Isolation efficace des cellules souches et adipocytes dérivés de l’adipeux à partir du tissu adipeux porcine

Résumé

Ici, nous présentons une méthode standard pour isoler efficacement les cellules souches et les adipocytes dérivés de l’adipos, caractérisée par une réduction de > 90 % du temps de traitement, une forte viabilité cellulaire et une large compatibilité.

Résumé

Les cellules souches dérivées de l’adip (ADSC) sont apparues comme des cellules semences idéales en médecine régénérative grâce à leur abondance de sources, leur récolte peu invasive, leur potentiel de différenciation multi-lignées et leurs propriétés immunomodulatrices. Leurs applications couvrent la réparation tissulaire, la modélisation des maladies et la thérapie cellulaire ; cependant, l’isolation efficace des ADSC à haute viabilité reste essentielle pour faire avancer la recherche et la traduction clinique. Les méthodes d’isolation conventionnelles, telles que la digestion enzymatique combinée à la dissociation mécanique par pipetage, sont limitées par des temps de traitement longs (1 à 3 heures), une faible viabilité cellulaire (souvent <70 %), et une variabilité importante d’un lot à l’autre, compromettant les expériences en aval.

Nous présentons ici le système SoniConvert (un système mécanique de séparation cellulaire basé sur les ondes), qui combine la digestion par ondes mécaniques et la digestion enzymatique pour relever ces défis. Le système intègre une unité de contrôle basée sur un microprocesseur qui régule la dissociation mécanique médiée par ondes via un retour numérique, ainsi qu’un réactif de détachement spécifique aux tissus, optimisé pour le tissu adipeux (incubation de 5 à 15 minutes). Cette approche permet une conversion rapide des tissus en suspension unicellulaire, avec une dissociation mécanique achevée en 3 à 9 secondes.

Le système offre trois avantages : (1) un traitement ultra-rapide, avec le processus d’isolement du noyau — de la digestion enzymatique à la séparation initiale des fractions cellulaires — réalisé en environ 30 minutes (réduction >90 % par rapport aux méthodes conventionnelles) ; (2) une forte préservation de la viabilité, avec une coloration au bleu de trypane confirmant une viabilité cellulaire de 80 à 95 %, dépassant les protocoles traditionnels ; et (3) une large compatibilité, car les suspensions unicellulaires résultantes répondent aux exigences de culture cellulaire primaire, cytométrie en flux, tests de cytotoxicité et construction d’organoïdes adipeux. En réduisant le temps de traitement, en améliorant l’intégrité cellulaire et en limitant la variabilité, ce système offre une plateforme pratique pour la recherche liée à l’adipus.

Introduction

Les cellules souches dérivées des adipeux (ADSC), un sous-ensemble critique de cellules souches mésenchymateuses (MSC) isolées dans le tissu adipeux, présentent un potentiel thérapeutique substantiel grâce à leur accessibilité, leur récolte peu invasive, leur robuste capacité proliférative, leur potentiel de différenciation multi-lignées et leurs puissantes propriétés paracrines et ^{immunomodulatrices} 1,2,3,4 . Ces qualités ont positionné les ADSC comme des candidats prometteurs pour la médecine régénérative, l’ingénierie tissulaire et l’immunothérapie. Cependant, l’utilité translationnelle des ADSC repose sur la capacité à isoler des populations fonctionnellement intactes et de haute pureté — un processus qui reste techniquement complexe. La biologie unique du tissu adipeux introduit deux principaux obstacles : (1) la forte teneur en lipides des adipocytes les rend sujettes à la rupture lors du traitement mécanique, libérant des lipides libres qui contaminent la fraction vasculaire stromale (SVF) et compromettent la viabilité cellulaire ainsi que le rendement ^5,6 ; et (2) la complexité structurelle du tissu, comprenant le fascia, les cellules endothéliales, les cellules immunitaires et les composants^{sanguins 7}, complique la séparation des cellules dérivées de l’adipe. Ces limitations soulignent l’urgence d’une méthode efficace, rapide et préservant la viabilité pour isoler les ADSC et adipocytes de haute qualité, qui sont tout aussi essentiels pour des applications ultérieures telles que la modélisation métabolique des maladies et les thérapies cellulaires.

