Isolement et caractérisation des vésicules extracellulaires enrichies en exosomes provenant de cellules mammifères infectées par le virus de la dengue de type 2

Résumé

Ici, nous décrivons l’isolement de vésicules extracellulaires enrichies en exosomes à partir de surnageant de culture cellulaire infecté par le virus de la dengue type 2, suivi de la caractérisation de l’intégrité et de la répartition de la taille des vésicules, ainsi que d’une évaluation de l’absence de virus infectieux détectable par test de plaque dans des conditions expérimentales définies.

Résumé

Les EV enrichies en exosomes sont des vésicules libérées de divers types cellulaires dans des fluides extracellulaires tels que le plasma, l’urine, la salive, les milieux de culture cellulaire et d’autres fluides corporels. Leurs diamètres varient de 30 nm à 150 nm. Ils ont été impliqués dans différents processus cellulaires, notamment les communications cellulaires et la modulation immunitaire pendant l’infection. Sur la base de ces effets, ils ont été utilisés pour étudier la pathogenèse de plusieurs virus. Il est difficile d’isoler les EV enrichis en exosomes à partir de surnatants cellulaires infectés par le virus en utilisant les techniques de purification actuelles. Cela est en grande partie dû au chevauchement de taille entre certains virus et les VE enrichis en exosomes. Ici, nous visons à purifier les EV enrichis en exosomes à partir de surnageant de cultures cellulaires infectées par la dengue type 2. Les VE enrichis en exosomes ont été isolés à l’aide d’un kit d’isolation commercial d’exosomes. Pour les EV enrichis en exosome isolés dans ce protocole, aucun virus infectieux n’a été détecté par test de plaque dans les conditions testées. Les EV purifiés enrichis en exosomes ont été caractérisés à l’aide de western blotting pour les tétraspanines, de l’analyse de suivi des nanoparticules et de la microscopie électronique de transmission pour la confirmation de la taille. Nous avons démontré que nos EV enrichis en exosomes sont intacts et dans la plage normale de diamètre des exosomes de 30 à 150 nm. Dans l’ensemble, notre protocole propose une méthode peu coûteuse pour purifier les EV enrichis en exosomes à partir de surnageant de cultures cellulaires infectées par le virus, pouvant être utilisées pour des tests fonctionnels en aval.

Introduction

Les VE enrichies en exosomes sont des vésicules de taille nanométrique libérées par chaque cellule du corps. Ce sont des sous-types de vésicules extracellulaires (EV) d’origine endocytique. Les VE enrichis en exosomes ont d’abord été découverts dans les milieux de culture^{de réticulocytes 1}. Au cours des dernières décennies, les EV enrichis en exosomes ont été purifiés de plusieurs fluides corporels, notamment le sang, l’urine, la salive, le lait maternel, les liquides séminaux et les liquides^amniotiques 2,3,4,5. Ils ont un diamètre allant de 30 nm à 150^{nm 6}. Leur libération dans le compartiment extracellulaire se fait par fusion de corps multivésiculaires (MVB) avec la membrane plasmique cellulaire. Dans le contexte des infections et de la réponse immunitaire, les EV enrichies en exosomes sont connues pour provoquer une réponse spécifique chez les cellules de mammifères. De telles réponses incluent la libération de cytokines ou des altérations de la susceptibilité à l’infection ^7,8,9.

La teneur en EV enrichi en exosomes est influencée par plusieurs facteurs, notamment le type et l’état de la cellule qui les^{produit 10,11}. De plus, leur contenu détermine aussi les effets qu’ils ont sur les cellules réceptrices naïves. Plusieurs méthodes sont actuellement utilisées pour isoler les EV enrichis en exosomes à partir de fluides biologiques. Les méthodes courantes incluent l’ultracentrifugation différentielle, la précipitation, la capture d’immunoaffinité, la chromatographie par exclusion de taille, l’isolation magnétique et l’isolation basée sur des microfluidiques.

