Article de méthode

Dissection à petite échelle et coloration par anticorps des disques imaginaux oculaires-antennaux et des ailes provenant de Drosophila melanogaster

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DOI :

10.3791/70434

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15 mai 2026

 , 
1Department of Developmental and Cell Biology, Charlie Dunlop School of Biological Sciences, University of California, Irvine, 2Department of Microbiology and Molecular Genetics, University of California, Irvine

Dans cet article

Résumé

Cet article décrit un protocole efficace de dissection imaginaire des disques et de coloration par anticorps, économique en matière de réactifs et facilitant la manipulation de disques imaginaux en petites quantités.

Résumé

Les disques imaginaux de Drosophila ont longtemps été étudiés comme modèles de développement, de schéma et de régénération épithéliaux. Le marquage par anticorps et l’imagerie des disques imaginaux disséqués sont importants pour visualiser les schémas d’expression des protéines en tant que marqueurs des processus développementaux et physiologiques. Cette méthode de dissection et de marquage imaginaire des disques a été initialement développée pour la microscopie immunoélectronique des disques imaginaux œil-antenne par Tomlinson et Ready. En utilisant des plaques de 60 micropuits, et en transférant les tissus entre solutions plutôt qu’en transférant des solutions, une attention individualisée aux échantillons de tissu est possible avec très peu de gaspillage. Même des disques imaginaux uniques peuvent être traités. La méthode ne nécessite que de petits volumes d’anticorps et d’autres réactifs. À titre d’exemple de l’application de la méthode à d’autres petits tissus, l’article montre également comment les disques imaginaux d’ailes peuvent être disséqués et marqués par la même méthode. Une approche similaire peut être appliquée à tout petit tissu de dimensions comparables, ainsi qu’à d’autres procédures histochimiques et de marquage en dehors de la coloration par anticorps.

Introduction

Les disques imaginaux de Drosophila sont des tissus progéniteurs qui sont mis de côté lors de l’embryogenèse et se développent à l’intérieur de la larve sans se différencier et contribuent aux structures épidermiques adultes durant le stadenymphal 1. Leur étude a apporté de nombreux éclairages sur les mécanismes de patronage du développement, les disques imaginaux de l’œil et des ailes ayant été particulièrementétudiés 2,3,4,5,6. L’immunohistochimie est particulièrement utile pour étudier les schémas spatiaux et temporels d’expression génique dans les disques imaginaux, ainsi que pour caractériser les comportements cellulaires, y compris la division cellulaire et la mort cellulaire.

Pour faciliter les exigences supplémentaires de l’analyse microscopique électronique des disques imaginaux oculaires marqués par des anticorps, Tomlinson et Ready ont développé un protocole à petite échelle, particulièrement économique avec les réactifs et offrant un très haut degré de fiabilité et depersonnalisation 7. Leur méthode est décrite dans la presse, mais aucune vidéo n’est disponible 3,8,9. La méthode est facilement modifiée pour l’étiquetage d’autres disques imaginaux (ou autres tissus) et peut être appliquée aux disques imaginaux des ailes en plus des disques imaginaux oculaires-antennes.

Le marquage par anticorps des disques imaginaux de Drosophila suit le contour général applicable à touttissu 10 (Figure 1). Le tissu doit être disséqué et fixé avant l’incubation avec des anticorps spécifiques aux protéines d’intérêt. Après que l’anticorps non lié a été lavé, un anticorps secondaire marqué (souvent fluorescent) est ajouté, qui se lie à l’anticorps primaire, lui-même lié à la protéine d’intérêt dans le tissu fixé. Après le lavage pour éliminer les anticorps secondaires non liés, le tissu peut être monté pour un examen microscopique, et les protéines d’intérêt peuvent être visualisées. De nombreuses descriptions générales de ce processus sont disponibles et peuvent être appliquées aux disques imaginaux et autres tissus de Drosophila 11. Ici, un protocole est proposé pour la méthode Tomlinson & Ready, dans laquelle des échantillons de tissu sont transférés individuellement entre de petits puits d’incubation sur une plaque de micropuits et observés par un microscope stéréoscopique à chaque étape (Figure 2). Cette approche fonctionne mieux pour colorer un plus petit nombre de tissus à la fois (des dizaines d’échantillons) et n’est pas idéale pour de grandes quantités (c’est-à-dire des centaines). Cette approche nécessite seulement de petits volumes de solution de 13 μL dans chaque puits et peut donc être réalisée avec très peu d’anticorps. Comme la perte tissulaire est minime, il n’y a pas de taille minimale d’échantillon, et même les disques imaginaux uniques peuvent être traités de manière fiable.