Plusieurs méthodes établies sont actuellement disponibles pour isoler les cellules dérivées de l’adipose, notamment la digestion enzymatique, la culture d’explant et la séparation^{mécanique 8,9,10}. La digestion enzymatique, l’approche la plus largement adoptée, utilise la collagénase pour dégrader les composants de la matrice extracellulaire (ECM), libérant ainsi des cellules souches encapsulées. Cette méthode implique généralement la hachage des tissus, la digestion de la collagénase (37 °C, 1–2 h), l’isolement de la SVF par centrifugation et la purification en culture par adhérence. Bien qu’efficace pour la dégradation de la MEC, la digestion enzymatique présente des inconvénients notables : un temps de traitement prolongé (3 à 4 heures au total), une dépendance à de grands volumes d’échantillons, ainsi que des risques de cytotoxicité enzymatique ou de variabilité de lot à lot due aux collagénases d’origine animale — autant de facteurs qui entravent la traduction clinique. La culture explantée, qui exploite la migration des cellules souches à partir de fragments tissulaires, produit des cellules à viabilité préservée mais souffre d’un faible débit et d’un retard dans la récupération cellulaire (7 à 10 jours). La dissociation mécanique, qui repose sur une perturbation physique (par exemple, oscillation, cisaillement), réduit le temps de traitement mais compromet souvent l’intégrité cellulaire, entraînant une viabilité réduite et des populations impures. Collectivement, ces méthodes ne parviennent pas à concilier efficacité, pureté et viabilité — des critères essentiels pour l’isolation cellulaire de qualité clinique. Ainsi, nous proposons une méthode novatrice pour isoler les cellules dérivées de l’adipos (adipocytes et ADSC) qui combine la digestion enzymatique avec la dissociation mécanique médiée par^{ondes 11}. Cette approche réalise deux avancées clés : (1) efficacité temporelle : en combinant des cocktails enzymatiques pré-optimisés, sans produits animaux, avec des ondes mécaniques basse fréquence, le temps total de traitement est réduit de 3–4 h à ~30 min (Figure 1) ; (2) Préservation de la viabilité : une dispersion mécanique douce minimise la rupture des adipocytes et la libération de lipides. Il est important de noter que la période de 30 minutes fait référence au flux de travail d’isolation du cœur (digestion, dissociation mécanique, filtration et centrifugation initiale) pour obtenir des fractions brutes d’adipocytes et de SVF ; les étapes optionnelles de purification en aval, telles que la lyse des globules rouges (RBC), nécessitent un temps de manipulation supplémentaire.

Notre méthode optimisée d’isolation des cellules adiposes démontre un potentiel significatif d’application dans de nombreux domaines de recherche et cliniques. En recherche fondamentale, les cellules à haute viabilité obtenues présentent des performances exceptionnelles dans les études de différenciation adipogénique et ostéogénique, fournissant une source cellulaire fiable pour des applications d’ingénierie tissulaire. En médecine translationnelle, des études cliniques ont démontré le potentiel thérapeutique des ADSC dans le traitement de pathologies telles que l’arthrose¹², les maladies cardiovasculaires¹³, la sclérose^{en plaques 14} et la maladie inflammatoire de l’intestin (MII)/maladie de^{Crohn 15}. Les ADSC rapidement isolés constituent des blocs de construction idéaux pour construire des organoïdes de tissu adipeux et mettre en œuvre des applications de thérapie cellulaire, faisant progresser de manière significative la recherche en dépistage médicamenteux et en modélisation des maladies. De plus, les suspensions monocellulaires de haute qualité conviennent au séquençage de l’ARN unicellulaire. En conclusion, cette approche intégrée établit une plateforme technologique solide pour le tissu adipeux, soutenant à la fois la recherche fondamentale et la traduction clinique en médecine régénérative.

Protocole

Toutes les recherches animales ont été menées conformément au Règlement pour l’administration des affaires relatives aux animaux expérimentaux (Ministère de la Science et de la Technologie, Chine, révisé en mars 2017), et approuvées par le Comité d’éthique et de bien-être animal de l’Université agricole du Sichuan (Numéro d’autorisation : 20230089). Ce protocole nécessite l’utilisation du système SoniConvert, un dispositif commercialement disponible pour la dissociation tissulaire assistée par ondes mécaniques (ci-après appelé système de dissociation mécanique). Le protocole est optimisé pour le tissu adipeux porcin, et sa dépendance à cet équipement spécialisé constitue une limitation majeure.