L’ultracentrifugation différentielle est considérée comme l’une des techniques les plus utilisées^{12, 13, 14}. La méthode de purification par ultracentrifugeuse est coûteuse et nécessite une grande maîtrise technique. Cette méthode entraîne également une perte significative de VE due à plusieurs étapes d’ultracentrifugation. Enfin, les EV enrichis en exosomes résultants ne sont pas exempts de particules virales actives en raison de leurs propriétés phénotypiques similaires. Cela a rendu difficile la purification des EV enrichis en exosomes à partir de surnageants cellulaires infectés par le virus. Il est donc important de développer un protocole optimisé pour réduire efficacement les niveaux du virus de la dengue (DENV) à des niveaux indétectables dans la solution EV enrichie en exosomes, car les virus partagent des tailles et densités similaires à celles des^{exosomes 15,16}.

Comparé à d’autres techniques couramment utilisées, ce protocole présente plusieurs avantages, notamment un temps de purification réduit, la dépendance à des équipements de laboratoire peu coûteux et largement accessibles, ainsi que la capacité d’isoler des VE enrichis en exosomes sans contamination virale vivante détectable. De plus, bien que des méthodes telles que la centrifugation à gradient de densité et l’isolation magnétique puissent offrir des avantages, notamment un rendement accru et une pureté supérieure, ces approches nécessitent une étape initiale d’ultracentrifugation. L’objectif de cet article est de présenter une méthode d’isolement des EV enrichis en exosomes provenant de surnadants infectés sans virus infectieux détectable par test de plaque dans les conditions testées.

Protocole

1. Préparation de milieux sans exosomes

1. Fixez un filtre de 0,1 μm à la base du récepteur à l’intérieur de l’armoire de biosécurité de classe II (BSC).
2. Verser aseptiquement le sérum fœtal bovin (FBS) inactivé par la chaleur sur le filtre et le fixer à la pompe à vide à l’intérieur du BSC.
3. Répétez l’étape 1.2 avec le flow through deux fois de plus.
4. Préparez un milieu complet contenant 10 % de la FBS triple filtrée, 1 % de pénicilline/streptomycine et 1 % de L-glutamine.
   REMARQUE : La méthode de triple filtration est utilisée pour éviter le besoin d’instruments tels qu’une ultracentrifugeuse.

2. Infection par le virus de la dengue des cellules de mammifères

1. Faites croître les cellules Vero toute la nuit dans une fiole de culture T75^{cm 2} à l’intérieur d’un incubateur de culture tissulaire à 37 °C avec 5 % de CO₂.
2. Le lendemain, vérifiez que la cellule est entre 70 % et 80 % de confluent et infectez les cellules avec 0,1 multiplicité d’infection (MOI) de DENV-2 dans 5 mL de milieu complet, puis incubez à 37 °C avec 5 % de_CO2 pendant 2 heures.
3. Après 2 heures, retirez le surnageant et lavez la fiole 3 fois avec du sérum tampon phosphaté stérile (PBS).
4. Ajoutez 50 mL de milieux complets dans la fiole et incubez à 37 °C avec 5 % de_CO2 pendant 4 jours (juste avant d’observer les effets cytopathiques).

3. Purification par exosomes à base de kit

1. Transférez le milieu de culture cellulaire du flacon vers un tube conique de 50 mL et centrifugez à 200 × g pendant 15 minutes à température ambiante.
2. Transférez le média dans un nouveau tube conique. Ajoutez 125 μL de réactif de précipitation EV, suivi de 600 μL de résine. Faites passer le vortex pendant 10 s et laissez-le reposer 10 minutes à l’intérieur du BSC à température ambiante.
3. Vortex pendant encore 10 secondes et centrifugeuse à environ 450 × g pendant 2 minutes à température ambiante. Transférez dans le BSC, jetez le surnageant et appliquez 600 μL de tampon de resuspension sur la pastille.
4. Vortex pendant 10 secondes et incube à température ambiante pendant 15 minutes.
5. Vortex pendant encore 10 secondes et centrifugeuse à environ 25 × g pendant 2 minutes à température ambiante.
6. Transférez le surnageant dans une colonne de filtres et centrifugez à environ 4 500 × g pendant 1 minute à température ambiante. Collectez le flux contenant des VE enrichis en exosome intacts et stockez-le à -80 °C jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi.
7. Confirmez que le VE enrichi en exosome est exempt de virus vivant en effectuant un test de plaque¹⁷.
8. Caractériser le VE enrichi en exosomes à l’aide de la microscopie électronique pour l’analyse de taille et de suivi des nanoparticules pour la distribution de taille et^{la concentration 18}.

