Article de méthode

Protocole pour la dissociation unicellulaire, le séquençage de l’ARN et l’isolement des cellules myoépithéliales et des fibroblastes des glandes lacrymales et salivaires âgées

DOI :

10.3791/70441

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24 avril 2026

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1Department of Molecular and Cellular Biology, Scripps Research Institute

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit une méthode optimisée pour dissocier les glandes lacrymales de souris âgées afin d’obtenir des cellules uniques viables pour le séquençage de l’ARN unicellulaire. La digestion enzymatique séquentielle et la manipulation douce préservent l’intégrité cellulaire, produisant des suspensions de haute qualité adaptées à l’isolement spécifique au type cellulaire et à l’analyse transcriptomique des changements associés au vieillissement dans les populations de glandes lacrymales.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le vieillissement de la glande lacrymale (LG) est associé à une réduction de la sécrétion lacrymale et à une inflammation chronique, contribuant à la sécheresse oculaire. Les modifications liées à l’âge incluent l’infiltration des cellules immunitaires, les lésions cellulaires, l’accumulation lipidique dans les cellules acinaires, le dépôt extracellulaire de la matrice et la dilatation canalale. Le séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) offre une approche puissante pour l’hétérogénéité cellulaire et les changements transcriptionnels au fil du vieillissement ; cependant, la génération de suspensions unicellulaires viables à partir de tissu LG vieilli est techniquement difficile en raison de l’augmentation de la fibrose, de la fragilité cellulaire et de l’accumulation lipidique accrue. Cette étude présente un protocole optimisé et reproductible pour la dissociation efficace des LG de souris âgées et l’isolement de plusieurs types cellulaires, adapté à l’analyse scRNA-seq en amont. Il est important de noter que ce protocole s’applique également aux jeunes glandes lacrymales, aux conjonctives et autres tissus exocrines. Le flux de travail utilise une stratégie de dissociation enzymatique par étapes utilisant la collagénase IV, la dispase II et la DNase I pour la digestion initiale des tissus, suivie d’Accutase pour dissocier les groupes cellulaires restants et d’un traitement final avec DNase I pour obtenir une suspension unicellulaire propre. Pour minimiser les dommages cellulaires, tout le plastique est pré-enduit de PBS contenant de l’albumine sérique bovine, et le traitement des tissus est effectué sous température contrôlée et agitation. La lyse des globules rouges et la filtration séquentielle à travers plusieurs tamis améliorent encore la pureté cellulaire. L’isolation spécifique au type cellulaire est obtenue à l’aide de lignées de souris rapporteures combinée au tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). En utilisant des souris Acta2 GFP et PdgfraEGFP, nous avons isolé avec succès respectivement les cellules myoépithéliales et les fibroblastes, après immunocoloration avec un anticorps EpCAM. FACS a permis la séparation de la population myoépithéliale EpCAM⁺/αSMA⁺, tandis que les cellules EGFP⁺ de souris PdgfraEGFPreprésentaient la population de fibroblastes. Ce protocole permet d’obtenir des suspensions unicellulaires viables de haute qualité à partir de LG vieillissants et peut être facilement adapté à d’autres tissus exocrines fibrotiques ou vieillissants nécessitant une dissociation douce et une isolation cellulaire ciblée.

Introduction

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La glande lacrymale (LG) est une glande tubuloacinaire exocrine responsable de la sécrétation de la couche aqueuse du film lacrymal. Tout au long de la vie, la surface cornéenne et la LG sont exposées à des infections bactériennes et virales, ce qui peut entraîner une perturbation systémique des cellules épithéliales, l’induction de réponses inflammatoires chroniques, l’infiltration des cellules immunitaires dans la LG et un manque de régénération. Le vieillissement s’accompagne d’une incidence accrue de maladies inflammatoireschroniques 1. Parmi celles-ci, la maladie de l’œil sec (DED) est l’une des dix causes les plus courantes de déficience visuelle dans le monde et contribue principalement à la diminution de l’indépendance, de la mobilité et du fonctionnement quotidien chez la populationâgée 2. Une cause principale de DEM est le dysfonctionnement LG3.