1. Collecte et préparation du tissu adipeux

1. Désinfection préopératoire et épilation
   1. Euthanasiez le porc par overdose intraveineuse de pentobarbital sodique (100 mg/kg de poids corporel). Confirmez le décès avant la collecte des tissus.
   2. Appliquer une gaze stérile imbibée d’iodophore à 2 % pour la désinfection en spirale du dos porcin, en s’étendant de 15 cm à partir de la ligne médiane. Laissez sécher pendant 30 secondes.
   3. Utilisez un rasoir stérile pour raser les poils d’une zone de 16 cm × 8 cm. Assurez-vous que tous les poils de la zone opératoire sont retirés.
   4. Essuie l’arrière deux fois avec de l’éthanol à 75 % en utilisant une gaze stérile.
2. Collecte de tissu adipeux
   1. Réalisez une incision transversale de 20 cm le long de la ligne médiane dorsale avec un scalpel stérile.
   2. Soulevez le bord de l’incision avec une pince stérile. Disséquez le long du plan naturel entre le tissu adipeux et le derme pour obtenir une couche supérieure complète de tissu adipeux sous-cutané dorsal (ULB) d’environ 2 à 3 mm d’épaisseur.
   3. Rincez l’ULB une fois dans une solution stérile bien froide et placez-la dans une cuve de culture stérile (Figure 2).

Figure 2 : Collecte d’ULB de porc pour l’isolement cellulaire. (A) Illustration de la structure du tissu adipeux du dos du porc ; (B) Site de coupe du Bama minipig ; (C) Présentation du tissu adipeux dorsal, le sous-cutané du dos du porc comprend deux couches, la couche supérieure (ULB) et la couche interne (ILB) ; (D) Recueilli l’ULB. Abréviation : ULB = couche supérieure du dos ; ILB = couche interne du dos. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Point de pause : Le tissu adipeux collecté peut être conservé dans une solution sérile stérile glacée ou en solution de D-Hanks à 4 °C pendant une courte période avant une nouvelle dissection.
REMARQUE : L’objectif est de collecter l’ULB. Évitez d’inclure la couche inférieure de tissu adipeux sous-cutané dorsal (ILB) lors de la dissection.

3. Dissection et nettoyage du tissu adipeux
   1. Ajoutez 10 mL de tampon D-Hanks bien froid pour chaque 1,8 g de mouchoir dans la plaque et assurez-vous que le tissu est complètement immergé.
   2. Identifiez et excissez tous les vaisseaux sanguins visibles du tissu à l’aide de ciseaux chirurgicaux stériles. Retirez tout tissu conjonctif et composants fibrotiques. Jetez les matériaux excisés dans des récipients désignés comme biohazard.
      REMARQUE : Faites preuve d’une extrême prudence lorsque vous manipulez des instruments tranchants ; Coupez toujours le corps et jetez immédiatement les lames et ciseaux usagés dans des contenants tranchants après utilisation.
   3. Rincez les tissus à l’intérieur du tampon D-Hanks pour éliminer le sang résiduel et les débris.
      REMARQUE : Pour les échantillons présentant un excès d’hématome, remplacez le tampon 1 à 3 fois selon les besoins pour obtenir une clarté visuelle. Maintenez toutes les étapes de dissection sur la glace pour préserver la viabilité des tissus.
4. Dissociation mécanique du tissu adipeux
   1. Transférez 1,8 g des fragments de tissu rincés dans un tube stérile de microcentrifuge de 1,5 mL. Ajoutez 800 μL de tampon de dissociation tissulaire de type A (tampon A) au tube.
   2. À l’aide de ciseaux ophtalmiques stériles, réduisez les tissus du tube en petits morceaux d’environ 1 à 2 mm³ .
      REMARQUE : Si une fuite lipidique significative est observée pendant ou après le hayage, lavez à nouveau le tissu avec 1 mL de solution prérefroidie de D-Hanks avant de procéder à une digestion enzymatique pour éliminer les lipides des adipocytes cassés. Cette étape préserve l’intégrité des adipocytes pour l’analyse en aval.

2. Isolement cellulaire et homogénéisation

1. Traitement enzymatique
   1. Ajoutez 200 μL de l’agent de dissociation tissulaire de type A (solution de type A) dans un nouveau tube microcentrifuge. Faites doucement tourner et secouer le tube à la main 3 fois pour mélanger le contenu et vous assurer que les fragments adipos sont complètement immergés dans la solution de dissociation.
   2. Vérifiez que le bouchon du tube est bien fermé. Placez le tube dans un bain métallique à 37 °C et faites couver pendant 5 à 10 minutes.
      REMARQUE : Surveillez la solution jusqu’à ce qu’elle devienne trouble et que les fragments de tissu semblent partiellement digérés. La solution de type A contient de la collagénase et une protéase neutre. Portez des gants en nitrile, une blouse de laboratoire et des lunettes de sécurité lors de la manipulation. Évitez le contact cutané ; Si une exposition survient, rincez immédiatement avec beaucoup d’eau pendant 15 minutes. Le tampon A ne sera pas supprimé après l’ajout de la solution de type A.
2. Dissociation mécanique assistée par ultrasons
   1. Transférez les fragments de tissu adipeux partiellement digérés avec le tampon environnant du tube de microcentrifuge dans un tube stérile de microcentrifuge de 1,5 mL destiné au système de dissociation mécanique.
   2. Exécutez le programme prédéfini pour le tissu adipeux dans le système de dissociation mécanique afin d’effectuer une dissociation mécanique à l’aide d’une onde sinusoïdale de 200 Hz.