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Protocole

Les réactifs et l’équipement utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Fabrication de l’outil de transfert

  1. Utilisez une pince pour couper ~2,5 cm de fil de tungstène de 0,005" de diamètre. Utilisez des pinces pour former une extrémité du fil en un crochet ou une boucle (Figure 3). Insérez l’autre extrémité dans un porte-aiguilles. Cela sera utilisé pour transférer les disques avec peu ou pas de transfert de liquide. La boucle est peut-être la plus facile à utiliser, mais le crochet transfère moins de liquide entre les solutions.

2. Disséquer et fixer les disques imaginaux oculaires-antennaux

  1. Rincez les larves avec ~7,5 mL tampon phosphate de sodium 0,1 M (pH7,2) dans une boîte de Petri (60 mm de diamètre) pour éliminer tout milieu mouche ou autre débris. Voir l’étape 6 pour la dissection des disques imaginaux des ailes plutôt que des disques oculaires-antennes. Ces deux disques imaginaux sont situés dans la partie antérieure du corps (Figure 4).
    REMARQUE : Le PBS peut également être utilisé à la place du tampon phosphate aux étapes 2.1 à 2.3.
  2. Transférer les larves dans une boîte de Petri contenant un tampon frais.
    REMARQUE : Certains ouvriers préfèrent disséquer les larves individuelles dans des gouttes tampons simples dans une boîte de Petri de 60 mm ; D’autres utilisent des lames de dépression.
  3. Lors de l’observation au microscope disséqueur, maintenez les larves ~50 % du long du corps à l’aide d’une pince. Utilisez une seconde paire de pinces fines pour saisir les crochets buccales et tirer. Les disques oculaires sortiront en étant attachés aux parties buccales. Le cerveau peut également rester attaché aux disques oculaires.
  4. Utilisez l’outil à fil métallique pour transférer le tissu disséqué dans une petite boîte de Petri (35 mm de diamètre) contenant ~3 mL de fixateur, par exemple 3,7 % de formaldéhyde dans un tampon phosphate de sodium 0,1 M (pH7,2), obtenu en diluant une solution de fonds de formaldéhyde à 37 % dans un tampon.
    REMARQUE : Suivez les procédures de sécurité approuvées localement pour la manipulation du formaldéhyde. Le formaldéhyde à 3,7 % est un fixatif simple qui sera satisfaisant dans de nombreux cas, mais d’autres fixateurs peuvent être optimaux pour certains antigènes. Le PBS ou PEM (0,1 M PIPES pH 7,0, 2 mM MgSO4, 1 mM EGTA) peut être utilisé comme tampon fixateur à la place de 0,1 M phosphate de sodium, ou une solution de formaldéhyde peut être obtenue en dissolvant du paraformaldéhyde solide, plutôt qu’à partir d’une solution concentrée de stock. Le fixateur paraformaldéhyde-lysine-périodiate (PLP) combine une fixation plus douce des protéines avec un réticulation des glucides et préserve mieux les structuresmembranaires 12. La glycoprotéine de Drosophila, le scabrous, par exemple, reste antigénique après la fixation du PLP mais pas après la fixation au formaldéhyde. Préparer le PLP fraîchement comme suit : (1) Ajouter 2 g de poudre de paraforméldéhyde à 25 mL d’eau déionisée dans une fiole conique dans une hotte à fumée et remuer à feu doux ; (2) Trempez une pipette dans une solution de fond d’hydroxyde de sodium à 50 % et transférez une trace du liquide (bien moins d’une goutte) dans le mélange. Le paraformaldéhyde devrait se dissoudre en quelques minutes sans que la solution n’ébullisse. Lors du refroidissement de la solution de formaldéhyde à 8 %, dissoudez 0,36 g de lysine dans 10 mL d’eau déionisée, 7,5 mL 0,1 M phosphate de sodium pH 7,2, 2,5 mL 0,1 M Na2HPO 4 et conservez sur la glace. Mélangez 15 mL de cette solution de lysine tamponnée à froid avec 5 mL de formaldéhyde frais à 8 % et 50 mg de périodate de sodium dans un tube à bouchon à vis de 50 mL, mélangez par vortex et utilisez-les quand c’est frais.
  5. Après 15 à 20 minutes à température ambiante, transférez le tissu disséqué dans une autre boîte de Petri contenant 0,1 M de phosphate de phosphate tampon (pH 7,2).
    REMARQUE : Le PBS peut également être utilisé à la place du tampon phosphate. La fixation sur la glace peut être préférable pour certains antigènes, ou lorsqu’il est souhaité d’imager la fluorescence endogène de la GFP ou de la RFP exprimée dans le tissu. La fixation du PLP est toujours 45 minutes sur glace.