Avec l’âge, la LG de la souris et de l’humain subissent des altérations structurelles et fonctionnelles marquées, notamment l’atrophie des cellules acinaires, la dilatation canalaire, l’infiltration des cellules immunitaires, la fibrose et le dépôtlipidique 4,5,6,7. Ces changements dégénératifs s’accompagnent également d’une inflammation chronique du LG et d’une fibrose tissulaire 3,5,8,9. Malgré l’association claire entre le vieillissement et la pathologie du LG, les mécanismes moléculaires et cellulaires à l’origine de ces changements restent peu compris.

Le séquençage à ARN unicellulaire permet un profilage complet des populations cellulaires et de leurs changements transcriptionnels au cours del’âge de 10 ans. Cette approche permet une identification impartiale de types cellulaires et états distincts au sein de la glande lacrymale, révélant comment le vieillissement modifie les profils d’expression génique, l’infiltration des cellules immunitaires et les interactions épithéliaux-mésenchymates.

Actuellement, de nombreuses méthodes de dissociation tissulaire sont disponibles, notamment les méthodes de dissociation mécanique11 et des protocoles impliquant une digestion enzymatique chaude à 37 °C avec des enzymes telles que la collagénase, la dispase oula trypsine 12. Diverses stratégies de dissociation ont été décrites pour une large gamme de tissus, notamment le foie, les poumons, les reins, le cœur et plusieurs types detumeurs 13, 14, 15. Cependant, la préparation de suspensions unicellulaires viables à partir de tissu lacrymal vieilli reste techniquement difficile en raison de l’augmentation de la fibrose et de la fragilité cellulaire. De plus, comme nous l’avons déjà rapporté, la récupération des cellules acinaires fragiles peut être difficile, car les modifications associées à la dissociation dans la perméabilité membranaire peuvent augmenter la libération d’ARN ambiant de ces grandes cellules sécrétories, contribuant au signal de fond dans les ensembles de données monocellulaires enaval 16. Bien que plusieurs études aient rapporté des atlas scRNA-seq de glandes lacrimales vieillissantes, la qualité de ces jeux de données a été limitée par des méthodes de dissociation sous-optimales, ce qui a entraîné un rendement plus faible des cellules épithéliales que des populations stromales inférieures. Nous présentons ici un protocole détaillé et optimisé pour la dissociation efficace de la LG de souris vieillissante et l’isolement de populations cellulaires distinctes pour des analyses scRNA-seq et RNA-seq en masse en aval (Figure 1). Cette approche fournit un outil puissant pour étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents à la dysfonction des glandes lacrymales liées à l’âge.

Le protocole permet la génération de suspensions unicellulaires viables et de haute qualité à partir de glandes lacrymales vieillies, fournissant une base fiable pour des analyses transcriptomiques complètes. Il permet une identification détaillée et une caractérisation moléculaire de populations cellulaires diverses, y compris les cellules myoépithéliales, les fibroblastes et d’autres types cellulaires épithéliaux et stromales qui subissent des changements liés à l’âge. Le flux de travail optimisé préserve l’intégrité cellulaire et minimise les artefacts transcriptionnels induits par le stress, garantissant une représentation précise des états cellulaires in vivo. De plus, la méthodologie est largement applicable et peut être adaptée à d’autres glandes exocrines ou tissus fibrotiques, où la dissociation douce des tissus et l’isolement précis de populations cellulaires distinctes sont essentielles pour les études ultérieures sur une seule cellule.

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Protocole

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Toutes les expériences animales ont été menées conformément aux protocoles approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) à l’Institut de recherche Scripps (protocole n° 08-0123 ; approuvé le 29 août 2023). Les soins aux animaux à l’Institut de recherche Scripps sont accrédités par l’Association pour l’évaluation et l’accréditation des soins aux animaux de laboratoire (AAALAC). Les souris ont été maintenues sous un cycle standard de 12 heures de lumière et 12 heures d’obscurité avec nourriture et eau fournies à volonté à bon entendement. Les lignées transgéniques de sourisPdgfra EGFP et Acta2GFP ont été utilisées pour les expériences. Les informations détaillées sur les lignées de souris sont fournies dans la section « Tableau des matériaux ».