3. Filtration pour obtenir une suspension à cellule unique

1. Filtration et centrifugation
   1. Collectez la suspension cellulaire et faites-la passer à travers une passoire cellulaire de 200 μm dans un nouveau tube centrifuge de 50 mL pour éliminer les gros débris et les amas de tissus non digérés.
   2. Ajoutez 5 mL de solution D-Hanks prérefroidie (4 °C) au passoire. Rincez la passoire avec la solution D-Hanks deux fois pour maximiser le rendement cellulaire.
   3. Centrifugez la suspension à cellules filtrées à 500 × g pendant 5 minutes à 4 °C.
      Point de pause : Après centrifugation, la suspension de la cellule peut être traitée immédiatement ou conservée sur glace pendant un court moment avant la séparation des couches.
   4. Collecte des adipocytes : Pour collecter les adipocytes, aspirez et éliminez la couche lipidique surnageante à l’aide d’une pipette pasteur stérile, laissant 1 mL de tampon pour protéger la couche d’adipocytes. Collecter la deuxième couche pour l’analyse aval des adipocytes. Évitez de déranger les troisième et quatrième niveaux.
   5. Collecte de SVF (fraction vasculaire stromal) : Après retrait des couches supérieures, resuspendez doucement la granule inférieure contenant la fraction vasculaire stromale (SVF) dans 1 mL de D-Hanks/PBS. Resuspendez doucement la granule cellulaire dans 1 mL de D-Hanks/PBS pour atteindre une concentration cellulaire de 2 à 5 × 10⁶ cellules/mL.
      REMARQUE : Idéalement, quatre couches peuvent être observées après centrifugation : la couche lipidique au sommet ; la seconde couche contenant des adipocytes ; la troisième est la couche tampon hydrophile ; et la couche inférieure est la SVF, qui contient des cellules souches (Figure 1).
2. Lyse des globules rouges
   1. REMARQUE : Si la granule cellulaire présente une couleur rouge significative, indiquant une contamination aux globules rouges, effectuez une lyse des globules rouges.
      Resuspendez la pellete cellulaire dans 1 à 3 mL de tampon de lyse de globules rouges (RBC) à l’aide d’une pipette P1000 à pointes larges. Incubez sur glace pendant 15 minutes avec un mélange occasionnel.
   2. Prérefroidissez toutes les solutions et les rotors de centrifugeuse à 4 °C pour minimiser l’activité métabolique lors du traitement.
   3. Centrifugez à 500 × g pendant 10 minutes à 4 °C. Aspirez complètement le surnageant.
   4. Lavez à nouveau les cellules en resuspendant le pellet dans 5 mL de solution de D-Hanks prérefroidie et centrifugez à 500 × g pendant 5 minutes à 4 °C. Jetez le surnageant.
3. Remise en suspension finale
   1. Resuspendez la pelote finale dans D-Hanks/PBS pour des applications en aval.