3. Blocage et incubation avec un anticorps primaire

  1. Transférez le tissu dans une boîte de Petri de 35 mm contenant ~3 mL de gel anticorps NSG pour le blocage. Incubez la boîte de Petri sur de la glace pendant au moins 15 minutes. Le NSG contient 0,1 M de phosphate de sodium (pH 7,2), 0,1 % de saponine, 5 % de sérum normal de chèvre. Les stocks tampons de lavage sont stockés stérilisés par filtre à 4 °C.
    REMARQUE : Différents tampons de lavage peuvent être optimaux pour certains anticorps. Par exemple, alors que la saponine est un détergent doux, non ionique, qui solubilise particulièrement la membrane plasmique, d’autres détergents peuvent être préférables pour détecter les antigènes dans le noyau. À titre d’autre exemple, l’anticorps développé contre la protéine atonale nucléaire par Jarman et al.13 est le plus immunoréactif dans les tampons contenant NP40 comme détergent. Voir le tableau des matériaux pour les recettes des tampons de lavage alternatifs : PDT, PBT ou NSG. Lorsqu’on utilise un sérum normal comme protéine bloqueante, idéalement, il doit provenir de l’espèce chez laquelle l’anticorps secondaire est produit, par exemple, le sérum de chèvre normal si des anticorps secondaires de chèvre sont utilisés, ou le sérum d’âne normal si des anticorps secondaires d’âne doivent être utilisés. En pratique, cela ne change guère.
  2. Nettoyez les tissus indésirables des disques imaginaux oculaires-antennaux lors du blocage à l’aide de pinces fines, sauf les crochets buccaux. Laissez les pièces buccales attachées pour l’instant afin de faciliter les transferts.
    REMARQUE : Les tissus superflus, par exemple le cerveau, peuvent également être laissés jusqu’au montage de la culasse (étape 5.4), tant qu’ils n’interfèrent pas avec la coloration ou la visibilité.
  3. Lors du blocage, préparez une dilution 1:100 de solution d’anticorps mAb40-1a dans NSG, par exemple 1 μL d’anticorps dans 100 μL de NSG. Mélange par pipette, pas par vortex.
    REMARQUE : mAb40-1a est un anticorps monoclonal élevé contre la bêta-galactosidase. La dilution optimale des anticorps et le tampon de lavage varieront selon les anticorps utilisés en particulier.
  4. Ajouter des solutions d’anticorps de 13 μL dans chacun des six puits maximum de la première colonne d’un mini-plateau de micropuits à 60 puits. Les micropuits coniques à flancs droits sont importants pour la clarté optique. Si plus de six puits sont nécessaires, commencez un second mini-plateau.
  5. Transférez les disques imaginaux oculaires-antennes, de préférence encore attachés aux pièces buccales, à la solution primaire d’anticorps un par un à l’aide de la boucle ou du crochet en fil.
    REMARQUE : Le nombre de disques imaginaux pouvant être ajoutés à chaque puits dépend de l’anticorps. Trop de tissu peut épuiser certains anticorps au point que le marquage diminue. 5 paires par puits est généralement satisfaisant. Ainsi, ~60 disques peuvent être facilement étiquetés à l’aide des 6 rangées de plaques micro-titrées à 60 puits. Différents anticorps peuvent être utilisés pour chacune des rangées. La possibilité de réutiliser les solutions d’anticorps nécessite des tests empiriques pour chaque cas ; Ce n’est pas une routine dans notre laboratoire.
  6. Fermez la plaque avec le couvercle et scellez avec du parafilm pour limiter l’évaporation. Couver sur glace ou à 4 °C pendant 4 heures jusqu’à toute la nuit. Balancer n’est pas nécessaire.
    REMARQUE : Le temps optimal et la température d’incubation des anticorps dépendent de l’anticorps. Dans de nombreux cas, 1 à 2 heures à température ambiante suffit, mais certains anticorps donneront de meilleurs résultats après l’incubation à 4 °C, et il peut souvent être pratique d’incuber à 4 °C pendant la nuit. Dans très peu de cas, des incubations primaires d’anticorps de 2 à 3 jours peuvent être optimales. Sceller le couvercle du micropuits n’est nécessaire que pour des incubations de plus de ~4 heures.

