Mesure de l’installation de sortie et de la compliance oculaire dans les yeux de souris ex vivo à l’aide d’un système de pompe à seringue

Résumé

L’intégration d’approches analytiques issues de méthodes de perfusion à pression contrôlée a permis d’optimiser un système simple et peu coûteux de pompe à seringues pour évaluer l’installation de sortie et la compliance oculaire dans les yeux de souris.

Résumé

Maintenir une pression intraoculaire (PIO) à un niveau approprié et stable est essentiel pour la santé oculaire. Les propriétés biomécaniques du réseau trabéculaire (TM), du canal de Schlemm (SC) et de l’ensemble de la coquille cornosclérale jouent un rôle crucial dans l’homéostasie de la PIO. L’installation de sortie (C) est un paramètre clé pour évaluer l’efficacité de la TM et de la SC dans le drainage de l’humeur aqueuse, tandis que la compliance oculaire (φ) reflète l’élasticité de la coquille cornosclérale et l’écoulement transitoire à travers la TM et la SC. Auparavant, un système simple et économique de pompe à seringues était développé pour évaluer C. Cependant, l’utilisation de la régression linéaire simple pour l’analyse de données in vivo présente des limites pour caractériser la fonction de MT et SC. Dans cette étude, le système à seringue-pompe a été optimisé en appliquant des approches analytiques développées pour des systèmes de perfusion oculaire à commande de pression établis. Les valeurs mesurées de C et φ dans les yeux ex vivo ont été comparées aux valeurs du système de perfusion publiées précédemment et étaient cohérentes avec les plages rapportées. En résumé, ce système simple et peu coûteux de pompe à seringues facilite l’évaluation des propriétés biomécaniques de la TM et de la SC.

Introduction

Maintenir un niveau de pression intraoculaire (PIO) approprié et stable est essentiel pour la santé^{oculaire 1}. L’élévation soutenue de la PIO est le principal facteur de risque pour le^{glaucome 2,3}. Les fluctuations prolongées de la PIO sur plusieurs mois ou années contribuent également à la perte de vision ^4,5. Des études récentes ont identifié une autre forme de fluctuation de la PIO, des fluctuations transitoires causées par les activités quotidiennes, qui peuvent également accélérer la progression du^{glaucome 6,7}. Par exemple, un homme de 46 ans ayant 20 ans d’antécédents de frottement des paupières et un homme de 52 ans qui s’était frotté les yeux pendant 10 ans présentaient tous deux des lésions accélérées du disque optique ^8,9. Ces résultats soulignent l’importance de réponses opportunes et appropriées aux changements de la PIO afin de minimiser le risque de perte visuelle.

La PIO est régulée par l’équilibre entre la production d’humeur aqueuse (AH) et son drainage¹⁰. L’AH sort principalement de l’œil par les voies conventionnelle et^{uveosclérale 11}. Dans les yeux normaux comme dans les yeux glaucomates, la voie conventionnelle composée du réseau trabéculaire (TM) et du canal de Schlemm (SC) est la principale source de résistance à l’écoulement qui influence l’homéostasie de la^PIO 12,13,14. Par conséquent, les propriétés biomécaniques de la MT et de la SC sont essentielles pour que l’œil s’adapte aux changements dans la^{PIO 15, 16, 17}.

Les avancées technologiques récentes ont permis une évaluation plus précise des sorties d’AH. Des approches invasives, telles que la perfusion par gravité et le système de pompe à seringue, ont été développées pour calculer l’installation de sortie (C), qui indique comment la TM et la SC régulent les sorties en régime^stationnaire 18,19,20,21,22,23,24. Des méthodes non invasives, telles que la tonographie²⁵ et la fluorophotométrie²⁶, ont été utilisées cliniquement pour déterminer la C chez les patients atteints de glaucome. Cependant, la plupart des approches ne parviennent pas à évaluer spécifiquement la fonction de la MT et de la SC. Par exemple, dans le système seringue-pompe, les données de débit et de pression à régime permanent sont ajustées à l’aide d’une simple régression linéaire, et la pente est interprétée comme un C dépendant de la pression. Cependant, ce C calculé chez les souris vivantes ne peut pas refléter avec précision la capacité d’écoulement de l’AH via la voie conventionnelle car il est affecté par la sécrétion d’AH, l’écoulement uveoscléral et la pression veineuse épisclérale, comme décrit par l’équation de Goldmann.