4. Applications en aval et analyse

1. Évaluation de la viabilité des cellules SVF et du rendement cellulaire
   1. Préparez la suspension à cellules SVF obtenue dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL. Gardez la suspension sur la glace jusqu’à utilisation.
   2. Mélangez 10 μL de suspension à cellules SVF avec 10 μL de solution de bleu de Trypan à 0,4 % dans un tube stérile de microcentrifuge de 0,5 mL. Pipeter doucement 3 fois pour assurer un mélange uniforme.
      REMARQUE : La concentration finale de bleu de Trypan dans le mélange est de 0,2 %. Évitez d’introduire des bulles d’air lors du mélange, car elles pourraient interférer avec le comptage automatisé des cellules.
      Transférez 10 μL du mélange de cellules colorées sur une lame de comptage appropriée pour le compteur automatisé de cellules. Assurez-vous que l’échantillon remplit complètement la chambre sans débordement.
   3. Insérez la lame de comptage dans le compteur de cellules. Sélectionnez le type de test Trypan Blue et ajustez la plage de concentration cellulaire si nécessaire.
   4. Appuyez sur le bouton Comptage pour lancer le comptage automatisé des cellules. L’instrument capturera des images de la chambre de comptage et distinguera automatiquement les cellules vivantes des cellules mortes.
   5. Enregistrez le pourcentage de viabilité des cellules et comptez le nombre total de cellules viables affichées sur l’écran de l’instrument. Effectuez trois mesures indépendantes pour chaque échantillon et calculez la viabilité moyenne ainsi que le rendement cellulaire par gramme de tissu adipeux.
      REMARQUE : Nettoyez la culasse de comptage et le port de chargement des instruments avec de l’éthanol à 70 % après chaque utilisation afin d’éviter la contamination croisée entre échantillons.
2. Observation de la morphologie des adipocytes
   1. Colorez les adipocytes isolés avec 5 μg/mL de Hoechst pour les noyaux et 1 μM de BODIPY pour les lipides dans D-Hanks/PBS pendant 15 minutes à 37 °C.
      Point de pause : Après la coloration, les échantillons doivent être rapidement imagés ; si nécessaire, ils peuvent être protégés de la lumière à 4 °C pendant un court moment avant la microscopie.
   2. Utilisez un système de verre à couvercle adapté aux adipocytes pour la préparation des lames afin d’éviter la compression des cellules.
   3. Observez les noyaux (colorés à Hoechst) et les gouttelettes lipidiques (colorés à la BODIPY) au microscope à fluorescence.
      REMARQUE : En raison de leur grande taille (20–300 μm) et de leur forte teneur en lipides, les adipocytes sont fragiles, ont tendance à flotter et à s’empiler en plusieurs couches, rendant les méthodes de montage conventionnelles inadaptées à une observation microscopique claire (Figure 3A). Pour y remédier, un système de montage maison adapté aux adipocytes utilisant des lames et des couvertures standard a été développé (Figure 3B).
3. Purification des composants vasculaires stromales et observation morphologique des ADSC
   1. Semez la SVF fraîchement isolée dans un flasque de culture cellulaire T25 contenant 5 mL de DMEM, complété avec 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine. Incubez à 37 °C avec 5 % de CO₂.
   2. Après 48 heures, lavez doucement la fiole deux fois avec du PBS préchauffé pour éliminer les cellules non adhérentes. Ajoutez un substrat de culture frais et continuez l’incubation.
   3. Remplacez le substrat de culture tous les 2 à 3 jours. Surveillez la morphologie et la confluence cellulaires au microscope inversé.
   4. Lorsque les cellules atteignent une confluence de 80 à 90 % (généralement après 7 à 10 jours), on les détache en utilisant une trypsine-EDTA à 0,25 % pendant 3 à 5 minutes à 37 °C. Neutraliser avec un milieu de culture et recueillir la suspension cellulaire.
   5. Effectuer une coloration par Trypan Blue pour détecter la viabilité de la cellule avant la détection et le tri FACS.
   6. Observez la morphologie des ADSC purifiés et cultivés au microscope optique.
   7. Filtrez la suspension de cellules collectées à travers un tamis de cellules de 70 μm pour éliminer les granulats restants. Resuspendez les cellules dans le PBS contenant 2 % de FBS pour l’analyse FACS.
