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Préparation de l’échantillon
Séparation des protéines à partir de la farine de pois chiches (FC)
Les pois chiches Kabuli (Cicer arietinum L.), récoltés durant la saison de croissance 2025 et provenant du sud-est de la Turquie, ont été traités à l’aide d’un système de mouture par calibrateur d’air basé sur l’impact, dans lequel les particules étaient soumises à des forces centrifuges et à des impacts répétés contre le disque de broyage et l’engrenage annulaire. Après une première étape de pré-fraisage, les granulaux grossiers étaient ensuite usinés pour produire du CF à l’aide d’un broyeur à air. Lors du fraisage par impact, un débit d’air de 40 à 45m 3/h, une vitesse de classification de 7 000 à 8 000 tr/min et un débit d’avance de 200 kg/h ont été appliqués, conformément aux conditions de fonctionnement précédemment rapportées et à un protocole d’optimisation interne, tel que décrit dans lalittérature 8.
Des fractions fines riches en protéines ont ensuite été obtenues à partir de la FC par classification de l’air à température ambiante, en utilisant le même système de classification d’air. La vitesse des roues du classificateur était réglée à 10 000 tr/min, tandis que la vitesse d’alimentation était maintenue à environ 200 kg/h et le débit d’air à 52 m³/h, comme décritprécédemment 8. Cette étape de séparation enrichissait sélectivement la fraction protéique en fonction des différences de taille, de densité et de propriétés aérodynamiques des particules.
Après classification de l’air, la poudre résultante présentait une fine distribution de la taille des particules (d(0,9) = 20-22 μm) ; par conséquent, aucune étape de tamisage n’a été appliquée pour éviter la perte de matériaux et les contraintes mécaniques inutiles. La fraction enrichie en protéines était directement emballée dans des sacs de polyéthylène de 25 kg lavés au gaz et stockée à 4 °C afin de minimiser l’absorption d’humidité et de préserver les propriétés fonctionnelles jusqu’à un traitement ultérieur.
Préparation par nanoémulsion
Le CPC a été utilisé comme seul agent émulsifiant pour préparer des NEs huile dans l’eau (O/W) visant une concentration protéique active de 3,0 % w/v dans la formulation finale. Cette concentration a été sélectionnée sur la base de dépistages préliminaires de 1,0 % en va-vers, 2,0 % en va-v, et 3,0 % en va-v, ce qui a indiqué que 3,0 % offrait la réduction la plus efficace de la taille des gouttelettes et la plus grande stabilité physique à court terme. Sur la base de la teneur en protéines mesurée de la poudre CPC (44,8 % en p/p), la concentration requise en poudre était calculée à 6,67 % en v/v. Le CPC a servi d’émulsifiant en phase aqueuse continue, tandis que l’huile de triglycérides à chaîne moyenne (MCT) était utilisée exclusivement en phase huileuse dispersée à une concentration fixe de 5,0 % v/v, correspondant à 5,0 mL d’huile par formulation de 100 mL. Aucun tensioactif de faible poids moléculaire n’a été utilisé dans aucune formulation9.
La dispersion aqueuse du CPC a été préparée en dissolvant la quantité calculée de poudre de CPC dans de l’eau ultrapure sous un brassage magnétique continu à 800 tr/min pendant 1 800 s afin d’assurer une hydratation complète et une dispersion homogène des protéines. L’hydratation complète a été confirmée par l’absence de particules ou de sédiments visibles.
La phase huileuse a ensuite été ajoutée lentement à la solution CPC hydratée sous un brassage continu, suivie d’une homogénéisation à haute cisaillement à 12 000 tr/min pendant 240 s, produisant une émulsion grossière (conventionnelle), visuellement identifiée par une apparence uniforme et opaque sans séparation visible de l’huile. Ces conditions ont été sélectionnées pour éviter l’agrégation des protéines tout en assurant une perturbation suffisante des gouttelettes.