1. Considérations générales

  1. Suivez les Précautions Universelles17 du NIH lors de la manipulation de matériaux bio-dangereux et de tissus animaux. Effectuez tout le travail sur les animaux conformément aux protocoles approuvés de l’IACUC et aux niveaux de biosécurité animale désignés.
  2. Suivez les pratiques de sécurité standard en laboratoire en évitant la pipétation buccale, en minimisant l’utilisation de déchets tranchants, en utilisant un armoire de sécurité biologique pour les procédures de génération d’aérosols, en portant des EPI appropriés, en éliminant les objets tranchants dans des contenants résistants aux perforations, et en étiquetant et décontaminant correctement tous les déchets bio-dangereux avant leur élimination.
  3. Décontaminez régulièrement les surfaces de travail et les équipements à l’aide de désinfectants appropriés (par exemple, 10 % d’eau de Javel).
  4. Effectuer toutes les étapes de centrifugation à 4 °C dans une centrifugeuse réfrigérée pré-refroidie afin de préserver la viabilité de la cellule et de minimiser les contraintes induites par la température.
  5. Optimisez les réglages du cytomètre en flux et du trieur cellulaire pour la configuration spécifique de l’instrument et ajustez les paramètres pour chaque conjugué anticorps-fluorophore à l’aide d’échantillons témoins appropriés. Utilisez le même cytomètre et le même instrument de tri, avec des réglages fixes et optimisés, tout au long d’une série expérimentale afin de minimiser la variabilité.
  6. Préparez les solutions sélectionnées jusqu’à un jour à l’avance et conservez correctement jusqu’à utilisation. Préparez toutes les solutions dans des conditions stériles dans un placard de biosécurité.
  7. Séparez les solutions contenant Ca2+/Mg 2+ des tampons contenant de l’EDTA afin d’éviter la chélation lors des étapes enzymatiques. Tous les réactifs nécessaires à cette procédure sont présentés dans le Tableau des matériaux.

2. Ustensiles en plastique

  1. Dans des conditions stériles, préparez les vaisselles, tubes et seringues avec 1x PBS + 1 % de BSA pendant 1 heure à température ambiante (RT). Aspirez et gardez tout stérile jusqu’à utilisation.
  2. Embouts de pipette pré-revêtement. Aspirez et administrez 1x PBS + 1 % BSA trois fois avec chaque pointe pour recouvrir la surface intérieure. Remettez les embouts enduit dans la boîte à pointe stérile et laissez-les sécher toute la nuit dans un incubateur stérile. Utilisez ces embouts pré-enduit le lendemain lors de la procédure d’isolement cellulaire.