   8. Colorez les cellules avec des anticorps conjugués au fluorochrome contre CD73, CD90, CD11b et CD45 pendant 30 minutes à 4 °C dans l’obscurité.
   9. Lavez les cellules deux fois avec un tampon de coloration et resuspendez-les dans du PBS contenant 2 % de FBS.
   10. Effectuer une analyse cytométrique en débit à l’aide d’une buse de 70 μm à 20 psi et un débit inférieur à 3,0.
   11. Excluez les débris cellulaires en faisant des filtres sur la population principale à l’aide de paramètres de zone de diffusion avant (FSC-A) et de zone de dispersion latérale (SSC-A).
   12. Supprimez les doublets par la grille FSC-A versus FSC-H et sélectionnez la population viable de singlets pour une analyse en aval.
   13. Analysez les cellules à la porte en fonction de l’expression des marqueurs de surface. Utilisez CD73 et CD90 comme marqueurs positifs et CD11b et CD45 comme marqueurs négatifs pour vérifier le phénotype ADSC.
   14. Observez la morphologie des ADSC enrichis et cultivés sous un microscope optique. Sa morphologie caractéristique en forme de fuseau, semblable à un fibroblaste, indique un enrichissement ADSC réussi.
4. Différenciation adipogénique ADSC
   1. Semez la troisième génération d’ADSC à une densité de 1 × 10⁴ cellules/^{cm 2}. Lorsque la confluence cellulaire atteint environ 90 %, initie l’induction adipogénique.
   2. Préparez le milieu d’induction adipogénique en utilisant le milieu d’Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco à haute glycémie, contenant 10 % de sérum bovin fœtal (FBS), 0,5 mM de 3-isobutyl-1-méthylxanthine (IBMX), 1 μM de dexaméthasone, 10 μg/mL d’insuline et 1 μM de rosiglitazone.
   3. Après 3 jours d’induction, remplacez le substrat par un médium d’entretien et changez la solution tous les 2 jours.
   4. Après 14 jours d’induction, colorez les cellules avec de l’huile rouge O et observez les gouttelettes lipidiques au microscope inversé.
5. Différenciation ostéogénique ADSC
   1. Lorsque la confluence cellulaire atteint 80–90 %, commence l’induction ostéogénique. Formulez le milieu d’induction ostéogénique avec du DMEM à haute glycémie contenant 10 % de FBS, 10 mM de β-glycérophosphate, 50 μg/mL d’acide ascorbique, 10 μM de calcitriol et 1 μM de dexaméthasone.
   2. Changez le milieu tous les 2 à 3 jours et poursuivez le processus d’induction pendant environ 14 jours.
   3. Colorez les cellules avec 2 % d’alizarine rouge S (pH 5,2) et observez-les au microscope inversé.
6. Construction et identification organoïdaux
   1. Préparez une suspension monocellulaire d’ADSC dans un milieu de culture complet et ajustez la concentration cellulaire à 2 × 10⁴ cellules/20 μL.
   2. Inversez le couvercle d’une boîte de culture de 100 mm et versez des gouttes de 20 μL de la suspension cellulaire sur la surface interne du couvercle.
   3. Ajoutez du PBS stérile au fond du plat pour maintenir l’humidité, couvrez soigneusement le couvercle et incubez les gouttes suspendues dans des conditions de culture standard.
   4. Observez les gouttes quotidiennement et laissez les cellules s’agréger et former des sphéroïdes pendant 6 jours.
   5. Recueillez les sphéroïdes délicatement à l’aide d’une pipette et transférez-les dans du Matrigel prérefroidi sur glace.
   6. Incorporez les sphéroïdes dans Matrigel et placez le mélange dans des plaques de culture avant de l’incuber dans des conditions de culture standard.
   7. Remplacer régulièrement le milieu et surveiller la croissance organoïde jusqu’aux jours 18 à 28, lorsque les structures deviennent compactes et matures.
   8. Fixez les organoïdes avec 4 % de paraformodéhyde, perméabilisez-les avec 0,1 % de Triton X-100, et bloquez la liaison non spécifique avec 5 % de BSA.
   9. Incubez les échantillons avec des anticorps primaires contre CD73, CD90, CD11b et CD45, puis incubez-les avec les anticorps secondaires fluorescents correspondants.
   10. Colorez les organoïdes avec Hoechst et BODIPY pour visualiser respectivement les noyaux et les gouttelettes lipidiques, et observez les échantillons colorés au microscope à fluorescence.
       REMARQUE : Effectuer le tri cellulaire et toutes les manipulations impliquant des cultures ouvertes, y compris l’ensemencement, l’alimentation et la préparation de la coloration, dans des conditions strictement aseptiques dans un cabinet de biosécurité.