Les NEs ont ensuite été obtenues par sonde de l’émulsion grossière à 30 % d’amplitude pendant 180 s, effectuée dans un bain d’eau glacée afin de maintenir la température de l’échantillon en dessous de 30 °C et d’éviter l’agrégation des protéines. La température était surveillée de façon intermittente pendant la sonication. Des expériences préliminaires d’optimisation (données non montrées) ont évalué des temps de sonication de 60 s, 120 s et 180 s, et 180 s a été sélectionnée comme condition optimale sur la base de la formation reproductible de NEs avec des diamètres de gouttelettes inférieurs à 200 nm et un faible PDI. Par conséquent, tous les NE rapportés dans cette étude ont été préparés en utilisant le temps de sonication optimisé de 180 s.
La formation réussie du NE était soutenue par l’apparition d’une dispersion stable, légèrement opalescente, sans séparation de phase après 1 800 s de position debout. Les échantillons présentant une crème visible ou une séparation de phase ont été exclus de l’analyse ultérieure. Tous les échantillons ont été équilibrés à température ambiante (25 ± 2 °C) avant la caractérisationphysicochimique 9.
ATTENTION : La manipulation des équipements à haute énergie (homogénéiseur et sonicateur) a été effectuée conformément aux procédures de sécurité institutionnelles en laboratoire. Une protection auditive et un écran anti-éclaboussures étaient utilisés lors de la sonication. Aucun acide ni base n’a été utilisé lors de la préparation de l’émulsion ; par conséquent, aucune neutralisation chimique ni élimination des déchets dangereux n’était nécessaire.
Caractérisation nutritionnelle et physicochimique de la farine de pois chiches (FC) et du concentré de protéines de pois chiches (CPC)
Analyse compositionnelle
La composition nutritionnelle des échantillons de FQ et CPC a été déterminée à l’aide des méthodes officielles d’analyse de l’Association of Official Analytical Chemists (AOAC). Les fibres brutes ont été analysées selon AOAC 991,43, la cendre totale selon AOAC 923,03, la graisse brute selon AOAC 920,39, et la protéine brute selon AOAC 984,13, en utilisant un facteur de conversion azote-protéine de N × 6,25. La teneur totale en glucides de tous les échantillons a été déterminée par différence en soustrayant la somme des pourcentages d’humidité, de protéines, de matières grasses et de cendres de 100 %3.
Analyse des couleurs
Les paramètres de couleur des échantillons étaient mesurés à l’aide d’un colorimètre de laboratoire fonctionnant en mode réflectance. Avant la mesure, l’instrument était standardisé en utilisant les étalonnages noir et blanc fournis par le fabricant. Pour garantir des mesures uniformes et reproductibles, 5,0 g de poudre d’échantillon ont été délicatement chargés dans une cuvette ronde en verre (64,0 mm de diamètre interne) afin de créer une surface lisse et homogène. Une épaisseur de couche suffisante (≥ 50,0 mm) a été appliquée pour minimiser l’influence des effets de substrat et de fond et rendre la poudre translucide effectivement opaque en conditions de réflectance. Toutes les mesures ont été effectuées en mode réflectance à température ambiante.
Les coordonnées de couleur étaient exprimées dans l’espace colorimétrique CIELAB, où L* représente la luminosité (0 = noir, 100 = blanc), a* représente l’axe rouge-vert, et b* représente l’axe jaune-bleu. Des paramètres de couleur supplémentaires, incluant la différence totale de couleur (ΔE*), la chrominance (C*), l’angle de teinte (H°) et l’indice de couleur (CI), ont été calculés selon les équations décrites dans11 (Équations 1–4) comme suit :
(Équ. 1)
(Équ. 2)
(Équation 3)
(Égalisation 4)
Analyse du pH
Le pH des échantillons de CF et CPC a été déterminé à l’aide d’un pH-mètre numérique équipé d’une électrode en verre en insérant l’électrode directement dans la dispersion de l’échantillon à 25,0 ± 2,0 °C. Avant la mesure, le pH-mètre était calibré à l’aide de solutions tampons standard (pH 4,0 et 7,0). Toutes les mesures ont été réalisées en triple exemplaire (n = 3) afin d’assurer la reproductibilité analytique.
Teneur en humidité
La teneur résiduelle en humidité des échantillons de CF et CPC a été déterminée à l’aide d’un analyseur d’humidité rapide fonctionnant dans des conditions de chauffage contrôlées. Toutes les mesures ont été effectuées en triple exemplaire (n = 3) afin d’assurer la reproductibilité analytique.