3. Solutions et tampons

  1. DNase I Stock (5 mg/mL)
    1. Préparez 150 mM de NaCl à partir de la crosse 5M NaCl et filtrez la solution en stérile.
    2. Ajoutez 1 M de CaCl₂ à la solution filtrée de 150 mM de NaCl pour obtenir une concentration finale de 5 mM de CaCl₂.
    3. Resuspendez 100 mg de DNase I dans 20 ml de tampon de 150 mM NaCl / 5 mM de CaCl₂ pour obtenir une solution d’origine DNase I de 5 mg/mL.
    4. Préparez des aliquotes de 500 μL et conservez-les à −20 °C pendant jusqu’à 6 mois. Évitez les cycles répétés de gel-dégel pour éviter la perte d’activité enzymatique.
  2. Milieu digestif
    1. La veille de l’expérience, préparez le mélange de base du milieu en mélangeant du DMEM/F12 avec 0,5 % de BSA et en le filtrant.
    2. Ajouter 1M HEPES et 1M CaCl₂ au milieu de base DMEM/F12 / 0,5 % BSA pour obtenir des concentrations finales de 15 mM et 3 mM, respectivement.
    3. Ajoutez toutes les enzymes suivantes juste avant l’utilisation : collagénase IV (1 mg/mL ; 125 U/mL), Dispase II (2,5 mg/mL ; 1,25 U/mL) et DNase I (20 U/mL ; 0,05 mg/mL à partir du stock de 5 mg/mL).
  3. Moyen de blocage 1 (BM1)
    1. Ajouter 1M HEPES et 0,5M EDTA à 1x HBSS pour obtenir des concentrations finales de 15 mM et 3 mM, respectivement.
  4. Moyen Blocant 2 (BM2)
    1. Ajoutez FBS et 1M HEPES à DMEM/F12 pour obtenir des concentrations finales de 10 % et 15 mM, respectivement.
  5. Milieu pour le traitement de la DNase
    1. La veille de l’expérience, préparez le milieu de base en mélangeant 1x HBSS avec 0,5 % de BSA et en le filtrant.
    2. Ajoutez 1M HEPES, 1M CaCl₂ et 1M MgCl₂ au milieu de base 1x HBSS / 0,5 % BSA pour obtenir des concentrations finales de 10 mM, 1,5 mM et 2 mM, respectivement.
    3. Juste avant utilisation, ajoutez la DNase I (200 U/mL ; 0,5 mg/mL provenant du stock de 5 mg/mL) dans le mélange préparé.
  6. Moyen de Blocage 3 (BM3)
    1. Utilisez le même milieu de base filtré 1x HBSS / 0,5 % BSA et ajoutez 1M HEPES et 0,5M EDTA pour obtenir respectivement des concentrations finales de 10 mM et 1 mM.
  7. Blocage Moyen 4 (BM4)
    1. Utilisez le même milieu de base filtré 1x HBSS / 0,5 % BSA et ajoutez 1M HEPES pour obtenir des concentrations finales de 10 mM.
  8. Tampon FACS
    1. La veille de l’expérience, préparez le milieu de base en mélangeant 1x DPBS avec 0,5 % de BSA et filtrez-le.
    2. Ajouter 1M HEPES et 0,5M EDTA à 1x DPBS / 0,5 % BSA pour obtenir des concentrations finales de 25 mM et 1 mM, respectivement.
  9. Milieu pour scRNAseq (MSC)
    1. La veille de l’expérience, préparez le milieu en mélangeant 1x DPBS avec 0,4 % de BSA et en le filtrant.

4. Prélèvement de tissus et microdissection (~ 40 - 50 min)

  1. Anesthésiez la souris avec de l’isoflurane et euthanasiez par luxation cervicale conformément aux directives institutionnelles de l’IACUC.
  2. Utilisez des pinces fines et des ciseaux pour inciser la peau entre l’œil et l’oreille et rétractez-la doucement pour exposer la glande lacrymale.
  3. Pour isoler la glande, soulevez-la légèrement à l’aide d’une pince à pointe émoussée et séparez soigneusement le tissu conjonctif environnant en le détachant doucement en mouvement circulaire. Les limites de la glande lacrymale sont clairement visibles, permettant une séparation facile des tissus adjacents, y compris la glande parotide.
  4. Transférez la glande lacrymale (chaque glande pesant environ 10 à 25 mg, selon le poids, le sexe et l’âge de la souris) dans une boîte de Petri de 35 mm contenant 2 mL de 1x PBS froid sur glace. Au microscope disséquant, retirez la graisse restante et décollez soigneusement la capsule du tissu conjonctif à l’aide de deux pinces.
  5. Confirmez le marquage cellulaire en examinant un petit fragment de tissu au microscope à fluorescence et en vérifiant le signal de signalement ou fluorescent attendu avant de procéder à la digestion enzymatique.
  6. Placez une boîte de Petri stérile de 35 mm sur la glace et ajoutez 800-1000 μL de PBS froid 1x (le volume ajusté à la taille de la glande) au centre de la plaquette. Transférez une glande lacrymale dans la PBS 1x.
  7. À l’aide de deux scalpels stériles, hachez finement la glande en petits fragments jusqu’à obtenir une consistance tendre et pulpeuse. Assurez-vous que les fragments de tissu restent immergés dans le PBS tout au long du processus de hachet, mais ne les laissez pas flotter librement sur le plat.
  8. Collectez les fragments de tissu d’un côté de la plaque, aspirez le PBS résiduel et lavez les fragments avec 1 mL de PBS frais froid.
  9. Transférez les fragments de tissu lavés dans une plaque à 6 puits contenant 2 mL par puits de milieu digestif préchauffé. Gardez la plaque sur la glace jusqu’à ce que tous les échantillons soient traités.