Pour répondre à cette limitation, Millar et al. ont calculé l’entrée d’AH, l’écoulement conventionnel et l’écoulement uveosclérial dans le même œil de souris en utilisant plusieurs mesures à flux constant basées sur l’hypothèse d’absence d’entrée d’AH, d’absence de pression veineuse épisclérale et d’un écoulement uvéosclérial inchangé après^{l’euthanasie 22}. En 2016, Sherwood et al. ont rapporté que le débit uveosclérial est de 0 dans les yeux ex vivo à 0 mmHg, puis ont abordé la même question en introduisant un modèle de loi de puissance utilisant l’iPerfusion (un système de perfusion contrôlé par pression, ci-après appelé système de perfusion)²⁷. Les avancées méthodologiques ont clarifié les rôles distincts de la MT et de la SC, améliorant la compréhension de leurs fonctions physiologiques pour maintenir l’écoulement de l’AH en état stationnaire.

De plus, la réponse transitoire de la TM et de la SC aux fluctuations de la PIO est essentielle pour maintenir l’homéostasie de la PIO. Pour suivre ce mouvement, Xin et al. ont développé la tomographie optique de cohérence sensible à la phase (OCT), qui permet une observation sur une échelle de temps de²⁸ secondes. La microscopie électronique à face en série en série à balayage en trois dimensions peut examiner ce mouvement au niveau^{ultrastructurel 29}. Cependant, les méthodes basées sur l’image n’estiment que les propriétés biomécaniques de la TM et de la SC et ne fournissent pas de valeurs réelles de drainage transitoire de l’AH. En 2019, après avoir développé l’iPerfusion, Sherwood et al. ont calculé l’oculaire (φ) comme un indicateur clé à la fois de l’élasticité cornosclérale et de la réponse transitoire de TM et SC³⁰. Cette avancée fournit un paramètre quantitatif pour évaluer les comportements transitoires de la TM et de la SC en réponse aux fluctuations de la PIO.

Sur la base de ces avancées dans l’évaluation des fonctions de la TM et de la SC, cette étude a amélioré le système de pompe à seringues en incorporant le modèle à loi de puissance pour le calcul du C et en intégrant de nouvelles méthodologies pour calculer φ. Ces mesures ont été comparées aux données publiées obtenues via le système de perfusion afin d’évaluer si le système à pompe à seringue optimisé est adapté à l’évaluation de la capacité de sortie et de la compliance oculaire dans les yeux de souris ex vivo .

Protocole

Toutes les expériences ont été menées conformément à la Déclaration ARVO sur l’utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle ainsi qu’aux directives de soins et d’utilisation des animaux de laboratoire du Centre médical universitaire de Qingdao (QDU-AEC-2022069).

1. Sélection et manipulation des animaux

1. Utilisez des souris de 5 mois avec un patrimoine génétique de 50 % C57BL/6 et 50 % de BALB/c. Ne considérez pas le sexe dans le cadre expérimental.
2. Maintenez les souris sous un cycle clair-obscur de 12 h/12 h à 23 ± 2 °C et une humidité de 50 ± 5 %.

2. Mesure de la PIO

1. Anesthésiez les souris avec 2,5 % d’isoflurane avec 80 % d’oxygène (vol/vol) dans une chambre scellée pendant 3,5 minutes.
   ATTENTION : L’isoflurane est un anesthésique volatil. Effectuer l’anesthésie dans un espace bien ventilé ou un système de confinement approprié.
2. Transférer les souris sur une plateforme d’opération. Maintenez l’anesthésie avec un masque pendant 30 secondes supplémentaires.
3. Effectuez toutes les mesures entre 9h00 et 12h00. Notez trois mesures par œil. Calculez la valeur moyenne pour chaque point de données.