4. Lavage et incubation avec un anticorps secondaire

  1. Ajoutez 13 μL de tampon NSG aux trois colonnes suivantes de puits après chaque puits d’anticorps, car les échantillons seront lavés trois fois. Transférez les échantillons pour les laver pendant 5 minutes dans chaque puits successivement.
  2. Lors du lavage, préparez une dilution 1:200–400 d’anticorps secondaires conjugués fluorescentement dans un tampon NSG, par exemple 0,5 μL d’anticorps dans 100 μL de NSG. Mélange par pipette, pas par vortex. Centrifugez la solution d’anticorps secondaire pendant 60 s (à vitesse maximale) avant dilution, car les agrégats d’anticorps peuvent se lier de manière non spécifique à la surface tissulaire.
    REMARQUE : La dilution optimale des anticorps secondaires peut varier selon le fabricant. Des anticorps conjugués à Alexa ou à la cyanine sont disponibles, soustraits pour d’autres espèces afin de faciliter le marquage multiple.
  3. Ajoutez 13 μL de la solution secondaire d’anticorps à la colonne suivante (5e) de puits.
  4. Transférez les échantillons dans l’anticorps secondaire à l’aide de la boucle ou d’un hameçon.
  5. Fermez la plaque avec le couvercle et scellez avec du parafilm pour limiter l’évaporation. Incubez sur glace pendant 4 heures toute la nuit.
    REMARQUE : Le temps optimal et la température d’incubation des anticorps dépendent de l’anticorps. Dans de nombreux cas, 1 à 2 heures à température ambiante suffit, mais certains anticorps donneront de meilleurs résultats après l’incubation à 4 °C, et il peut souvent être pratique d’incuber à 4 °C pendant la nuit. Sceller le couvercle du micropuits n’est nécessaire que pour des incubations de plus de ~4 heures.

