Synthèse, encapsulation de l’hémoglobine et PEGylation biorthogonale dans des nanoparticules hiérarchiquement poreuses d’UiO-66 pour applications d’apport d’oxygène

Résumé

Ce protocole détaille la synthèse, l’encapsulation de l’hémoglobine et la PEGylation de surface des nanoparticules hiérarchiquement poreuses d’UiO-66 conçues pour la délivrance d’oxygène. La procédure combine l’ingénierie des défauts avec la conjugaison biorthogonale promue par la contrainte pour générer des porteurs hautement perméables et physiologiquement stables, adaptés aux applications biomédicales.

Résumé

Les porteurs d’oxygène à base d’hémoglobine (HBOC) constituent une plateforme importante pour l’apport d’oxygène afin d’atténuer l’hypoxie dans plusieurs contextes biomédicaux. Cependant, l’hémoglobine libre (Hb) est instable et vasoactive à l’extérieur des globules rouges. Ici, nous présentons un protocole reproductible, évolutif, étape par étape pour fabriquer des nanoparticules hiérarchiquement poreuses d’UiO-66 (HP-UiO-66 NP) qui encapsulent Hb et sont stabilisées par des coques bioorthogonales de polyéthylène glycol (PEG). La mésoporosité hiérarchique est introduite par modulation de l’acide dodécanoïque et un lavage acide subséquent, produisant des NP HP-UiO-66-NH₂ avec cristallinité préservée et des isothermes combinés de type I/IV_N2 . Les amines de surface sont converties en azides (HP-UiO-66-N₃ NP), permettant la cycloaddition alkyne-azide promouvée par la souche sans catalyseur (SPAAC) de produire des NP Hb@HP-UiO-66-PEG. Le flux de travail comprend : i) l’ingénierie des défauts des NP UiO-66-NH₂, ii) le retrait du modulateur, iii) l’installation d’azides, iv) la charge de Hb dans des milieux aqueux tamponnés, et v) la PEGylation médiée par SPAAC. Des paramètres expérimentaux critiques, des modes de défaillance standards et des stratégies de dépannage sont détaillés à chaque étape afin d’améliorer la reproductibilité inter-laboratoire. Le protocole est compatible avec la production à l’échelle de grammes de NP HP-UiO-66-NH₂ par lot. Des rendements d’encapsulation de ~35 % (contenu en charge ~24 en poids) pour Hb sont obtenus dans des conditions douces, avec des NP redispersables d’un diamètre hydrodynamique de ~140 nm et d’une faible polydispersion après PEGylation. Une caractérisation physicochimique complète vérifie l’intégrité de la structure, la mésoporosité, la chimie de surface réussie et une couronne diffuse de PEG jusqu’à ~12 nm de large. Les tests fonctionnels montrent une oxygénation/désoxygénation réversible de l’Hb encapsulé, indiquant une capacité conservée de transport d’oxygène. La PEGylation améliore nettement la stabilité colloïdale et structurelle dans le sérum physiologique, le HEPES et le sérum, empêchant la dégradation induite par le phosphate observée chez les homologues non PEGylés. En intégrant des conseils détaillés de dépannage, la visualisation assistée par vidéo des étapes critiques et des considérations sur la mise à l’échelle, ce protocole modulaire offre une voie robuste et accessible vers les HBOC basés sur un framework metal-organic. La stratégie est facilement adaptable à d’autres biomacromolécules ou enzymes nécessitant des microenvironnements protecteurs mais accessibles pour une administration thérapeutique.

Introduction

Une oxygénation adéquate est essentielle pour une thérapie efficace et une guérison des tissus dans divers contextes^{biomédicaux 1}. En cas de traumatisme et d’hémorragie chirurgicale, une perte d’oxygène sévère peut être mortelle, ce qui souligne la nécessité de substituts sanguins sûrs lorsque le sang du donneur est indisponible². En oncologie, les régions tumorales hypoxiques limitent l’efficacité des traitements dépendants de l’oxygène, et une apport supplémentaire d’oxygène peut considérablement améliorer l’efficacité^{thérapeutique} 3,4,5,6. L’oxygène joue également un rôle central dans la cicatrisation des plaies, où une disponibilité accrue favorise l’angiogenèse et la réparation des^tissus. De même, dans les conditions ischémiques et la transplantation d’organes, les porteurs d’oxygène peuvent réduire les lésions hypoxiques et améliorer la viabilité et la récupération des^{tissus 8,9}.

Les porteurs d’oxygène synthétiques à base d’hémoglobine (Hb) représentent une approche prometteuse pour atténuer l’hypoxie¹⁰. Cependant, l’Hb en dehors des globules rouges (globules rouges) est intrinsèquement instable et se dissocie rapidement en dimères, ce qui peut provoquer néphrotoxicité, lésions oxydatives et vasoconstriction due à la récupération de l’oxyde^{nitrique 11}. Pour atténuer ces défis, des stratégies d’encapsulation ont été développées pour stabiliser l’Hb au sein de nanoporteurs biocompatibles tels que les liposomes¹²,^{polymésomes 13} et nanoparticules polymériques (NP) 14,15,16,17. Bien que ces systèmes améliorent la stabilité du Hb, atteindre une grande efficacité d’encapsulation tout en préservant la fonction native de liaison à l’oxygène reste^{un défi 18}. De plus, la conversion oxydative en méthémoglobine et fuite d’hème peut compromettre la performance de transport d’oxygène¹⁹. Une élimination rapide et une fuite prématurée d’Hb limitent encore le temps de circulation et la translation clinique²⁰.

Les structures métal-organiques (MOF) sont récemment apparues comme des nanoplateformes polyvalentes pour la délivrance de médicaments et de biomacromolécules en raison de leur architecture cristalline, de leur grande surface et de leur porosité^{accordable 21}. Composés de nœuds métalliques coordonnés avec des liaisons organiques, les MOF permettent la diffusion moléculaire et la personnalisation structurelle, ce qui les rend attrayants pour des applications biomédicales. Cependant, la plupart des MOF possèdent principalement des cavités microporeuses (<2 nm), qui restreignent sévèrement l’encapsulation post-synthétique de macromolécules telles que les protéines, les acides nucléiques ou^{les enzymes} 22,23,24,25. Une approche pour surmonter cette limitation est la minéralisation biomimétique in situ, où les biomolécules agissent comme centres de nucléation lors de la croissance de la MOF, comme démontré pour ZIF-8 et ZIF-90 26,27,28. Malgré son efficacité, cette stratégie nécessite des conditions de synthèse légères, qui restreignent la gamme des chimies MOF^{compatibles 29,30}.

UiO-66, un MOF à base de zirconium construit à partir de nœuds octaédriques_{Zr 6O 4}(OH)₄ et de liaisons 1,4-benzènicarboxylate (BDC), se distingue par sa stabilité chimique exceptionnelle et sa^{biocompatibilité 31}. Son cadre robuste résiste à la décomposition dans les milieux aqueux et physiologiques, ce qui le rend idéal pour des applications^{biomédicales 32}. Néanmoins, sa structure microporeuse intrinsèque limite son utilité pour l’encapsulation de biomacromolécules. Hb, d’une dimension moléculaire de ~5 nm, ne peut pas être logé dans les pores internes d’UiO-66 immaculé. De manière correspondante, seul un nombre limité d’études ont exploré UiO-66 dans des systèmes liés à Hb, dans lesquels les MOF sont principalement utilisés pour la détection de Hb basée sur la surface plutôt que pour l’encapsulement^{de cadre 33,34}. En conséquence, les plateformes basées sur UiO-66 pour l’encapsulation Hb restent relativement peu développées.

