Cette approche améliore la précision des données et atténue le problème des limites de fluorescence incohérentes.

À notre connaissance, c'est la première étude à comparer les résultats d'analyse des méthodes PGG et CFG. Une limite de cette étude est sa conception monocentrique et à petit échantillon, et ses conclusions nécessitent une validation ultérieure par des études multicentriques et à grand échantillon. Les futures directions de recherche incluent l'assurance de la cohérence des résultats des tests DFI des spermatozoïdes à travers différents cytomètres de flux et la détermination si les DFIs des spermatozoïdes peuvent prédire les résultats des technologies de reproduction assistée.

En conclusion, la méthode CFG fournit plus de paramètres pour l'intégrité de l'ADN des spermatozoïdes. Plus précisément, DFIm et DFIs reflètent les proportions de spermatozoïdes avec des dommages légers et graves à l'ADN, respectivement. Les résultats DFIc et DFIp montrent une bonne cohérence. La méthode CFG convient à l'application et à la promotion cliniques.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Système d'analyse assistée par ordinateur des spermatozoïdes	Beijing Suijia Software Co., Ltd	SA-II
Cytomètre en flux	Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd	Cyto E6
Kit de cytométrie en flux	Shenzhen BRED Biotechnology Co., LTD
Chambre de décompte Makler	Sefi Medical Instruments
Kit d'intégrité de l'ADN du noyau des spermatozoïdes	Shenzhen BRED Biotechnology Co., LTD	-