Caractérisation structurelle et fonctionnelle de la CPC
Analyse XRD
L’analyse XRD du CPC a été réalisée à l’aide d’un diffractomètre à rayons X de laboratoire équipé de rayonnement Cu-Kα (λ = 1,5406 Å). Des diffractogrammes ont été enregistrés sur une plage de 2θ de 10°-90° à une cadence de balayage de 2,5° min-1, fonctionnant à 40 mA et 45 kV, conformément à une procédure12 précédemment rapportée.
L’identification des pics, la soustraction du fond et l’ajustement des courbes ont été réalisées à l’aide d’un logiciel standard d’analyse XRD. Le degré de cristallinité a été calculé comme le rapport entre l’aire intégrée des réflexions cristallines et la surface totale sous le diffractogramme, selon la méthode décrite par13, comme montré dans l’équation (5) :
(Équ. 5)
La taille apparente du cristallite (D) a été estimée à partir des données XRD à l’aide de l’équation de Scherrer (Équ. 6), appliquée aux pics de diffraction les plus intenses :
(Équ. 6)
où D est la taille apparente du cristallite (nm), K est le facteur de forme (supposé être 0,9), λ est la longueur d’onde des rayons X, β est la largeur totale à la moitié du maximum (FWHM, en radians) du pic de diffraction sélectionné, et θ est l’angle de Bragg.
Analyse différentielle de calorimétrie à balayage (DSC)
L’analyse différentielle de calorimétrie à balayage (DSC) de la fibrose coquétique et de la CPC a été réalisée à l’aide d’un calorimètre différentiel à balayage en laboratoire. Environ 10,0 ± 0,1 mg d’échantillon ont été pesés et scellés avec précision dans un creuset en aluminium concave avec un couvercle percé, tandis qu’un creuset vide en aluminium a servi de référence. Les mesures ont été effectuées sous une atmosphère azotée (20 mL/min) afin de minimiser les effets oxydatifs. Les échantillons ont été chauffés de 0 °C à 400 °C à un taux de chauffage constant de 5 °C min-1 sous des conditions de balayage dynamique. Des calibrations de température et de sensibilité ont été effectuées avant l’analyse afin d’assurer la précision et la reproductibilité des mesures.
Les transitions thermiques étaient caractérisées en déterminant la température d’entrée (To), la température de pic (Tp), la température de fin (Te) et le changement d’enthalpie (ΔH) associé à chaque transition. De plus, la largeur de pic endothermique (EPW) et l’indice de hauteur de pic (PHI) étaient calculés selon les équations. (7) et (8), respectivement :
EPW = (Te−Tp) (Éq. 7)
PHI =ΔH/(Tp− To) (Équ. 8)
Capacité de mousse (FC) et stabilité (FS)
La capacité de mousse (FC) et la stabilité de la mousse (FS) d’une dispersion aqueuse CPC (3,0 g/L) ont été évaluées à pH 7,0, ajustées selon les besoins à l’aide d’acide chlorhydrique (HCl) à 0,1 N. Une aliquote de 30 mL de dispersion protéique a été transférée dans des tubes centrifugeuses en polypropylène de 50 mL et homogénéisée à l’aide d’un homogénéiseur à haute vitesse fonctionnant à 11 000 tr/min pendant 120 s pour générer de la mousse. La formation de mousse a été confirmée visuellement par l’augmentation rapide du volume d’échantillons et la formation d’une couche de mousse stable immédiatement après l’homogénéisation.
La FC était calculée comme le pourcentage d’augmentation du volume immédiatement après l’homogénéisation, tandis que la FS était déterminée sur la base du volume de mousse conservé après 600 s, 1 800 s, 3 600 s et 7 200 s. Toutes les mesures ont été effectuées en triple exemplaire (n = 3), et les valeurs de FC et FS ont été calculées selon les équations. (9) et équations (10), respectivement14 :
(Équ. 9)
(Équ. 10)
ATTENTION : L’acide chlorhydrique dilué a été manipulé en prenant des précautions de sécurité en laboratoire, notamment des gants et une protection oculaire. Les solutions de déchets ont été éliminées conformément aux directives institutionnelles de sécurité chimique.