Très récemment, nous avons introduit un NP hiérarchiquement poreux UiO-66 (HP-UiO-66 NP) qui surmonte cette restriction de taille de pore en incorporant des domaines mésoporeux capables d’accueillir Hb, étendant ainsi le champ fonctionnel d’UiO-66 pour le développement de^{l’HBOC 35}. La porosité hiérarchique est introduite par l’ingénierie des défauts, plus précisément en utilisant des acides monocarboxyliques à longue chaîne, tels que l’acide dodécanoïque (DA), comme modulateurs lors de la synthèse^36,37. Ce modulateur est en concurrence avec le ligand BDC pour la coordination avec Zr⁴⁺, ce qui entraîne la formation de défauts et un agrandissement des mésopers. Le retrait ultérieur du modulateur donne des NP HP-UiO-66 contenant des domaines micro- et mésoporeux coexistants, avec une taille de pore accordable par concentration du modulateur ou longueur^{de chaîne 36}.

Bien que l’introduction de la mésoporosité améliore l’accessibilité moléculaire, elle peut également compromettre l’intégrité du cadre dans les tampons contenant du phosphate. Les ions phosphate peuvent se coordonner avec les amas Zr, conduisant à une désintégration structurelle partielle ou complète^38,39. En conséquence, des stratégies de stabilisation de surface sont essentielles pour préserver la stabilité colloïdale et chimique dans des conditions^{physiologiques.} En général, la stabilisation de surface MOF peut être obtenue par des interactions non covalentes (par exemple, interaction de van der Waals et liaisons hydrogène)⁴¹, des interactions de coordination avec des sites métalliques^{exposés 42}, ou une fixation covalente à des liaisons^{organiques 43}. Parmi les différents liants, le polyéthylène glycol (PEG) est particulièrement attrayant en raison de sa large disponibilité et de sa complexité synthétique^{minimale 44}. Il est important de noter que la modification de surface du PEG, communément appelée PEGylation, confère plusieurs propriétés favorables aux systèmes d’administration de médicaments, notamment une excellente biocompatibilité, une adsorption de protéines non spécifiques réduite, ainsi qu’une reconnaissance immunitaire et une absorption des macrophages^{réduites 45,46}. Collectivement, ces effets réduisent les réponses immunogènes et prolongent la circulation^{systémique 47}.

Les techniques traditionnelles de PEGylation reposent souvent sur la chimie du carbodiimide ou du maléimide, qui nécessite généralement des catalyseurs ou des intermédiaires réactifs pouvant endommager des biomolécules sensibles, comme le Hb. Pour contourner cette limitation, nous utilisons la cycloaddition alkyne-azide promue par souche (SPAAC), une réaction bioorthogonale sans catalyseur entre des espèces fonctionnalisées par azide et dibenzylcyclooctyne (DBCO), permettant une conjugaison spécifique au site dans des conditions aqueuses^{douces 35,48}. Cette approche garantit une modification efficace de la surface sans compromettre la fonction de l’Hb encapsulé.

S’appuyant sur nos NPs³⁵ HP-UiO-66 précédemment rapportés, axés sur la conception structurelle et la validation biofonctionnelle, le protocole actuel met l’accent sur la transparence méthodologique et la reproductibilité en fournissant un flux de travail expérimental détaillé, étape par étape, avec des plages de paramètres définies et des considérations critiques en matière de traitement. Des conseils de dépannage sont inclus pour les étapes clés de la synthèse, l’encapsulation Hb et la PEGylation via la chimie SPAAC, aboutissant finalement à des NP Hb@HP-UiO-66-PEG stables (voir Figure 1).

Le flux de travail comprend : (i) l’ingénierie des défauts utilisant DA comme modulateur pour synthétiser_{des NP} HP-UiO-66-NH 2 modifiés par les aminos ; (ii) fonctionnalisation azidique des groupes amines de surface ; (iii) encapsulation de Hb dans des conditions douces et aqueuses ; (iv) conjugaison covalente du PEG via SPAAC.

Pour chaque étape majeure, ce protocole identifie des défis expérimentaux courants, tels que l’agrégation de particules, l’effondrement des pores ou la fonctionnisation inefficace des surfaces, et propose des stratégies pratiques de dépannage pour améliorer la reproductibilité inter-laboratoire. Il est important de noter que cet article démontre largement que la synthèse des NP HP-UiO-66 est facilement évolutive, permettant une production fiable à l’échelle de grammes par lot.

Les nanoporteurs finaux PEGylés présentent une grande stabilité colloïdale dans le sérum physiologique, l’acide 4-(2-hydroxyétyl)-1-piperazine-éthanasyllopique (HEPES) et le sérum, tout en maintenant une capacité de liaison et de libération de l’oxygène^{de 35} % de l’Hb. Des méthodes analytiques telles que la spectroscopie infrarouge par transformée de Fourier (FTIR), la résonance magnétique nucléaire (RMN), la diffraction des rayons X en poudre (PXRD), la sorption à l’azote (N₂), l’analyse du potentiel zeta (ζ), la diffusion dynamique de la lumière (DLS), la microscopie électronique à balayage (SEM) et la microscopie électronique en transmission (TEM) confirment la transformation chimique, l’intégrité du cadre, la porosité, la morphologie à l’échelle nanométrique et la fonctionnalisation réussie de surface.

En mettant l’accent sur la reproductibilité, la scalabilité et la clarté opérationnelle, soutenues par la visualisation vidéo d’étapes techniquement sensibles, cette méthodologie offre une voie reproductible, robuste et accessible pour fabriquer des porteurs d’oxygène stables à base de MOF. Il est important de noter que l’approche est modulaire et facilement adaptable à d’autres biomacromolécules ou enzymes nécessitant un microenvironnement protégé mais perméable à l’oxygène pour conserver leur fonctionnalité. En conséquence, les NP Hb@HP-UiO-66-PEG représentent une avancée prometteuse vers la création de HBOC capables de délivrer l’oxygène efficacement tout en résistant à la dégradation dans les fluides biologiques.

D’un point de vue pratique, cette stratégie peut être étendue à d’autres biomacromolécules au-delà de Hb, à condition qu’elles aient des dimensions inférieures à environ 20 nm, correspondant à la taille maximale accessible du mésopore, et présentent une ou plusieurs des caractéristiques suivantes : (i) sensibilité aux conditions chimiques difficiles, favorisant une synthèse légère et une modification de surface ; (ii) l’exigence d’un microenvironnement hydraté et perméable à l’oxygène pour maintenir une activité fonctionnelle ; et (iii) la susceptibilité à la dégradation MOF induite par le phosphate, nécessitant une stabilisation de surface. L’approche repose sur des densités modérées de défauts pour équilibrer l’accessibilité du mésopore avec l’intégrité du cadre. Lorsque la modification de surface sans catalyseur et spécifique au site est nécessaire pour préserver la fonction des biomolécules, la PEGylation basée sur SPAAC offre des avantages évidents. Par conséquent, ce protocole est bien adapté à une charge efficace des biomacromolécules, à la préservation fonctionnelle et à la stabilité colloïdale à long terme dans des conditions physiologiques, tandis que des biomolécules ou systèmes nettement plus grands nécessitant une stabilité thermique ou acide extrême peuvent nécessiter des plateformes MOF alternatives.