Résultats

Figure 1 : Illustration schématique du processus d’isolement cellulaire dérivé de l’adipeux. Le diagramme illustre la méthode traditionnelle et la méthode actuelle comme des flux de travail illustratifs. Trois étapes principales sont impliquées dans l’isolement des cellules dérivées de l’adip : la première es...

Discussion

La présente étude présente une approche intégrée novatrice pour isoler les cellules dérivées de l’adipeux (principalement les adipocytes et les ADSC) qui répond aux limites critiques des méthodes conventionnelles. En combinant un relâchement enzymatique spécifique aux tissus avec une dissociation mécanique par ondes mécaniques de précision, ce système atteint une isolation cellulaire rapide (temps total de traitement ~30 min), une grande viabilité (80–95 %) et reproductible.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Kit de dissociation tissulaire de type A	Docsense	TM001	Contient un agent de dissociation tissulaire de type A (solution de type A) et un tampon de dissociation tissulaire de type A (tampon A).
Kit de médium de différenciation adipogénique	OriCell	GUXMD-90031	Utilisé pour la différenciation adipogénique, incluant le milieu d’Eagle modifié de Dulbecco (non modifié) et le milieu d’entretien à haute glycémie
Alizarin Red S	OriCell	A5533ALIR-10001	Coloration par minéralisation pour la différenciation ostéogénique (pH 5,2)
Acide ascorbique	Sigma-Aldrich	A4544	Acide L-ascorbique, culture cellulaire testée, pour induction ostéogénique
Bama minipigs	Chengdu Dossy Animaux Expérimentaux Co., Ltd		Des animaux mâles d’un an, de qualité SPF, maintenus selon des procédures standardisées de vaccination, de vermifugation et de nettoyage.https ://www.cd-dossy.cn/animalpl_detail/12606067609851863 04.html
Compteur automatisé de cellules Bio-Rad TC20	Laboratoires Bio-Rad	1450011	Compteur automatique de cellules pour l’évaluation de la viabilité et du rendement
BODIPY	Thermo Fisher Scientific	D3922	Coloration lipidique neutre
BSA (5 %)	Sigma-Aldrich	A9418	Albumine sérique bovine, poudre lyophilisée, pour le blocage
Calcitriol	Sigma-Aldrich	C9756	1&alpha,25-Dihydroxyvitamine D3, pour l’induction ostéogénique
Tamis à cellules (70 & mu ; m)	Corning	352350	Falcon 70 & mu ; Filtre à cellules m, stérile, pour la préparation d’échantillons FACS
Filtre cellulaire (200 & mu ; m)	pluriSelect	43-50200-03	pluriStais, maillage PET, peut accueillir des tubes de 50 mL, stériles & nbsp ;
tube centrifugeuse (50 mL)	Corning	352098	Falcon 50 mL tube conique à haute clarté, stérile, polypropylène
Diapositive de comptage (pour Bio-Rad TC20)	Laboratoires Bio-Rad	1450011	Culasse de comptage à double chambre pour compteur de cellules automatisé TC20 & nbsp ;
Plat de culture (100 mm)	Corning	430167	Plaque en polystyrène stérile, pour la formation d’organoïdes en goutte suspendue
Dexaméthasone	Sigma-Aldrich	D4902	&ge ; 98 %, pour l’induction adipogénique et ostéogénique
Solution saline équilibrée D-Hanks ou PBS	Gibco	10010015	Pré-refroidi à 4 °C ; C, pH 7,4.
DMEM	Gibco	11965084	Celle-ci est utilisée pour la culture fraîchement isolée de SVF
DNase I	Beyotime	D7073	Optionnel, recommandé si des agglutinements sont observés.
Éthanol	Sigma-Aldrich	459836	75 % pour la désinfection des surfaces.
Sérum fœtal bovin (FBS)	Gibco	A4736201	Système Tet approuvé, origine américaine, stérile & nbsp ;
Cytomètre en flux	BD Biosciences	BD FACSCanto II	3 lasers (405 nm, 488 nm, 633 nm), 8 canaux de fluorescence, pour l’analyse des marqueurs de surface (CD73, CD90, CD11b, CD45), atteint 70 exigence de buse à 20 psi
Microscope à fluorescence	Olympe		Modèle inversé ou vertical capable de filtres FITC et DAPI.
Anticorps secondaires fluorescents	Thermo Fisher Scientific	A-11001 (anti-souris), A-11008 (anti-lapin)	Alexa Fluor conjugué, pour l’immunofluorescence
Anticorps conjugués au fluorochrome (CD73, CD90, CD11b, CD45)	BD Biosciences	561254 (CD73), 561970 (CD90), 557321 (CD11b), 555485 (CD45)	Pour l’analyse cytométrique en flux du phénotype ADSC