3. Configuration du système (Figure 1)

1. Connectez une seringue de 100 μL à une pompe à seringue.
2. Connectez la seringue à un capteur de pression de flux direct.
3. Connectez le capteur à un système d’acquisition de données.
   REMARQUE : Assurez-vous que le capteur de pression et le porte-œil sont alignés à la même hauteur afin d’éviter les artefacts de pression.
4. Remplissez le système de 1× de solution saline tamponnée phosphate (PBS). Enlève toutes les bulles d’air.
5. Placez l’œil dans un support avec une cavité circulaire (diamètre de 4 à 6 mm). Assurez-vous que l’œil est stable pendant la canulation. Placez le capteur de pression et le porte-œil à la même hauteur.
   REMARQUE : Un désalignement peut entraîner des erreurs de mesure de pression. Le fichier de conception STL pour le porte-œil personnalisé est fourni sous la forme de Fichier Supplémentaire 1.

4. Fonctionnement logiciel

1. Étalonnage du capteur de pression
   1. Ouvre le logiciel d’acquisition de données. Chargez le fichier de configuration de calibration. Sélectionnez la fonction d’étalonnage .
   2. Connectez le système à un réservoir d’eau à deux hauteurs définies.
   3. Pressions mesurées et réelles en entrée utilisant la conversion :
      1 cm H₂O = 0,735 mmHg
2. Installation des pompes
   1. Ouvre les paramètres du module. Chargez le fichier de configuration du régulateur.
   2. Sélectionnez le dispositif de pompe. Indiquez le débit maximal et le diamètre de la seringue.
3. Enregistrement des données
   1. Commence l’enregistrement.
   2. Arrêtez d’enregistrer après chaque étape de pression.
   3. Entrez la valeur de pression suivante.
   4. Redémarrez l’enregistrement.

5. Préparation de l’aiguille

1. Faites une micropipette en verre selon un^{protocole établi 8}.
2. Meuler la pointe à un diamètre intérieur de 80 à 100 μm. Polissez la pointe de l’aiguille.
   ATTENTION : Manipulez les aiguilles en verre avec précaution pour éviter les blessures.
3. Montez l’aiguille sur un micromanipulateur. Connectez l’aiguille au transducteur de pression.
4. Remplissez l’aiguille avec du PBS.
5. Placez la pointe de l’aiguille à la même hauteur que le capteur de pression.
6. Mesure de la résistance
   1. Appliquez une pression de 1 mmHg. Enregistrez le débit.
   2. Calculez la résistance de l’aiguille :
      
   3. Utilisez des aiguilles avec une résistance comprise entre 0,01 et 0,5 mmHg/(μL/min).

6. Installation système et conformité

1. Mesure des installations
   1. Utilisez le système avec PBS. Scellez le système à l’aide d’une vanne à trois voies.
   2. Appliquez des pressions de 6, 8, 10, 12, 14 et 16 mmHg.
   3. Enregistrez P et Q pendant 10 minutes à chaque étape. Calculez les valeurs moyennes des 5 dernières minutes.
   4. Effectuez une régression linéaire. Interprétez la pente comme une installation du système.
2. Validation
   1. Répétez les mesures 3 fois.
   2. Confirmez que la fonction système est inférieure à 0,2 nL/min/mmHg.
3. Mesure de la conformité
   1. Introduisez un tube en silicone de 35 cm dans le système.
   2. Mesurez la conformité avec et sans tubes en Téflon.
   3. Calculer la variation de volume à l’aide d’une méthode à volume^{discret 14}.
   4. Déterminez la conformité système à 4 nL/mmHg.
4. Contrôle de sensibilité
   1. Confirmez que la conformité détectable du système est supérieure à 9,9 nL/mmHg.

7. Énucléation

1. Euthanasiez les souris à l’aide de_CO2 à un débit de 0,7 L/min pendant 3 minutes.
   ATTENTION : L’euthanasie du CO₂ doit suivre les directives institutionnelles afin d’assurer des objectifs humains.
2. Disséquez les muscles extraoculaires et les nerfs optiques à l’aide d’instruments stériles. Énucléez les globes oculaires.
3. Placez immédiatement un œil dans le support à 35,5 °C.
4. Conservez l’œil controlatéral à 4 °C.
5. Mesurez les deux yeux avec le même système.