Protocole

1. Extraction de Hb (durée prévue : 2 jours)

REMARQUE : L’extraction de Hb à partir du sang bovin commercialement disponible (SSI Diagnostica A/S, Hillerød, DK) est réalisée selon notre protocole⁴⁹ précédemment signalé.

1. Transférez le sang bovin (généralement 10 mL par extraction) dans un tube centrifuge conique de 50 mL. Ajoutez un volume égal de solution saline à 0,9 % (v/p) pour diluer le sang et réduire la viscosité. Inversez doucement plusieurs fois jusqu’à obtenir une suspension homogène.
2. Centrifugez le sang dilué à 1 500 x g pendant 20 minutes à 4 °C. Après centrifugation, un supernageant jaune clair (plasma) apparaît au-dessus d’une granule rouge dense (GR). Si le granulage complet n’est pas réalisé, il faut poursuivre la centrifugation si nécessaire.
3. Décantez soigneusement et jetez la couche de plasma sans déranger la pastille. Ajoutez du sérum physiologique frais (10 mL), resuspendez la pellete de globules rouges par inversion douce, puis répétez l’étape de centrifugation dans des conditions identiques. Effectuez deux cycles de lavage au total pour éliminer les protéines plasmatiques et les plaquettes.
   REMARQUE : Le processus de lavage est crucial pour obtenir des globules rouges purs, exempts de contaminants plasmatiques pouvant interférer avec l’extraction du toluene en aval.
4. Après le second lavage, jetez le surnageant et remettez en suspension la granule de globules rouges nettoyés dans un mélange de toluène, d’eau ultrapure et de solution saline au rapport volume de 1:0,4:1. Par exemple, mélangez 10 mL de toluène, 4 mL d’eau ultrapure et 10 mL de solution saline dans un entonnoir séparateur de 50 mL avant d’ajouter la pellete.
5. Scellez l’entonnoir et inversez doucement plusieurs fois pour mélanger les phases. Placez l’entonnoir à 4 °C toute la nuit (~12-16 h) pour permettre une séparation complète des phases. La phase toluène extrait les membranes lipidiques, laissant une phase aqueuse claire enrichie en Hb.
6. Le lendemain, collectez soigneusement la couche aqueuse inférieure à l’aide du robinet d’arrêt de l’entonnoir séparateur. Cette couche paraît transparente et rouge foncé.
7. Transférez la solution aqueuse de Hb dans des tubes centrifugeuses et faites tourner à 8 000 g pendant 20 minutes à 4 °C pour éliminer tout débris cellulaire ou matière émulsifiée restante.
8. Filtrez le surnageant à travers une frite de terre de diatomée à l’aide d’un système de filtration sous vide. Appliquez uniquement un vide doux (évitez une pression négative élevée qui pourrait provoquer de la mousse ou une dénaturation des protéines).
9. Collectez le filtrat contenant de l’Hb sans stroma. Conservez ce stock sur glace si utilisé immédiatement, ou en aliquote (~1 mL) et congelez à −80 °C pour une utilisation prolongée.
   REMARQUE : Les aliquotes Hb peuvent être stockées congelées pendant plusieurs mois sans dégradation détectable.
10. Quantifier la concentration d’Hb à l’aide d’un test protéique à l’acide bicinchoninique selon le protocole du fabricant, en utilisant du Hb bovin pur comme étalonnage. Ajustez la réserve finale de Hb à la concentration de travail souhaitée (généralement 20 mg ^mL-1 dans le tampon HEPES, pH 7,4).
    REMARQUE : Attendez-vous à une solution claire et rouge de Hb, sans matière cellulaire.
11. Optionnel : mesurer les spectres d’absorption UV-vis (375-700 nm) de l’Hb extrait pour évaluer sa capacité de liaison et de libération d’oxygène. Enregistrez le spectre UV-vis initial. Ajoutez du dithionite de sodium et purgez avec du gaz_N2 pendant 10 minutes pour libérer de l’oxygène, puis enregistrez le spectre de l’Hb désoxygéné. Ensuite, purgez avec de l’air pendant 10 minutes pour permettre la réoxygénation et réenregistrez le spectre.
    REMARQUE : La présence de bandes Soret et Q caractéristiques de Hb oxygénée (~412 nm pour la bande Soret ; ~541 et ~577 nm pour les bandes Q) et désoxygénée (~430 nm pour la bande Soret ; ~557 nm pour la bande Q) après purge avec de l’air et N₂, respectivement, indique que Hb reste fonctionnel (Figure supplémentaire 1).
    ATTENTION : Manipulez le toluène avec précaution dans une hotte à défumation tout en portant un équipement de protection individuelle approprié, y compris une blouse de laboratoire, des lunettes de sécurité et des gants. Dans la présente étude, tous les déchets liquides contenant du toluène ont été collectés et éliminés sous forme de déchets chimiques organiques liquides dans des contenants désignés (Groupe C), étiquetés « toluène et mélange », conformément aux directives du ministère danois de l’Environnement. La documentation correspondante sur l’élimination des déchets est fournie dans le Fichier Supplémentaire 1.

2. Fabrication de NP HP-UiO-66-NH₂ (Durée prévue : 3 jours)

ATTENTION : HCl (37 %) est corrosif ; Manipulez dans une hotte avec une blouse de laboratoire, des gants résistants aux acides et une protection oculaire appropriée. Ajoutez de l’acide lentement et évitez d’inhaler des vapeurs.