5. Lavage et montage des tissus pour la microscopie

  1. Préparez les trois colonnes suivantes de puits après le puits secondaire d’anticorps avec 13 μL de NSG. Transférez les échantillons dans chaque puits pendant 5 minutes.
  2. Transférez les échantillons dans un lavage final dans le9e puits à l’aide de 13 μL de tampon phosphate de sodium 0,1M (pH 7,2). Ce lavage de tampon est nécessaire lorsque les tampons de lavage contiennent des composants qui précipitent dans le milieu de montage.
  3. . Ajoutez 13 μL de milieu de montage à la colonne finale (10e) des puits. Le milieu de montage est fabriqué en dissolvant 2 % de gallate de n-propyle dans 75 % de glycérol et 25 % de tampon phosphate de sodium 0,1 M, pH 7,2. Préparez un nouveau substrat de montage chaque semaine en mélangeant les composants sur une plateforme rotative. Laissez les bulles d’air se dissiper avant utilisation.
    REMARQUE : Les supports de montage sont également disponibles commercialement.
  4. Pipette 20 μL de milieu de montage sur une lame de microscope propre. Transférez les échantillons dans le milieu sur la lame. C’est une dernière occasion d’éliminer les tissus indésirables. Les pièces buccales cuticulaires doivent être retirées des disques oculaires-antennes.
  5. Pour disposer les échantillons afin qu’ils ne dérivent pas lorsque le verre de couverture est superposé, utilisez l’outil à fil métallique pour extraire les échantillons de la goutte principale de montage. Déposez doucement un verre de couverture propre de 22 mm x 40 mm d’épaisseur #1,5 sur la culasse à l’aide de pinces, sans introduire de bulles d’air.
  6. Laissez les lames reposer 1 heure dans un porte-culasse en carton pour que le support de fixation se dépose. Évitez de déranger les lames car les échantillons fragiles peuvent être endommagés si le verre de couverture bouge.
  7. Une fois le verre de couverture déposé, scellez les bords avec du vernis à ongles. Ne bougez pas et ne pressez pas la vitre du couvercle pendant cela. Laissez sécher le vernis à ongles pendant au moins 1 heure avant l’imagerie.
    REMARQUE : Malheureusement, la plupart des vernis à ongles cosmétiques utilisent désormais des solvants qui ne se répartent pas uniformément sur les lames en verre et ne sont pas utiles, il faut donc se procurer un vernis scientifique.
  8. Conservez les lames à 4 °C. Les échantillons peuvent normalement être imagés et ré-imaginés pendant des mois.
    REMARQUE : Les lames peuvent également être stockées à -20 °C.

6. Dissection et fixation des disques imaginaux d’ailes

  1. Pour disséquer les disques imaginaux des ailes plutôt que les disques imaginaux œil-antennes, suivez les étapes ci-dessous à la place des étapes 2.3 à 2.5 ci-dessus.
  2. Au microscope disséqueur, saisir les pièces buccales larvaires avec de fines pinces. À l’aide de ciseaux de microdissection, coupez les larves en deux entre 30 % et 40 % de la distance antérieure.
  3. Inversez la partie antérieure de la larve en écartant l’extrémité ouverte et coupée de la larve à l’aide d’une seconde paire de pinces et en poussant la tête et les pièces buccales à travers, un peu comme en inversant une chaussette
  4. Utilisez des pinces pour transférer les larves antérieures inversées en fixatif dans une petite boîte de Petri (35 mm de diamètre) contenant ~2,5 mL de fixateur, par exemple 3,7 % de formaldéhyde dans un tampon phosphate de sodium 0,1 M (pH 7,2), obtenu en diluant une solution de bouillon de formaldéhyde à 37 % dans le PBS.
    REMARQUE : Si désiré, les carcasses inversées peuvent être transférées à 400 μL de fixatif dans un tube de micro-fuite, ce qui facilite la fixation dans une hotte à fumée. Les mêmes options fixatives disponibles pour la fixation disque-imaginaire oculaire s’appliquent également à la fixation du disque alaire (voir NOTE à l’étape 2.4). La fixation optimale et pour le marquage des disques imaginaux œil-antennaux sera généralement la même pour les disques d’aile.
  5. Après 15 à 20 minutes à température ambiante, transférez le tissu disséqué dans une autre boîte de Petri contenant 0,1 M de phosphate de phosphate tampon (pH 7,2).
    REMARQUE : Les mêmes options de tampon de lavage disponibles pour la fixation du disque imaginaire de l’œil s’appliquent également à la fixation du disque alaire (voir NOTE à l’étape 2.4). Le tampon de lavage optimal pour marquer les disques imaginaux œil-antennaux sera généralement le même pour les disques d’aile.
  6. Retirez les disques des ailes des larves à l’aide de pinces fines. Si elles sont toujours présentes, le petit disque haltère et le disque de la jambe peuvent soit être retirés dès maintenant, soit rester attachés aux disques de l’aile pour faciliter les transferts.
    REMARQUE : Les disques alaires peuvent ne pas être facilement visibles dans la carcasse tant que le corps graisseux ou un autre tissu n’est pas retiré (identifiez toujours un tissu avant de l’enlever). Les disques alaires sont les plus grands disques imaginaux et sont fixés à la paroi de la carrosserie, étroitement associés à la trachée. Ils ont une forme de goutte d’eau, semblable au contour de South America1 (Figure 4).
  7. Poursuivez avec les étapes 3 à 5 comme ci-dessus.