5. Première digestion enzymatique (~1,5 - 2 h)

  1. Incubez l’assiette dans un bain-marie agité à 37 °C, 60 tr/min pendant 30 minutes.
  2. Triturez doucement le tissu 15 fois à l’aide d’une pointe large de 1 mL, puis remettez la plaque dans le bain-marie à 37 °C, 60 tr/min pendant 30 minutes supplémentaires.
  3. Triturez doucement l’échantillon 10 fois avec une pointe classique de 1 mL, puis remettez la plaque dans le bain-marie secoué à 37 °C, 60 tr/min pendant 30 minutes supplémentaires.
  4. Triturez doucement l’échantillon 10 fois et transférez la suspension cellulaire dans des tubes microcentrifuges Dolphin de 2 mL.
  5. Ajoutez 1 mL de BM1 froid à chaque puits de la plaque pour collecter le milieu digestif restant contenant les cellules résiduelles. Placez la plaque sur la glace jusqu’à l’étape suivante.
    REMARQUE : Si de gros groupes cellulaires ou fragments de tissu sont encore observés à ce stade, prolongez chaque étape d’incubation de 10 à 20 minutes supplémentaires. Ne dépassez pas le nombre indiqué de passages de trituration (maximum 10 à 15 passages doux), car un stress mécanique supplémentaire compromettra la viabilité cellulaire.

6. Arrêt de l’activité enzymatique et lavages primaires (~ 15 min)

  1. Centrifugez les tubes contenant la suspension à 300 × g pendant 5 minutes à 4 °C.
  2. Écartez le surnageant. Transférez le BM1 de chaque puits de la plaque initiale (contenant les cellules résiduelles) dans le tube correspondant et resuspendez doucement les granulés cellulaires.
  3. Rincez chaque puits avec 600 μL supplémentaires de froid BM1 et combinez le lavage avec le tube correspondant pour collecter toutes les cellules restantes.
  4. Suspendez doucement la suspension de la cellule, centrifugez à nouveau à 300 × g pendant 5 minutes à 4 °C, puis jetez le surnageant.

7. Traitement par Accutase et DNase (~ 30 - 35 min)

  1. Ajoutez 1 mL d’Accutase aux granulés cellulaires et resuspendez doucement. Incubez le tube seulement 5 à 10 minutes à 37 °C et 60 tr/min.
    REMARQUE : Placez le tube sur le côté pendant l’incubation pour empêcher les cellules de se déposer et de coller au fond.
  2. Triturez doucement 10 fois avec une pointe de pipette de 1 mL.
  3. Ajoutez 1 mL de Gel 2 froid pour arrêter la réaction enzymatique en diluant l’Accutase.
  4. Centrifugez à 300 × g pendant 5 minutes à 4 °C et jetez le surnageant.
  5. Resuspendez les cellules dans le milieu pour le traitement par DNase, en remplissant le tube jusqu’au sommet.
  6. Incuber pendant 10 minutes en temps de repos, puis resuspendre doucement une fois après 5 minutes.
  7. Entre-temps, on préhumidifie un filtre de cellules de 70 μm avec 1 mL de BM3 placé sur un tube conique de 15 mL.
  8. Transférez la suspension de la cellule sur la passoire.
  9. Rincez le tube de collecte d’origine avec 1 mL de BM3 et transférez le rinçage sur la même passoire.
  10. Lavez la passoire avec 5 mL supplémentaires de BM3.