1. Pesez_{ZrCl 4} (400 mg, 1,715 mmol) dans une fiole à fond rond de 250 mL. Ajoutez lentement du DMF (80 mL) et ultrasoniquez pendant 5 minutes pour dissoudre complètement_{ZrCl 4}. Ajoutez de la DA (12 g, 60 mmol) et ultrasoniquez pendant 30 minutes supplémentaires jusqu’à obtenir une solution claire et homogène. Mesurez le volume total de la solution à l’aide d’un cylindre gradué et ajoutez du DMF selon les besoins pour ajuster le volume final à 100 mL. DA agit comme un modulateur compétitif, introduisant des défauts contrôlés du réseau.
   REMARQUE : Ajouter du DMF lentement lors de la dissolution du ZrCl₄, car le processus de coordination est exothermique et peut provoquer de légères fumées ; Effectuez toutes les opérations dans une hotte à fumée. Tenir compte de l’augmentation de volume causée par l’incorporation de DA en utilisant un volume initial de 80 mL de DMF pour dissoudre_{ZrCl 4} et DA, et ajuster le volume final à 100 mL seulement après une dissolution complète afin d’assurer un contrôle précis de la concentration.
2. Ajoutez l’acide 2-amino-1,4-benzène-carboxylique (_{BDC-NH 2}, 155 mg, 0,857 mmol) dans la même fiole et sonicez pendant 30 minutes supplémentaires. Continuez jusqu’à obtenir une solution homogène jaune pâle.
3. Transférez le mélange dans un autoclave ou un réservoir à fond rond doublé de Téflon de 150 mL, adapté à la synthèse solvothermique. Scellez hermétiquement et placez-le dans un four à étouffement préchauffé à 120 °C pendant 18 heures. Ne pas perturber le réacteur lors du chauffage afin d’éviter une nucléation incontrôlée.
4. Après la réaction, éteignez le four et laissez le récipient refroidir naturellement à température ambiante (~2 h). Observez une fine suspension jaune apparaissant uniformément dans tout le milieu.
5. Collectez le produit par centrifugation (11 000 x g, 10 min, température ambiante) et jetez le surnageant. Rincez le pellet avec du DMF (100 mL) trois fois en utilisant les mêmes conditions de centrifugation pour éliminer l’excès de ligand et le DA non réagi. Si le produit n’est pas complètement granulé, prolongez le temps de centrifugation si nécessaire.
6. Préparez une solution d’élimination acide composée de DMF (100 mL) contenant 0,5 mL de HCl concentré (37 %). Immergez complètement les granulés lavés dans cette solution et chauffez-les dans un four à amortissement à 90 °C pendant 12 heures. Cette étape retire le modulateur DA, créant des mésopores à l’intérieur de la structure.
7. Après 12 heures, centrifugez (11 000 x g, 5 min, température ambiante) et jetez le surnageant. Répétez le traitement à l’acide avec un nouveau lot de DMF contenant 0,5 mL HCl pour assurer l’élimination complète de la DA. Si le produit n’est pas complètement granulé, prolongez le temps de centrifugation si nécessaire.
8. Lavez les granulés séquentiellement avec du DMF, de l’acétone et de l’éthanol (100 mL, 11 000 x g, 5 min, température ambiante) pour éliminer tout acide et solvant résiduels. Si le précipité n’est pas complètement granulé, prolonger le temps de centrifugation si nécessaire. Entre chaque lavage, redispersez doucement la pellete par vortex ou par une sonication légère.
9. Faites sécher le produit dans un four sous vide (140 °C) toute la nuit après avoir séché dans une hotte à fumée ambiante. Les matériaux finaux (HP-UiO-66-NH₂ NP) apparaissent sous forme de fine poudre jaune. Attendez-vous à un rendement typique de ~428 mg.
10. Confirmer que les pics de PXRD à 2θ = 7,3°, 8,4°, 25,7° restent nets (Figure 2A), indiquant la rétention de la topologie cristalline UiO-66. Vérifier l’élimination complète de la DA par ^{RMN d'1}h après une digestion alcaline (2 M KOH en_{D 2}O) (aucun pic de méthylène à 1,2 ppm) (Figure 2B).
11. Caractériser la porosité par adsorption-désorption N₂ à 77 K⁵⁰. La courbe présente une combinaison d’isothermes de type I/IV avec une boucle d’hystérésis (Figure 2C), confirmant la formation du mésopore.
    REMARQUE : Un séchage incomplet à haute température ou une masse d’échantillon insuffisante conduisent à des mesures de porosité inexactes utilisant les isothermes d’adsorption-désorption N₂ ; répétez le processus de séchage sous vide à 140 °C et assurez-vous que le poids de l’échantillon dépasse 100 mg si la zone Brunauer−Emmett−Teller (BET) est < 1 000^{m 2 g-1}.
12. Optionnel : évaluer la morphologie des NP à l’aide du MEB. Les NP HP-UiO-66-NH₂ présentent une morphologie sphérique avec une distribution étroite de ~100 nm (Figure 2D).
    REMARQUE : Attendez-vous à_{des NP} HP-UiO-66-NH 2 possédant à la fois des micro- et des mésopores, adaptés à une encapsulation ultérieure de Hb.
13. La synthèse_{des NP} HP-UiO-66-NH 2 peut être augmentée en augmentant proportionnellement tous les réactifs et solvants utilisés aux étapes 2.1 à 2.9 et en réalisant plusieurs réactions solvothermiques parallèles. En maintenant les mêmes rapports molaires, concentrations, température de réaction et temps de réaction, et en augmentant les quantités de réactifs et de solvants d’un facteur 1,5, deux autoclaves ou récipients à fond rond de 150 mL ou autoclaves à fond rond de 150 mL peuvent fonctionner simultanément, permettant la production à l’échelle du gramme_{de NP} HP-UiO-66-NH 2 (Figure 3).
    REMARQUE : Manipulez tous les solvants organiques à l’intérieur d’une hotte à fumée en portant une blouse de laboratoire, des gants résistants aux acides et une protection oculaire appropriée. Collecter tous les déchets liquides contenant du DMF et les éliminer sous forme de déchets chimiques organiques liquides dans des contenants désignés (Groupe C) étiquetés « DMF et mélange » conformément aux directives du ministère danois de l’Environnement. Les solutions de déchets contenant de faibles quantités de ZrCl₄ et HCl ont été traitées en conséquence. La documentation correspondante sur l’élimination des déchets est fournie dans le Fichier Supplémentaire 1.

3. Fonctionnalisation azidique des NP HP-UiO-66-NH₂ (NP HP-UiO-66-N₃ ) (Durée attendue : 1 jour)

ATTENTION : L’azide de triméthylsilyle (TMSN₃) et le nitrite de tert-butyl (tBuONO) sont toxiques et volatils. Effectuez toutes les étapes dans une hotte à fumée en portant une blouse de laboratoire, des gants en nitrile et une protection oculaire.

1. Pèser avec précision les HP-UiO-66-NH₂ NP (50 mg) dans une fiole à fond rond de 25 mL. Ajoutez du THF (10 mL) et ultrasoniez pendant 5 minutes pour disperser complètement les particules. La suspension devient opaque mais uniforme.
   REMARQUE : Une dispersion uniforme des NP après la sonication est cruciale pour un contact efficace avec les réactifs. Si la dispersion est incomplète, augmentez le volume de la solution et répétez la sonication.
2. Placez la flasque dans un bain d’eau glacée (0 °C) sur un agitateur magnétique réglé à 400 tr/min. À l’aide d’une seringue en verre, ajoutez tBuONO (0,4 mL) goutte dans la goutte pendant 5 minutes tout en maintenant la température en dessous de 5 °C.
3. Ajoutez immédiatement TMSN₃ (0,35 mL) goutte à goutte dans les mêmes conditions froides. Une légère effervescence peut apparaître, indiquant une progression de la nitrosation. Enveloppez le bain dans du papier aluminium pour protéger la réaction de la lumière...
4. Continuez à brasser le mélange de réaction toute la nuit (~16 h) dans le bain d’eau glacée pour permettre la substitution complète des groupes amine par azide à la surface de la MOF.
5. Retirez le bain de glace et laissez la suspension atteindre la température ambiante. Centrifugeuse (11 000 x g, 5 min, température ambiante) pour collecter les NP modifiés. Si le précipité n’est pas complètement granulé, prolonger le temps de centrifugation si nécessaire.
6. Lavez soigneusement le pellet avec THF (10 mL) trois fois, puis le collectez par centrifugation (11 000 x g, 5 min, température ambiante) après chaque lavage. Suivez trois lavages supplémentaires à l’aide d’acétone (10 mL), centrifugés dans les mêmes conditions, pour éliminer les réactifs résiduels et les sous-produits. Si le précipité n’est pas complètement granulé, prolonger le temps de centrifugation si nécessaire.
7. Séchez le produit (HP-UiO-66-N₃ NP) sous vide au four (140 °C) toute la nuit après séchage ambiant dans une hotte à fumée. Attendez-vous à un rendement typique de ~45 mg.
8. Vérifiez la transformation chimique par spectroscopie FTIR : un étirement asymétrique net de l’azide apparaît à ~2122 ^cm-1 (Figure 4A). L’intensité de la bande est corrélée à l’efficacité de substitution de surface.
   REMARQUE : Une conversion incomplète peut nuire à la conjugaison ultérieure des clics. Si la bande d’azide est faible, répétez la fonctionnalisation en utilisant des quantités multipliées par deux de tBuONO et TMSN₃. Attendez-vous à des_{HP-UiO-66-N 3} NP terminés en azido, avec cristallinité préservée et architecture mésoporeuse (Figure 4B-D), prêts pour l’encapsulation en Hb et la PEGylation SPAAC.
   ATTENTION : Collectez tous les liquides résiduels contenant du TMSN₃, y compris les mélanges avec d’autres réactifs (par exemple, tBuONO et THF), dans des conteneurs désignés du Groupe O conformément aux directives du ministère danois de l’Environnement. Étiquetez clairement tous les contenants pour indiquer la présence de TMSN₃ et de ses mélanges. La documentation pertinente pour l’élimination des déchets est fournie dans le Fichier Supplémentaire 1.