Hoechst	Thermo Fisher Scientific	H3570	Coloration nucléaire pour l’évaluation des cellules vivantes/mortes.
IBMX	Sigma-Aldrich	I5879	&ge ; 99 % (HPLC), pour un milieu d’induction adipogénique
Solution saline stérile glacée	Baxter	2F7124	Injection de chlorure de sodium à 0,9 %, USP, pour rincer les tissus
Insuline	Sigma-Aldrich	I9278	Recombinant, exprimé dans la levure, pour l’induction adipogénique
Iodophore	Sigma-Aldrich	25104	Solution désinfectante à 2 %.
Matrigel	Corning	354230	Facteur de croissance réduit, sans phénol rouge, pour l’implantation de sphéroïdes   ;
Bain métallique	Servicebio	SMB-H	Utilisé pour l’incubation à 37 °C.
Oil Red O	OriCell	OILR-10001	Coloration lipidique pour la différenciation des adipocytes
Microscope optique	Olympe		Microscope de champ clair standard avec 10x et n-trait ; 40x objectifs.
Kit de médium de différenciation ostéogénique	OriCell	GUXMD-90021	Utilisé pour la différenciation ostéogénique, notamment le médium d’Eagle modifié (non modifié) de Dulbecco à haute glycémie, ainsi que le médium d’entretien
Pipette P1000 avec embouts à large calibre	Beckman Coulter	B01113	Embouts à large calibre Biomek P1000 Span-8, stériles
Paraformoldéhyde (4 %)	Thermo Fisher Scientific	J61899	Solution aqueuse, pour fixer les organoïdes   ;
Pasteur pipette	Corning	7095S-5C	Stérile, jetable.
Pénicilline-Streptomycine	Gibco	15070063	10 000 U/mL de pénicilline, 10 000 et mu ; g/mL streptomycine, stérile   ;
Pentobarbital sodium	Hikma Pharmaceuticals USA Inc.	24201-010-20	Injectable, pour l’euthanasie (100 mg/kg de poids corporel, intraveineux). ANDA 203619 & nbsp ;
Anticorps primaires (CD73, CD90, CD11b, CD45)	BD Biosciences	561254 (CD73), 561970 (CD90), 557321 (CD11b), 555485 (CD45)	Pour l’immunocoloration organoïde
Tampon de lyse des globules rouges (RBC)	Solarbio	R1010	Si nécessaire pour les applications en aval.
Centrifugeuse réfrigérée	Eppendorf	5702R	Utilisé pour les étapes de centrifugation à 4 °C.
Rosiglitazone	Cayman Chemical	71740	&ge ; 98 %, PPAR & gamma ; Agoniste pour l’induction adipogénique
Conteneur à objets tranchants	Becton Dickinson	305270	Contenant résistant aux perforations pour lames et ciseaux d’occasion
Système de préparation à la suspension à cellule simple SoniConvert	Docsense	SC-L1W	Utilisé pour la dissociation mécanique des tissus.
Tampon de coloration (tampon de coloration par cytométrie en écoulement)	eBioscience (Thermo Fisher Scientific)	00-4222-57	200 mL, prêts à l’emploi, contiennent FBS et 0,09 % d’azide de sodium comme conservateur, pour la dilution des anticorps et des cellules, la coloration de surface et les étapes de lavage en cytométrie en flux   ;
Tube Eppendorf stérile de 1,5 mL	Eppendorf	30121.517	Tube de microcentrifuge Safe-Lock, stérile, pour le hachage des tissus
Plat de culture stérile	Corning	430167	Plat de culture stérile de 100 mm x 20 mm, pour la collecte de tissus
Pinces stériles	Sklar	96-1719	Pinces stériles pour le pouce, dentelées, pour la manipulation des tissus & nbsp ;
Gaze stérile	Corporations Dukal	7060033	Compresses en gaze stériles, pour désinfection et essuyage
Ciseaux ophtalmiques stériles	Sklar	10023-580	Ciseaux à ressort de style Vannas, pour hacher le tissu en 1-2 mm & sup3 ; Pièces
Rasoir stérile	3M	9681	Rasoir de préparation chirurgicale, pour l’épilation de la zone opératoire
Scalpel stérile	Integra Miltex	4-415	Scalpel jetable stérile, pour réaliser des incisions
Ciseaux chirurgicaux stériles	Sklar	10022-580	Ciseaux à iris stériles Merit, pour disséquer les vaisseaux sanguins et le tissu conjonctif   ;
Flacon de culture cellulaire T25	Corning	430639	Fiole de culture cellulaire Falcon T25, capuchon ventilé, stérile
Triton X-100 (0,1 %)	Sigma-Aldrich	T8787	Qualité de laboratoire, pour la perméabilisation   ;
Bleu de Trypan	Gibco, Thermo Fisher Scientific	15250061	Solution à 0,4 % pour le comptage de la viabilité cellulaire.
Trypsine-EDTA (0,25 %)	Gibco	25200056	0,25 % de trypsine, 1 mM d’EDTA, pour détacher les ADSC
&bêta ;-Glycérophosphate	Sigma-Aldrich	G9422	Sel disodique pentahydraté, pour l’induction ostéogénique