Stabilité physicochimique des NEs basées sur la CPC et les CPC
Taille moyenne des particules et distribution des particules
La répartition de la taille des particules et le diamètre hydrodynamique moyen Z des échantillons ont été déterminés à l’aide de la diffusion dynamique de la lumière (DLS). Le diamètre hydrodynamique moyen en Z et l’indice de polydispersion (PDI) ont été enregistrés pour caractériser la taille moyenne des gouttelettes et l’uniformité de la distribution de taille,respectivement 15,16.
Avant la mesure, les échantillons étaient dilués avec de l’eau distillée à un ratio de 1:100 (v/v) afin de minimiser les effets de diffusion multiple et d’assurer des mesures fiables de la diffusion lumineuse. Les analyses ont été réalisées à une température contrôlée de 25 ± 2 °C. La PDI était utilisée comme indicateur de l’homogénéité de la taille des distributions de gouttelettes, avec des valeurs plus faibles correspondant à des distributions de taille plus étroites. Les mesures ont été effectuées le jour 0 (NEs fraîchement préparées) et après 7 jours de stockage afin d’évaluer la stabilité physique à court terme du systèmeNE 16. Les échantillons présentant un cremage, une sédimentation ou une séparation de phase visibles avant la mesure ont été exclus de l’analyse DLS.
ζ-potentiel des particules
Le potentiel de ζ des échantillons a été déterminé pour évaluer la charge nette de surface et la stabilité électrostatique des gouttelettes à l’aide de la diffusion électrophorétique de la lumière (ELS), selon les méthodologies précédemmentdécrites 15,16. Les mesures ont été effectuées à une température contrôlée de 25,0 ± 2 °C, et des échantillons non dilués ont été utilisés pour préserver l’environnement ionique d’origine des NE.
Les valeurs moyennes du potentiel ζ et les écarts-types correspondants ont été calculés pour chaque échantillon afin d’évaluer les interactions électrostatiques et la stabilité colloïdale des émulsions. Toutes les mesures ont été effectuées en utilisant de l’eau comme dispersant, conformément à un établi
Procédure opérationnelle standardinterne 15. Les échantillons montrant une séparation de phase visible ou un cremant avant l’analyse ont été exclus des mesures du potentiel de ζ.
Validation de la méthode et résultats attendus
La validation de la méthode a été réalisée en évaluant les paramètres physicochimiques clés, notamment le diamètre hydrodynamique moyen Z, le PDI, le potentiel ζ et la stabilité physique sous contrainte. L’exécution réussie du protocole a été soutenue par la formation reproductible de NE avec des gouttelettes inférieures à 200 nm et une PDI ≤0,30. Pour valider davantage la stabilité au-delà du simple stockage, un essai de résistance par centrifugation à 4 000 tr/min pendant 900 s a été réalisé. L’absence de séparation de phase visible ou de crematisation après centrifugation, associée à un potentiel de ζ et des profils de pH constants sur 7 jours de stockage, soutient collectivement la robuste capacité émulsifiante de la CPC et la reproductibilité du protocole proposé.
Analyse statistique
Les mesures compositionnelles et fonctionnelles ont été effectuées en triple exemplaire (n=3), tandis que les analyses structurelles (XRD et DSC) ont été réalisées sous forme de mesures uniques, des exécutions représentatives. Les résultats sont présentés sous forme de valeur moyenne ± écart-type (SD). Les évaluations statistiques ont été réalisées à l’aide d’une analyse unidirectionnelle de la variance (ANOVA) via le logiciel SPSS. Pour toutes les analyses, une valeur p de < 0,05 a été considérée comme indiquant une signification statistique. Dans les cas où des différences significatives ont été identifiées, le test post-hoc Honestly Significant Difference (HSD) de Tukey a été utilisé pour des comparaisons multiples. Les lettres de liaison statistique (par exemple, a, b, c) présentées dans les tableaux et les chiffres ont été dérivées des résultats du test HSD de Tukey ; Les moyens de partager la même lettre ne sont pas significativement différents au niveau de signification de 5 %.