4. Chargement et quantification de Hb (durée prévue : 2 jours)

1. Transférer_{HP-UiO-66-N 3} NP (5 mg) dans un tube centrifugeuse de 2 mL, suivi d’une sonication de ~2 min dans 0,5 mL de tampon HEPES (20 mM, pH 7,4). Ajoutez 0,5 mL de tampon HEPES contenant du Hb (20 mg ^mL-1) et inversez doucement le tube plusieurs fois pour disperser complètement les NP.
2. Placez le tube sur un thermoshakeur et faites couver à température ambiante (22-25 °C) sous 1 000 tr/min en secouant pendant 2 heures.
3. Après l’incubation, centrifugez 13 500 g pendant 5 minutes à température ambiante pour pelleter les NP résultants Hb@HP-UiO-66-N₃ . Collectez soigneusement le surnageant pour quantifier la Hb non piégée. Si le précipité n’est pas complètement granulé, prolonger le temps de centrifugation si nécessaire.
4. Lavez doucement le pellet avec de l’eau ultrapure (1 mL) en pipettant de haut en bas pour enlever le Hb légèrement adsorbé, puis répétez le lavage deux fois. Collectez soigneusement le surnageant de chaque lavage pour quantifier l’Hb non piégé. Résuspendez la dernière granule dans de l’eau ultrapure de 0,5 mL pour caractérisation. Conservez les échantillons au réfrigérateur (4 °C) pour éviter l’oxydation.
5. Déterminer la présence de Hb non piégée dans les surnatants collectés à l’aide du test⁵¹ de sodium lauryl sulfate (SLS)-Hb. Pipeter 10 μL de chaque surnageant dans une microplaque à 96 puits et ajouter 100 μL de réactif SLS (0,6 mg ^mL-1 dans de l’eau ultrapure). Incubez 5 minutes à température ambiante dans le noir, puis l’absorption à 412 nm à l’aide d’un spectrophotomètre UV-vis.
6. Préparez une courbe standard en utilisant des solutions Hb stock (0-10 mg ^mL-1) dans un tampon HEPES pour convertir les valeurs d’absorbance en concentration.
7. Calculer l’efficacité d’encapsulation (EE) et le contenu de charge (LC) comme suit :
   EE ( %) = [(Hb initial - Hb surnageant)/Hb initial] × 100
   LC ( %) = [(Hb encapsulé)/(masse Hb + NP encapsulé)] × 100
8. Pour augmenter l’encapsulation de l’Hb, incubez 100 mg de NP avec 20 mL de solution de Hb (10 mg mL⁻¹). Pour évaluer la porosité après encapsulation, immergez les NP obtenus dans de l’éthanol pendant 24 heures, puis séchez toute la nuit dans un four sous vide à 140 °C, et enregistrez l’isotherme adsorption-désorption_N2 pour évaluer la porosité. La couleur rouge de la poudre indique une encapsulation réussie de Hb (Figure 5A), et une diminution marquée de l’absorption de N₂ confirme le remplissage réussi des mésopores avec Hb (Figure 5B).
9. Mesurez le potentiel ζ à l’aide d’un Zetasizer Nano ZS. La charge de surface diminue de ~+40 mV (HP-UiO-66-N₃ NPs) à ~+20 mV (Hb@HP-UiO-66-N₃ NP), ce qui correspond à l’adsorption Hb (Figure 5C).
10. Optionnel : acquérir la micrographie SEM (Figure 5D) et le diffractogramme PXRD (Figure 5E) afin d’assurer l’intégrité morphologique et la stabilité structurelle.
11. Enregistrer les spectres UV-vis (375-700 nm) pour évaluer la liaison réversible à l’oxygène des NP. Ajouter du dithionite de sodium et purger avec N₂ pendant 10 minutes pour libérer de l’oxygène, enregistrer le spectre, puis purger avec de l’air pendant 10 minutes pour permettre la reliaison, et enregistrer à nouveau le spectre (Figure 5F).
    REMARQUE : La présence de bandes caractéristiques de Soret et Q, de Hb oxygénée (~412 nm pour la bande Soret ; ~541 et ~577 nm pour les bandes Q) et désoxygénée (~430 nm pour la bande Soret ; ~557 nm pour la bande Q) après purge avec de l’air et N₂, respectivement, indique que la Hb reste fonctionnelle.
12. Attendez-vous à des NP uniformes rouges Hb@HP-UiO-66-N contenant un Hb fonctionnellement actif avec un comportement d’oxygénation réversible.

5. Fabrication des NP Hb@HP-UiO-66-PEG : PEGylation via SPAAC (durée prévue : 2 jours)

1. Préparez un tube centrifugeuse de 2 mL contenant des NP Hb@HP-UiO-66-N₃ (10 mg) dispersés dans 0,5 mL d’eau ultrapure. Ajoutez du DBCO-PEG (MW ~2 000, 20 mg dans 0,5 mL d’eau ultrapure) pour obtenir un ratio PEG / NP de 2:1 (p/w). Faites légèrement un vortex jusqu’à ce que ce soit complètement mélangé.
2. Incubez le mélange au thermoshakeur à température ambiante et à 1 000 tr/min pendant 1 heure, puis transférez au réfrigérateur (4 °C) pour une réaction nocturne (~16 h). Cette réaction de clic SPAAC sans catalyseur couple de manière covalente DBCO aux groupes azides, formant des liaisons triazoles stables.
3. Centrifugez à 12 000 x g pendant 5 minutes à température ambiante pour pelleter les NP PEGylés Hb@HP-UiO-66-PEG. Si le précipité n’est pas complètement granulé, prolonger le temps de centrifugation si nécessaire. Jetez le surnageant contenant le PET non réagi.
4. Lavez la pellete trois fois avec de l’eau ultrapure (2 mL chacune en pipettant vers le haut et vers le bas) dans des conditions de centrifugation identiques. Cela permet l’élimination des chaînes PEG libres et des petits sous-produits moléculaires.
5. Resuspendez les NP purifiés Hb@HP-UiO-66-PEG dans 2 mL d’eau ultrapure et conservez-les à 4 °C.
   Le colloïde apparaît homogène et légèrement opalescent, indiquant une bonne stabilité de dispersion.
6. Confirmer la PEGylation réussie par spectroscopie FTIR (Figure 6A) : disparition de la bande d’azide à 2122 ^cm-1 et émergence des signaux de méthylène (−CH₂−) et de liaisons éther (−O−) dérivés de PEG à 2883 et 1097 ^cm-1, respectivement.
7. Vérifier par ^{RMN de 1}h (Figure 6B) après digestion alcaline dans 2 M KOH/_{D 2}O ; Les échantillons PEGylés montrent un signal supplémentaire à δ = 3,53 ppm correspondant aux protons oxyéthylène du PEG.
8. Mesurez le diamètre hydrodynamique et l’indice de polydispersion (PDI) par DLS (Figure 6C).
   Une augmentation de ~115 nm (PDI ~0,1) à ~140 nm (PDI ~0,17) confirme un revêtement de surface avec une fine couche polymère.
9. Optionnel : mesurer le potentiel ζ de surface à l’aide d’un Zetasizer Nano ZS pour vérifier l’effet négligeable de la PEGylation de surface sur la charge de surface (Figure 6D). Un changement mineur après la PEGylation (de ~+20 mV à ~+17 mV) indique un impact minimal sur la charge de surface.
10. Observez la morphologie par TEM (Figure 6E). Le TEM révèle un rebord diffus de ~10-12 nm autour du bord de la particule, représentant la couronne PEG.
11. Effectuer un test de libération d’oxygène à l’aide d’une électrode d’oxygène (Figure 6F) pour montrer que la fonction Hb reste intacte après la PEGylation, similaire à la forme non PEGylée. Attendez-vous à des NP Hb@HP-UiO-66-PEG stables, dispersés brun-rougeâtre, présentant une forte stabilité colloïdale et une capacité de liaison à l’oxygène conservée, adaptés aux tests physiologiques à long terme.
12. Optionnel : effectuer des courbes de dissociation de l’oxygène (ODC) de Hb et Hb libres encapsulées dans des NP Hb@HP-UiO-66-PEG pour identifier la pression partielle d’oxygène à 50 % de saturation en oxygène (p50) et le coefficient de Hill (Hill-n) (Figure 7).