8. Canulation

1. Insertion par aiguille
   1. Insérez l’aiguille à travers la cornée centrale à un angle de 45°.
   2. Avancez l’aiguille à une profondeur de 0,3 à 0,5 mm dans la chambre antérieure.
2. Validation
   1. Stabiliser le système. Confirmez la fluctuation de pression ≤ 0,4 mmHg sur les 5 dernières minutes.

9. _Cr oculaire

1. Stabiliser l’œil à 8 mmHg pendant 30 minutes.
2. Appliquez des pressions de 6, 8, 10, 12, 14 et 16 mmHg.
3. Appliquez une dernière étape à 8 mmHg.
4. Collecte de données
   1. Réglez le débit maximal à 4 μL/min.
   2. Enregistrez P et Q pendant 10 minutes à chaque étape.
5. Analyse
   1. Tracez les courbes P–T et Q–T. Calculez les valeurs moyennes des 5 dernières minutes.
   2. Données d’ajustement au modèle^{de loi de puissance 27} :
      
6. Définissez C_r (après soustraction de l’installation du système) comme l’installation de sortie oculaire.
7. Posez P_r = 8 mmHg.
8. Définissons β comme le coefficient non linéaire.

10. Oculaire Φ_r

1. Analysez les courbes P–T et Q–T lors des incréments de pression. Identifier l’augmentation du débit jusqu’à Q_max et la décélération qui en a suivi.
2. Calculez la variation de volume entre t_p et t_max en utilisant la méthode du volume^{discret 30}.
3. Données d’ajustement à l’équation^{modifiée de Friedenwald 30} :
   
4. Définissez P_r = 13 mmHg. Définissons Φ_r (après soustraction de la compliance système) comme la compliance oculaire Φ_r, _eye et γ comme paramètre de matériau.

Résultats

La performance du système optimisé de pompe seringue a été évaluée en comparant le C et le φ chez des souris de 5 mois avec des valeurs précédemment publiées issues d’études de perfusion oculaire contrôlée par pression. La normalité des ensembles de données de la Figure 2F a été évaluée à l’aide du test de Shapiro–Wilk, et des comparaisons statistiques ont été réalisées à l’aide d’un test t de Student à deux queues.

Comme montré à...

Discussion

Cette étude présente un système de pompe à seringue optimisé pour estimer l’installation de sortie et la compliance oculaire chez les yeux de souris, fournissant des valeurs cohérentes avec celles rapportées à l’aide de systèmes de perfusion oculaire à contrôle de pression. L’approche actuelle améliore la précision des mesures à la seringue tout en maintenant un système expérimental simple et accessible. Cette combinaison d’affinement méthodologique et d’accessibilité pourrait faciliter ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Réactif	1 & fois ; Tampon PBS	Thermo Fisher Scientific	10010023
Isoflurane	Shenzhen Rewoode Life Sciences Co., Ltd., Chine	R640
Matériel	100 & mu ; L Seringue de haute précision	Hamilton	1710
Verre borosilicate	Sutter, Novato, CA	BF100-50-10
Seringue jetable stérile	Fenglin Medical Devices Co., Ltd. Jiangxi, Chine	10 ml
Capteur de pression	IcuMedical	PX26-015G
Tube en silicone	Runze Fluid Co., Ltd, Nankin, Chine & nbsp ;	N/A
Tube PTFE transparent	Runze Fluid Co., Ltd, Nankin, Chine & nbsp ;	N/A
Équipement	Extracteur de pipette enflammé/marron	Sutter, Novato, CA	P-97  ;
Micromanipulateur manuel	Instruments de précision mondiaux (WPI)	M3301
Bain métallique	Biologie du castor, Suzhou, Chine	2016C
MicroForge	Laboratoire d’instruments scientifiques Narishige, Tokyo, Japon	MF830
Meulette à micropipette	MPInstrument Co., Ltd., Wuhan, Chine	KDG-02
Microscope binoculaire stéréo à zoom PZMIII	Instruments de précision mondiaux (WPI)	PZMIII  ;
Pompe à seringue	Instruments de précision mondiaux (WPI)	AL-1000