8. Comptage des cellules et vérification de viabilité

  1. Prendre 10 μL de suspension cellulaire filtrée dans BM3 et mélanger avec 10 μL de bleu de Trypan. Déterminer la concentration et la viabilité des cellules en utilisant l’exclusion du bleu de Trypan et quantifier par comptage manuel ou un compteur de cellules automatisé (par exemple, compteur de cellules automatisé Countess 3). Poursuivre seulement si la viabilité atteint le seuil requis pour les applications en aval (typiquement ≥70-80 %).
    REMARQUE : Considérez le volume total actuellement présent dans le tube de 15 mL lors du calcul du rendement.
  2. Procéder selon l’application en aval. Pour scRNA-seq, continuez jusqu’à la Section 9. Pour le tri cellulaire basé sur la cytométrie en flux, continuez jusqu’à la Section 10.
    REMARQUE : Le flux de travail scRNA-seq inclut la lyse des globules rouges et l’élimination des cellules mortes magnétiques pour réduire les débris et l’ARN ambiant et améliorer la qualité des données. Cependant, ces étapes peuvent biaiser la représentation des types cellulaires en affectant préférentiellement les populations épithéliales fragiles ou rares, y compris les cellules acinaires. Pour le tri basé sur la cytométrie en flux, ces étapes ont été omises pour maximiser la récupération et préserver les épitopes de surface cellulaire. La sélection du flux de travail doit donc être guidée par des objectifs expérimentaux, en privilégiant la qualité des données pour la récupération scRNA-seq ou cellulaire et la viabilité pour le tri et les applications en aval.

9. Préparation des cellules pour le scRNA-seq (~ 1 - 1,5 h)

  1. Préparez une solution de globules rouges en reconstituant une solution 10x avec de l’eau milliQ.
  2. Centrifugez le tube de 15 mL contenant la suspension de la cellule à 400 × g pendant 5 minutes à 4 °C et jetez le surnageant.
  3. Reposez la granule cellulaire dans 5 mL de tampon 1x globule rouge et incubez pendant 5 minutes à la réaction au repos.
  4. Centrifugez à nouveau à 300 × g pendant 5 minutes à 4 °C et jetez le surnageant.
  5. Resuspendez le comprimé cellulaire dans 2 mL de BM4 froid.
  6. Prenez 10 μL de suspension cellulaire filtrée dans BM4 et mélangez avec 10 μL de bleu de Trypan pour évaluer la concentration et la viabilité cellulaires.
  7. Préhumidifier la tamoire MACS 30 μm avec 1 mL 1x HBSS et filtrer la suspension de la cellule à travers la tamoire dans un tube de 15 mL.
  8. Rincez le tube de collecte précédent avec 2 mL de BM4 froid et faites passer le lavis à travers la même passoire dans le tube de 15 mL.
  9. Lavez la passoire avec 10 mL de BM4 froid supplémentaires.
  10. Centrifugez le tube de 15 mL à 400 × g pendant 5 minutes à 4 °C et retirez complètement le surnageant.
  11. Resuspendez doucement la pellete dans 100 μL de microperles MACS et faites éclore pendant 15 minutes à la réchauffe.
  12. En attendant, préparez 1x tampon de liaison (BB) du kit d’élimination des cellules mortes avec de l’eau stérile à double distillation.
  13. Lavez une colonne MS de MACS avec 500 μL 1x BB pour l’équilibrer.
  14. Ajoutez 400 μL de BB à l’échantillon, resuspendez les cellules avec des microperles et appliquez tout le volume sur la colonne de MS équilibrée. Collectez le flux dans un tube de 15 mL.
  15. Lavez la colonne quatre fois avec 500 μL BB chacune, en collectant toutes les fractions d’écoulement.
  16. Centrifugez le flux collecté à 400 × g pendant 5 minutes à 4 °C et jetez le surnageant.
  17. Résuspendez les cellules dans 400 μL de tampon MSC et transférez la suspension dans un tube de 1,5 mL.
  18. Rincez le tube précédent avec un tampon MSC de 700 μL et rincez le rinçage avec l’échantillon.
  19. Centrifugez à 400 × g pendant 5 minutes à 4 °C et jetez le surnageant.
  20. Resuspendez la pellete cellulaire dans un tampon MSC à l’aide d’une extrémité large jusqu’à un volume final d’environ 1,5 mL.
  21. Centrifugez à nouveau à 400 × g pendant 5 minutes à 4 °C et jetez le surnageant.
  22. Laissez ~100 μL de surnageant, resuspendez doucement la pastille, puis comptez à nouveau les cellules en mélangeant 6 μL avec 6 μL de bleu de Trypan.
  23. Ajustez le volume final avec le tampon MSC pour atteindre 700-1200 cellules/μL et recomptez les cellules pour confirmer la concentration cellulaire.
  24. Assurez-vous qu’une viabilité cellulaire après la lyse des globules rouges et l’élimination des cellules mortes est ≥ 70 % (généralement 70-95 %) avant de charger pour un traitement de chrome 10x (solution chrome monocellulaire 3' V3).
  25. Appliquer les critères de contrôle qualité de base scRNA-seq : nUMI > 500, nGene > 200, et fraction du gène mitochondrial <15 %. Utiliser un seuil mitochondrial permissif (15 %) pour préserver les populations épithéliales à activité métabolique plus élevée. N’inclure que les cellules répondant à tous les critères de QC dans les analyses en aval.
    REMARQUE : Ces seuils de QC représentent des valeurs d’exemple issues de nos jeux de données (Figure supplémentaire 1) et ont été rapportés dans notre publicationprécédente 18.