6. Évaluation de la stabilité des NP (durée prévue : 7 jours)

1. Distribuez les NP Hb@HP-UiO-66-PEG (~5 mg) dans sept tubes centrifugeuses de 2 mL. Ajoutez 2 mL de chaque milieu : eau ultrapure, sérum (0,9 % de NaCl), HEPES (20 mM), sérum de souris, plasma humain, glucose moyen d’Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco, et solution saline tamponnée phosphate (PBS). Assurez-vous que les capuchons des tubes de centrifugeuse sont bien fermés pour éviter l’évaporation du milieu pendant l’incubation. Le sérum de souris CD-1 et le plasma humain sont achetés auprès d’Innovative Research (Novi, MI, États-Unis).
2. Incubez les échantillons à 37 °C dans un thermoshaker à 1 000 tr/min pendant jusqu’à 7 jours.
3. Après 3 et 7 jours, collectez les particules par centrifugation (12 000 g, 10 min, température ambiante), lavez une fois avec de l’eau ultrapure, puis séchez pour la PXRD (Figure 8A). Si le précipité n’est pas complètement granulé, prolonger le temps de centrifugation si nécessaire.
4. À 0, 24, 72 et 168 h, retirez les aliquotes (~50 μL) et diluez-les 20 fois pour l’analyse DLS (taille et PDI) (Figure 8B).
5. Optionnel : préparer des échantillons de MEB après 48 heures dans PBS pour vérifier visuellement la morphologie (Figure 8C).
   REMARQUE : La dilution de la suspension des NPs (dans PBS) avec de l’eau ultrapure est essentielle pour l’analyse SEM car elle réduit les interférences de fond des composants tampons et facilite une imagerie claire des NP.
6. Comparer avec_{les NP} Hb@HP-UiO-66-N non PEGylées dans des conditions identiques ; la disparition rapide des réflexions cristallines caractéristiques et l’apparition de larges caractéristiques de diffusion amorphe indiquent une instabilité sans revêtement PEG.
   REMARQUE : Les échantillons PEGylés restent structurellement intacts après 7 jours dans tous les milieux, tandis que ceux non PEGylés se décomposent en moins de 24 heures dans PBS ou DMEM.

7. Caractérisation physicochimique (durée prévue : ~15 jours)

REMARQUE : Cette section décrit les méthodes analytiques nécessaires pour confirmer la morphologie, la composition, la porosité et l’intégrité des Hb des NP. Ces techniques de caractérisation valident collectivement la reproductibilité des processus de synthèse et de modification.