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Résultats

La procédure Tomlinson and Ready donne régulièrement d’excellents résultats de coloration par anticorps. Ici, des disques imaginaux oculaires, antennaux et d’ailes triplement étiquetés sont illustrés. Dans la Figure 5A, un disque imaginaire oculaire-antenne de troisième stade a été triplement marqué pour détecter le facteur de transcription Senseless (bleu), le marqueur progéniteur neural Elav (rouge), et le marquage anti-GFP des clones cellulaires exprimant...

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Discussion

La coloration par anticorps des tissus de Drosophila à l’aide de plaques à puits coniques à 60 puits utilisant la méthode Tomlinson and Ready donne d’excellents résultats et est très fiable, chaque disque imaginaire étant suivi au microscope disséquant lors de chaque manipulation. La méthode ne nécessite que de petites quantités de réactifs anticorps, et échange les solutions plus complètement à chaque étape puisque les échantillons sont transférés avec très peu de liquide assoc...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Remerciements

NEB remercie Andrew Tomlinson pour avoir partagé la méthode et Lucy Firth pour ses améliorations. Nous remercions Abhishek Bhattacharya pour sa contribution à la Figure 5A. Nous remercions Joyner Cruz, Jonathan Gonzalez, Chelsea Nguyen et Jensen Northrup. La recherche dans le laboratoire des auteurs est financée par des subventions des NIH (GM120451 et CA284362). La figure 2 et la figure 4 ont été créées avec Biorender.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Phosphate disodiqueFisher7558-79-4Na2HPO4 - phosphate de sodium dibase anhydre. D’autres états d’hydratation peuvent être utilisés mais modifient la masse moléculaire
Pinces : Dumont #5 Pinces BiologieOutils scientifiques de qualité11252-20Style : #5
  ;   ;  ;   ;   ;  ;   ;Forme de la pointe : droite
  ;   ;   ;  ;   ;   ;  ;   ;   ;Longueur : 11 cm
  ;   ;  ;   ;   ;  ;   ;Autoclave Safe : Oui
  ;   ;  ;   ;   ;  ;   ;Conseils : Biologie
  ;   ;  ;   ;   ;  ;   ;Dimensions des pourboires :
  ;   ;  ;   ;  ;   ;0,05 x 0,02 mm
  ;   ;  ;   ;   ;  ;   ;Alliage / Matériau : Inox
FormaldéhydeFisherBP531-500Biologie moléculaire, 37 % de formaldéhyde. 500 ml
Fixateur de formaldéhydeFisherBP531-5003,7 % de formaldéhyde dans un tampon phosphate de sodium 0,1 M pH7,2 produit par dilution à partir de 37 % de stock.
GlycérolBioréactifs de FisherBP229-1
GlacePréférence utilisateur
L-Lysine, 98 %ThermoscienceJ62225.22
mAb40-1DHSB40-1a-sAnti-bêta galactosidase
Tubes microcentrifugesScientifique américaine1615-5520Tubes de 1,5 mL pour contenir des échantillons.
Ciseaux à microdissectionOutils scientifiques finement15003-08Tranchant de 5 mm, pointe droite, 8,5 cm
Phosphate monosodiqueFisher7558-80-7NaH2PO4 - Phosphate de sodium monobasique anhydre. Si on utilise une version hydratée, le poids nécessaire pour faire une solution de 0,1M changerait.