4. Caractérisation de l’EV enrichi en exosome par western blot

1. Déterminer la concentration en protéines de la EV enrichie en exosomes à l’aide de tests tels que la BCA.
2. Mélangez des volumes égaux de solution EV enrichie en exosomes et de tampon RIPA et ajoutez 4x tampon de charge LDS (4:1).
3. Séparer les protéines EV enrichies en exosomes à l’aide d’un gel Bis-Tris à 4 à 12 %.
4. Transférez les protéines dans une membrane de nitrocellulose.
5. Bloquez pendant 1 h avec du lait écrémé à 5 % dissous dans 1x tampon Tween à température ambiante.
6. Diluez les anticorps primaires à l’aide de 5 % de lait écrémé en sec jusqu’à une dilution de 1:1 1000 et sondez la membrane à la recherche de protéines exosomeuses telles que CD63 et CD9 à 4 °C pendant la nuit.
7. Retirez l’anticorps primaire et lavez-vous 5 x 5 minutes avec 1x tampon TBS-Tween sur un bascule.
8. Diluez l’anticorps secondaire (anti-Rabbit IgG HRP) avec du lait sec écrémé jusqu’à une dilution 1:5 000 et incubez la membrane avec cette solution pendant 1 h à température ambiante.
9. Retirez l’anticorps secondaire et lavez-vous 5 x 5 minutes avec 1x tampon TBS-Tween sur un bascule.
10. Développer la membrane à l’aide du réactif de détection ECL et détecter les signaux protéiques à l’aide du dispositif d’imagerie chimiluminescente.

5. Caractérisation des EV enrichies en exosomes par microscopie électronique en transmission

1. Ajoutez 5 μL d’échantillons d’exosomes aux grilles en cuivre de 200 mailles avec un revêtement formvar et carbone, puis laissez sécher à l’air à température ambiante.
2. Colorez la grille avec de l’acétate d’uranyle aqueux à 1 % pendant 60 secondes et séchez à l’air.
3. Capturez l’image avec le MET à 80 kV¹⁸.

Résultats

Nous avons analysé la EV enrichie par exosomes isolée telle que décrite dans le protocole à l’aide d’un test de plaque afin de déterminer si nous pouvions détecter des particules actives de DENV-2 dans le mélange. Comme montré à la Figure 1, aucune plaque n’a été détectée dans les conditions testées par rapport au témoin positif. Ces résultats indiquent que le virus infectieux était en dessous du seuil de détection du test de...

Discussion

Les avancées récentes en recherche sur les maladies infectieuses ont montré que les EV enrichis en exosomes libérés par des cellules naïves infectées par le virus jouent un rôle crucial dans la modulation de la réponse immunitaire de^{l’hôte 7,8,9}. Les EV enrichis en exosomes peuvent soit renforcer la défense immunitaire en favorisant une réponse antivirale appropriée, soit, au contraire, facilite...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Anticorps lié à IgG-HRP anti-lapin	Signalisation cellulaire	7074S	Anticorps secondaire
CD63	Signalisation cellulaire	52090S	Anticorps primaire
CD9	Signalisation cellulaire	13174S	Anticorps primaire
Kit de purification d’exosomes pour milieu de culture cellulaire	Norgen	60600	Kit de purification d’exosomes
Virus de la dengue 2	ATCC	VR-1584	Virus
DMEM	Fisher scientifique	11-995-073	Médias culturels
EMEM	ATCC	30-2003	Médias culturels
Microscope électronique à transmission FEI Talos F200X	Thermofisher Scientific
Érum bovin fœtal	Névromiques	FBS002	Supplément média
Analyseur de suivi de nanoparticules	Particle Metrix
Cellules Vero	ATCC	CCL-81	Lignée cellulaire de mammifères