1. PXRD
   1. Séchez ~5 mg de chaque échantillon de NP dans un sèche-congélateur toute la nuit avant la mesure pour éliminer l’humidité adsorbée.
   2. Chargez l’échantillon sur un support plat en silicium zéro fond et aplatissez-le doucement à l’aide d’une lame en verre propre pour former une fine couche uniforme.
      REMARQUE : Évitez d’appuyer trop fort, car cela peut provoquer des effets d’orientation préférée.
   3. Enregistrer les motifs PXRD à l’aide d’un diffractomètre de laboratoire équipé de rayonnement Cu Kα (λ = 1,5418 Å). Réglez les paramètres de balayage à 2θ = 4-50°, la taille du pas = 0,02°, le dwell = 1 s par pas.
   4. Comparez les motifs obtenus avec la structure simulée d’UiO-66 générée à l’aide du logiciel Mercury basée sur les données cristallines^{précédemment rapportées 31}. La présence de pics abrupts à 7,3°, 8,4° et 25,7° indique une intégrité cristalline.
2. N₂ Adsorption-Desorption (Surface BET et Distribution de la taille des pores)
   1. Dégazer ~100 mg de chaque échantillon NP à 140 °C sous vide pendant 24 heures à l’aide d’un système Micromeritics Smart VacPrep avec purge ultra-haute pureté_{N 2}.
   2. Transférez immédiatement les échantillons dégazés vers le port d’analyse d’un analyseur de surface Micromeritics Tristar. Enregistrer_{N 2} isothermes à 77 K dans une plage de pression relative (P/P₀) de 0 à 1.
   3. Calculer les surfaces en utilisant la méthode BET en suivant le critère^{étendu de Rouquerol 52}. Calculez la distribution de la taille des pores via la théorie non locale de la fonction de la densité implémentée dans le logiciel Micromeritics.
   4. Générez les courbes d’adsorption/désorption et les graphiques de distribution de la taille des pores à l’aide d’Origin 2022. Importez les données d’adsorption/désorption dans le logiciel, avec une pression relative (P/P₀) sur l’axe X et le volume adsorbé de N₂ sur l’axe Y.
   5. Tracez les données de distribution de la taille des pores avec la largeur des pores comme axe X et le volume incrémental des pores comme axe Y. Présentez les résultats sous forme de graphiques « Ligne + Symbole ». Effectuez toutes les analyses en utilisant les paramètres logiciels par défaut.
3. Spectroscopie FTIR
   1. Broyez ~5 mg de chaque échantillon séché en une fine poudre à l’aide d’un mortier d’agate propre. Placez la poudre sur le cristal ATR d’un spectromètre Bruker^{ALPHA-P 53}.
   2. Collectez des spectres de 4 000 à 400 ^cm-1 avec une résolution de 2 ^cm-1 .
   3. Identifier les pics caractéristiques : L’apparition d’un étirement de N₃ à ~2122 ^cm-1 confirme la formation d’azides (Figure 4A). Après la PEGylation, observez les bandes −CH₂− et C-O-C respectivement à ~2883 ^cm-1 et ~1097 ^cm-1, ainsi que la disparition de l’étirement N₃ (Figure 6A). On peut s’attendre à la disparition de la bande azidée et à l’émergence de signaux de méthylène (−CH₂−) et d’os d’éther (−O−) dérivés de PEG confirmant l’achèvement de la réaction SPAAC.
   4. Tracez les courbes FTIR à l’aide d’Origin 2022. Importez les données brutes dans le logiciel avec les valeurs X (nombre d’onde) et Y (transmettance). Générez des graphiques au format « Ligne » en utilisant les paramètres par défaut du logiciel.
4. ¹H RMN
   1. Ajoutez ~10 mg de NP à 0,5 mL de 2 M KOH dans D_2Oplacés dans un flacon en verre, et chauffez à 80 °C pendant 1 à 2 heures pour digérer le cadre.
   2. Centrifugeuse (12 000 x g, 10 min, température ambiante) pour centrifuger les résidus non dissous. Transférez le surnageant dans un tube RMN de 5 mm.
   3. Enregistrez ¹spectre RMN sur un spectromètre Bruker Avance à 400 MHz.
   4. Attribuer les déplacements chimiques caractéristiques, y compris les protons aromatiques de BDC-NH₂ (δ = 6-8 ppm) et les signaux PEG (δ = ~3,53 ppm, Figure 6B), en utilisant le logiciel de MestReNova. Analysez les données RMN à l’aide du module de traitement RMN du logiciel avec ses paramètres par défaut.
5. SEM
   1. Déposer ~5 μL de suspension NP sur une plaquette de silicium ; Laissez sécher à l’air libre dans un meuble sans poussière. Si la charge a lieu, faites un sputter coat avec 5 nm d’or.
   2. Image sur un FEI Quanta 200 SEM à une tension d’accélération de 10-20 kV.
   3. Analysez les images à l’aide d’ImageJ. Importez les images TIFF originales avec les informations d’échelle intégrées dans le logiciel et ajustez la luminosité et le contraste uniquement pour la visualisation. N’appliquez aucun traitement supplémentaire qui pourrait affecter l’information dimensionnelle. Générez les barres d’échelle à l’aide de la fonction d’analyse du logiciel.
6. TEM
   1. Placez ~5 μL de dispersion NP sur une grille cu en lacey en carbone (maillage 300). Tapez l’excès avec du papier filtre et séchez dans les conditions ambiantes.
   2. Examinez sous un FEI Tecnai T20 G2 TEM à 200 kV.
   3. Analysez les images à l’aide d’ImageJ. Le traitement d’image suit les procédures décrites à la Section 7.5.3.
7. DLS et ζ-Potentiel
   1. Diluer les NP ~20 fois dans de l’eau ultrapure pour la taille et l’analyse PDI ; pour le ζ-potentiel, diluer dans un tampon HEPES (20 mM, pH 7,4).
   2. Mesurez avec un Zetasizer Nano ZS à 25 °C. Au moins trois échantillons indépendants (n = 3) sont préparés, et chaque échantillon est mesuré en triple lièbre.
   3. Tracez les données DLS et ζ-potentiel à l’aide d’Origin 2022. Présenter la distribution pondérée en intensité de la taille des particules sous forme de graphiques « Ligne + Symbole » et les résultats de potentiel ζ comme des graphes « colonne ». Rapportez les données en moyenne ± écart-type (n = 3). Effectuez toutes les analyses en utilisant les paramètres par défaut du logiciel.
8. Spectroscopie UV-vis pour la fonctionnalité Hb
   1. Dispersez 3 mg de Hb libre ou une quantité correspondante de NP (c’est-à-dire contenant une quantité équivalente de Hb encapsulé) dans 3 mL d’eau ultrapure. Transférez les suspensions sur une cuvette en quartz. Enregistrez les spectres UV-vis de 375 à 700 nm à l’aide d’un spectrophotomètre UV-2600 UV−vis.
   2. Ajoutez une pincée de dithionite de sodium à la solution de Hb ou à la suspension NP et purgez avec du_N2 pendant 10 minutes pour désoxygéner l’échantillon. Enregistrez le déplacement de la bande Soret de 412 à 430 nm et la fusion des bandes Q. Réoxygénez l’échantillon en faisant bouillonner à l’air pendant 10 minutes pour observer l’inversion (Figure 5F et Figure supplémentaire 1).
   3. Tracez les données à l’aide d’Origin 2022. Présentez les spectres sous forme de graphes « en ligne », avec une longueur d’onde sur l’axe X et une absorbance sur l’axe Y.
9. Quantification de l’oxygène libéré
   1. Dispersez 1 mg de Hb libre ou une quantité correspondante de Hb@HP-UiO-66-N₃ et Hb@HP-UiO-66-PEG NPs (contenant une quantité équivalente de Hb encapsulé) dans de 600 μL d’eau ultrapure. Transférez les suspensions dans des fioles en verre de 2 mL et scellez-les hermétiquement avec des bouchons en caoutchouc.
   2. Insérez soigneusement la sonde à aiguille de l’électrode d’oxygène à travers le bouchon en caoutchouc dans la suspension pour surveiller le niveau d’oxygène dissous à l’aide d’un_O2mètre de type aiguille.
   3. Ajoutez rapidement la solution de K₃[Fe(CN)₆] (10 % en poids dans 100 μL d’eau ultrapure) à la suspension à l’aide d’une aiguille de seringue et notez en continu le changement de niveau d’oxygène.
   4. Calculez l’oxygène libéré en soustrayant la valeur maximale observée après l’ajout de K₃[Fe(CN₎₆] de la valeur initiale avant son addition. Normalisez les valeurs obtenues à l’oxygène libéré par la même quantité de Hb libre (Figure 6F) en utilisant Origin 2022. Mesurez trois échantillons indépendants (n = 3) pour le Hb libre ou chaque NP.
      REMARQUE : Les NP Hb@HP-UiO-66-N₃ et Hb@HP-UiO-66-PEG présentent une libération d’oxygène comparable, chacune libérant ~60 % de l’oxygène libéré par le Hb libre.
10. Mesure des COD et calcul de p50 et Hill-n
    1. Préparez des NP libres de Hb bovin ou Hb@HP-UiO-66-PEG à une concentration finale de Hb de ~1 mg ^mL-1 dans 3 mL de tampon HEPES (20 mM HEPES, 0,9 % (p/v) NaCl, pH 7,4). Transférez l’échantillon dans une cuvette en quartz équipée d’une barre magnétique de brassage.
    2. Placez la cuvette dans un analyseur Hemox. Réglez la température de mesure à 37 °C et laissez le système s’équilibrer sous un brassage continu jusqu’à obtenir une base stable.
    3. Enregistrer les COG par désoxygénation progressive sur une plage de pression partielle de 1 à 148 mmHg. Utilisez le logiciel d’analyseur Hemox préinstallé pour mesurer les ODC et calculer p50 et Hill-n en utilisant les paramètres d’analyse par défaut. Mesurez trois échantillons indépendants (n = 3) pour chaque échantillon.
    4. Exportez les données traitées et tracez les ODC en utilisant Origin 2022 dans le format graphique « Ligne » par défaut.