10. Préparation des cellules pour le tri cellulaire basé sur la cytométrie en flux (~ 1 - 1,5 h)

  1. Pour l’isolation des MEC et fibroblastes par cytométrie en écoulement, des lignées de souris rapporteures PdgfraEGFP et Acta2 GFP ont été utilisées, respectivement, afin de permettre une identification précise de chaque population.
  2. Centrifugez le tube de 15 mL avec suspension à cellules à 400 × g pendant 5 minutes à 4 °C et jetez le surnageant.
  3. Résuspendez la pellete de cellule dans un tampon FACS froid à une concentration finale de 5 x 10⁵ à 2 x 106 cellules par 100 μL.
  4. Préparez les contrôles nécessaires à la compensation FACS : contrôle négatif - cellules non colorées d’une souris de type sauvage, contrôle de fluorescence de fond - cellules non colorées de souris Acta2 GFP et PdgfraEGFP, contrôle par une seule coloration - cellules d’une souris de type sauvage colorées individuellement avec chaque anticorps utilisé dans l’expérience.
    REMARQUE : Pour chaque échantillon témoin, utilisez au moins 1 × cellules 10⁵ resuspendues dans 100 μL de tampon FACS.
  5. Ajoutez le blocage de Fc (1:100) et faites couver pendant 5 minutes sur la glace.
  6. Ajouter un anticorps monoclonal CD326 (EpCAM)-APC (1:100) ou un anticorps monoclonal CD140a (PDGFRα) (1:100). Incuber pendant 45 minutes sur de la glace, protégé de la lumière.
  7. Resuspendez doucement les cellules toutes les 15 minutes pendant l’incubation des anticorps.
  8. Remplissez chaque tube jusqu’en haut avec un tampon FACS froid et centrifugez à 300 × g pendant 5 minutes à 4 °C.
  9. Préparez la solution de travail FxCycle (1:1000) dans le tampon FACS.
  10. Resuspendez les échantillons à 1 mL et contrôlez dans 500 μL de tampon FACS froid avec FxCycle.
  11. Transférez tous les échantillons dans des tubes FACS et gardez-les sur glace, à l’abri de la lumière.
  12. Passer immédiatement au noyau de cytométrie en flux pour le tri. Collecter les cellules triées dans le tampon FACS, le milieu de culture, le tampon de lyse ou l’ARN plus tard, selon les applications en amont.
    REMARQUE : Les réglages de l’instrument (par exemple, taille et pression de la buse) et les taux d’événements dépendent de la configuration du trieur et de la population de cellules cibles ; par conséquent, une première mise en jet pilote est recommandée pour déterminer les paramètres optimaux pour chaque expérience.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La dissociation des glandes exocrines vieillies est difficile en raison de l’accumulation lipidique et du dépôt important de MEE. Les glandes vieillies présentent une infiltration lymphocytaire marquée et une dilatation canalaire prononcée avec le matériau intraluminal, reflétant les changements structurels et inflammatoires qui compliquent la dissociation tissulaire. La glande lacrymale est un organe exocrine composé de trois principaux types cellulaires épithéliaux : les cellules acina...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous avons optimisé et évalué un protocole significativement amélioré pour générer des suspensions unicellulaires à partir de tissus exocrines, en se concentrant sur la glande lacrymale. Grâce à cette approche, nous avons généré des suspensions unicellulaires propres et de haute qualité à partir de LG anciens et jeunes, adaptées au séquençage unicellulaire et à d’autres applications en aval.