Milieu de montageSolution de glycérol à 75 % dans un tampon phosphate de sodium 0,1M pH7,2 avec 2,5 % de n-propyl gallate. Mélangez par inversion pour minimiser les bulles.
NSG0,1M phosphate tampon de phosphate de sodium pH7,2, 0,1 % de saponine, 5 % de SGN
N-propyl gallateMP Biomédicals210274780
Vernis à onglesTed Pella, acheté à FisherNC0381432Pour les lames d’étanchéité
Porte-aiguilleFisherNC0099380Pour la microdissection des aiguilles. Acier inoxydable creux ; Longueur de la poignée : 4 3/4" de long
MiniPlateaux Microwell NuncThermo Scientific12565155MicroWell MiniTray pour des applications sérologiques. Compte de puits 60
ParafilmStatLabPM996Film flexible auto-étanché StatLab ParaFilm M
ParaformélélidoïdePolysciences, Inc.00380-250
10x PBSPréférence utilisateurPréparez 800 mL d’eau distillée dans un récipient approprié.
  ;   ;  ;   ;  ;   ;   ;Ajoutez 1,37 M de chlorure de sodium à la solution.
  ;   ;   ;  ;   ;   ;  ;   ;Ajoutez 26,8 mM de chlorure de potassium à la solution.
  ;   ;   ;  ;   ;   ;  ;   ;Ajoutez 101 mM de phosphate de sodium dibase à la solution.
  ;   ;  ;   ;  ;   ;Ajoutez 18,0 mM de monobase phosphate de potassium à la solution.
  ;   ;  ;   ;  ;   ;Ajustez la solution au pH souhaité (typiquement pH & asymp ; 7,4).
  ;   ;   ;  ;   ;  ;   ;Ajoutez de l’eau distillée jusqu’à atteindre 1 L.
PBTPréférence utilisateur0,1 M tampon phosphate de sodium pH7,2, 0,1 % d’albumine sérique bovine et 0,2 % de Triton X-100.
PDTPréférence utilisateur0,1M tampon phosphate de sodium (pH = 7,2), 0,3 % de désoxycholate et 0,3 % de Triton x-100
Boîte de PetriFauconCorning 351007Boîte de Petri ; 60 mm ; non traité
Boîte de PetriFauconCorning 351008Boîte de Petri ; 35 mm ; non traité
PincesPréférence utilisateur
PLPN/D2 % de paraformaldéhyde 1,35 % lysine dans un tampon phosphate de sodium 0,05M pH7,2
Anticorps secondairesJackson ImmunoResearch715-545-1510,5 mg d’Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG.
Cache-diapositivesVWR48393-172VWR Coverglass #1.5 22x40 (BOÎTIER)
DiapositivesFisher125442Glissières Fisher Glass 10bx/CS
Désoxycholate de sodiumThermo Fisher Sci89904Détergent désoxycholate de sodium ; 5 mg
Périodate de sodiumSigma Aldrich71859-25GPériodate de sodium & ndash ; 25 grammes
Tampon phosphate de sodium0,1M de tampon NaPO4 pH 7,2. Mélangez 28 ml de stock de phosphate monosodique anyhdrous de 0,1M (11,998g de NaH2PO4 à 1L d’eau distillée) avec 72 ml de phosphate disodium anyhydre de 0,1M (14,196g Na2HPO4 à 1L d’eau distillée) pour générer 100 ml de tampon NaPO4 0,1M. Sinon, le PBS peut être utilisé.
Fil de tungstèneTed Pella27-11.005" Dia.
Triton x-100Thermo Fisher SciA16046AE
VortexPréférence utilisateur

Références

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Disques imaginaux de Drosophiladisques eye antennaldissection tissulaireexpression prot iqued veloppement pith lialimmunomarquagemarquage de petits tissusplaques de 60 micropuits

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