8. Reproductibilité et analyse statistique

1. Effectuer toutes les procédures décrites dans ce protocole au moins trois fois indépendamment. Rapportez les résultats comme des résultats typiques observés à travers ces répétitions. Maintenir les paramètres expérimentaux clés, tels que les temps de réaction et les températures, dans une plage raisonnable afin d’assurer la reproductibilité et la fiabilité pour les autres utilisateurs.
2. Présenter la caractérisation structurelle (PXRD, adsorption-desorption N₂ , FTIR, ^{RMN 1}H, SEM, UV-vis) comme données représentatives pour une confirmation qualitative sans analyse statistique.
3. Rapporter les mesures quantitatives (DLS, ζ-potentiel, p50, Hill-n) en moyenne ± DE (n ≥ 3). Déterminer la signification statistique à l’aide du test t de Welch bilatéral non apparié ou de l’ANOVA unidirectionnelle, selon le cas. Indiquer les niveaux de signification comme ns (sans signification), * = p < 0,05, ** = p < 0,005, *** = p < 0,001, **** = p < 0,0001.

Résultats

La synthèse réussie_{des NP} HP-UiO-66-NH 2 a été vérifiée par PXRD (Figure 2A), qui a montré les pics de diffraction caractéristiques à 2θ = 7,3°, 8,4° et 25,7°, en bon accord avec la structure simulée d’UiO-66³⁶. Le léger élargissement du pic par rapport au motif simulé a été attribué aux dimensions nanométriques des particules et a confirmé la préservation de l’intégrité cristalline après la synthèse⁵⁴

Discussion

Ce protocole présente une voie robuste et reproductible pour synthétiser, fonctionner et caractériser les NP HP-UiO-66 conçus pour l’encapsulation en Hb et les applications de délivrance d’oxygène. En adoptant une approche d’ingénierie inside-out, ce travail établit un cadre généralisable pour la conception des NP MOF pour des applications biomédicales, y compris la délivrance de biomacromolécules et de médicaments. Bien que le concept de matériau sous-jacent et la performance fonctionne...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
acide 2-aminé 1,4-benzènecarboxylique   ;	Merck Life Science A/S (Sø ; borg, DK)	381071-25G
4-(2-hydroxyéthyl)piperazine-1-acide éthanosulfonique	Merck Life Science A/S (Sø ; borg, DK)	H3375-100G
Acétone (99 %)	VWR International (Sø ; borg, DK)	23J244030
Analyse sur les protéines à l’acide bicinchoninique   ;	Thermo Fisher Scientific (Roskilde, DK)	23235
Sang bovin & nbsp ;	SSI Diagnostica A/S (Hillerø ; d, DK)	77667
Tube centrifugeuse
Centrifugeuse   ;	Thermo Fisher Scientific Inc (Massachusetts, États-Unis)	75009903	Série Megafuge ST Plus & nbsp ;
Oxyde de deutérium	Merck Life Science A/S (Sø ; borg, DK)	151882
Dibenzocyclooctyne-polyéthylène glycol	BroadPharm	BP-23949
Acide dodécanoïque   ;	Merck Life Science A/S (Sø ; borg, DK)	L556-1KG
Dulbecco » s Aigle modifié » s moyen et moins ; Glycémie élevée   ;	Merck Life Science A/S (Sø ; borg, DK)	11965092
Éthanol (100 %)	VWR International (Sø ; borg, DK)	24L044013
Spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier   ;	Bruker (Billerica, États-Unis)
Analyseur d’hémox   ;	TSC Scientific Crp (PA, États-Unis)
Plasma cité humain	TebuBio	SER-PLP25
Acide chlorhydrique (37 %)	Merck Life Science A/S (Sø ; borg, DK)	320331-500ML
Logiciel ImageJ	Instituts nationaux de la santé (États-Unis)		Version 1.47t
Grille cu en lacy en carbone (maillage 300)	Agar Scientific Ltd., (Stansted Essex, Royaume-Uni)	AGS166-3H
Agitateur magnétique	IKA-Werke GmbH & Co. KG (,DE)	Identifiant. Non : 0010011496
Sofeware MestReNova	Mestrelab Research (Espagne)		Version 12
Analyseur de surface Micromeritics Tristar	Thermo Fisher Scientific Inc	ASAP 2020 Plus
Mini-centrifugeuse	Nordique d’Eppendorf (Hø ; rsholm, DK)	N° de catalogue & nbsp ; 5452000010
Sérum de souris	Recherche innovante (Novi, MI, États-Unis)	IGMSCD1SER10ML
Chaudière étouffée   ;	Nabertherm GmbH (Brême, DE)	Fournaise étouffée LE 6/11
N,N&prime ;-diméthylformamide (99,9 %)	VWR International (Sø ; borg, DK)	250131a008
Équipement Nanodrop 2000c   ;	Thermo Fisher
Résonance magnétique nucléaire   ;	Bruker (Billerica, États-Unis)
O2 compteur  ;	PreSens (Ratisbonne, Allemagne)
Logiciel Origin 2022	OriginLab Corporation (MA, États-Unis)		Version 2022  ;
Capteur d’oxygène	PreSens (Regensburg, DE)	Trace OXY-1 ST
Solution physiologique tamponnée au phosphate & nbsp ;	Merck Life Science A/S (Sø ; borg, DK)	P4417-50TAB
Lecteur de plaques	Tecan Group Ltd.  ; (Mä ; nnedorf, CH)
Hexacyanoferrate de potassium	Merck Life Science A/S (Sø ; borg, DK)	60299-100G
Hydroxyde de potassium	Merck Life Science A/S (Sø ; borg, DK)	221473-500G
Diffraction des rayons X en poudre & nbsp ;	Malvern Panalytical Ltd., (Malvern, Royaume-Uni)		Modèle : Malvern Panalytical Aeris Research 600W XRD pour les mesures de poudre (Publié en 2020)
Réservoir à pression à fond rond   ;	Merck Life Science A/S (Sø ; borg, DK)	SYNP170004-1EA
Microscopie électronique à balayage  ;	Compagnie FEI (Hillsboro, États-Unis)	Helios Nanolab 600 FEI à double faisceau
chlorure de sodium   ;	Merck Life Science A/S (Sø ; borg, DK)	71376
Dithionite sodique & nbsp ;	Merck Life Science A/S (Sø ; borg, DK)	71699-250G
Sodium dodecyl sulfate   ;	Merck Life Science A/S (Sø ; borg, DK)	L4509-100G
Synthware & commerce ; Réservoir de pression à fond rond	Merck Life Science A/S (Sø ; borg, DK)	SYNP170003
Tert-butyl nitrite   ;	Merck Life Science A/S (Sø ; borg, DK)	20370-100ml-F
Tétrahydrofurane (99,7 %)	VWR International (Sø ; borg, DK)	201022A004
Thermoshaker	Grant Instruments (Cambridge) Ltd (Royaume-Uni)	PHMT-PSC18 (01012015020119)
Microscopie électronique en transmission   ;	Compagnie FEI (Hillsboro, États-Unis)	FEI Tecnai T20
Azidée de triméthylsilyle   ;	Merck Life Science A/S (Sø ; borg, DK)	155071-10G
Système TSC HEMOX DAQ	TSC Scientific Crp (PA, États-Unis)		Logiciel d’analyseur Hemox & nbsp ;
Ultrosound sonicateur & nbsp ;	Branson Ultrasonics Corporation (Danbury, États-Unis)	SKU : 2410240003
Spectrophotomètre UV-Vis   ;	Shimadzu (Kyoto, JP)
Four sous vide  ;	Thermo Fisher Scientific Inc (Massachusetts, États-Unis)
Zetasizer Nano ZS	Malvern Panalytical Ltd., (Malvern, Royaume-Uni)	Numéro de série. MAL1188530
Chlorure de zirconium(IV)	Merck Life Science A/S (Sø ; borg, DK)	357405-100G