Malgré la disponibilité de nombreux protocoles de dissociation ...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tous les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par le National Institute of Health, le National Eye Institute (NEI), États-Unis, subventions 5R01EY026202, R01EY035333 ; les subventions du National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) R01DE031044, 2R01DE014756, et 5R01CA271500 du National Cancer Institute (NCI).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
< fort>Matériel
BSA  ;Sigma-AldrichA4919
CaCl2 (1  ; Solution M)BioVisionB1010-100
Colagnase IVSigma-AldrichC5138
Kit d’enlèvement des cellules mortesMiltenyi biotec130-090-101
Kit d’enlèvement des cellules mortesMiltenyi biotec130-090-101
Dispase IIRocheC756V28
DNase ISigma-AldrichDN25-100MG
DPBS  ;Gibco, Thermo Fisher Scientific14190-144
Sérum bovin fœtal, IgG ultra-faibleGibco# 16250078
La solution salée équilibrée de Hank (HBSS)Corning (Thermo Fisher Scientific)21-022-CV
HEPES (1  ; Solution M)Sigma-AldrichH0887
Solution d’isofluraneCovertus# 11695067772
MACS® ; SmartStrainers (30 & micro ; m)Miltenyi biotec130-098-458
MACS® ; SmartStrainers (70 & micro ; m)Miltenyi biotec130-110-916
Moyen/F12 (DMEM/F12)MilliporeDF-042-B
MgCl2 1MSigma-AldrichM1028-100ML
Chroniques MSMiltenyi biotec130-042-201
NaCl (stock 5M)Invitrogen & échange ;AM9759
Comprimés de solution physiologique tamponnée au phosphate (PBS)Sigma-AldrichP8920-500ML
Solution de lyse des globules rouges (10 et plus fois)Miltenyi biotec130-094-183
StemPro Accutase  ;Gibco, Thermo Fisher ScientificA1110501
Solution Trypan Blue, 0,4 %Gibco, Thermo Fisher Scientific15250061
EDTA ultra-pur (0,5M, pH 8,0)Invitrogen15575020
< fort>Anticorps
Anticorps monoclonal CD140a (PDGFRA) (APA5), APC-eFluor & trade ; 780, Rat / IgG2a, kappaeBioscience47-1401-82; RRID : AB_2784706
FcBlock (bloqueur de Fc CD16/CD32)BD en biosciences & nbsp ;553141; RRID : AB_394656
FxCycle & commerce ; Tache de violetThermo Fisher ScientificF10347
Anticorps monoclonal du rat CD326 (EpCAM) - APC (G8.8), IgG2a du rat, kappaeBioscience17-579182; RRID : AB_2716944
souris
Acta2GFP  ; Cadeau gentil du Dr Ivo KalajzicPMID : 18571490
PdgfraEGFP  ; - B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/JLe laboratoire JacksonRRID : IMSR_JAX : 007669
Équipement
Invitrogen & échange ;   ; Comtesse & commerce ; 3 Compteur de cellules automatiséFisher ScientificA49862 ; RRID : SCR_026963

Références

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Mots-clés

Single Cell RNA SequencingLacrimal Gland DissociationMyoepithelial Cell IsolationFibroblast IsolationFlow CytometryAged Lacrimal GlandTissue DigestionCell SortingEpCAM ImmunostainingPDGFR Alpha Fibroblasts

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