Nous présentons ici un protocole pour évaluer l’activité synergique de la fosfomycine en combinaison avec la ceftriaxone, le meropenème et la gentamicine contre les isolats d’Escherichia coli résistants aux carbapénèmes en utilisant la méthode de dilution de l’agar. Une synergie a été observée avec le métropène et la gentamicine, mais pas avec la ceftriaxone.
Article de revue
Protocole pour l’analyse à damier par dilution d’agar des combinaisons d’antibiotiques à base de fosfomycine contre Escherichia coli résistante aux carbapénens
S’ouvre dans un nouvel onglet
Dans cet article
Résumé
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Résumé
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
En raison des options de traitement limitées pour les Enterobactérales résistants aux carbapénèmes, les schémas de thérapie combinée prennent une importance croissante. Cette étude visait à étudier les taux de résistance à la fosfomycine et à évaluer les interactions synergiques in vitro de la fosfomycine en combinaison avec le méropène, la gentamicine et la ceftriaxone contre des isolats d’Escherichia coli résistants aux carbapénems. Soixante souches d’E. coli résistantes aux carbapénèmes isolées à partir de divers échantillons cliniques (urine, sang, aspiration, plaie, liquide cérébro-rachidien, aspiration endotrachéale) obtenus auprès de patients en service clinique et en soins intensifs des hôpitaux de la faculté médicale de l’Université Dicle ont été incluses dans l’étude. L’identification des espèces a été réalisée à l’aide d’un système automatisé d’identification microbienne. Des tests de susceptibilité aux antibiotiques et la confirmation de la résistance aux carbapénèmes ont été réalisés par diffusion discale avec l’ertapénem, l’imipénem et le méropémène. La résistance à la fosfomycine et les interactions entre antibiotiques ont été évaluées par dilution d’agar. De plus, des combinaisons d’antibiotiques ont été évaluées sur des gradients de concentration doubles en série à l’aide du protocole basé sur la dilution d’agar, et des indices fractionnaires de concentration inhibiteurs (IC) ont été calculés pour déterminer la synergie, l’indifférence ou l’antagonisme. Les taux de résistance étaient de 76,6 % pour la fosfomycine, 61,6 % pour le meropenème, 85,0 % pour la gentamicine et 98,3 % pour la ceftriaxone. Des interactions synergiques ont été observées dans 35 % des isolats pour la combinaison fosfomycine–meropenème, 33,4 % pour la combinaison fosfomycine–gentamicine, et 1,7 % pour la combinaison fosfomycine–ceftriaxone. L’antagonisme n’a été détecté que dans un seul isolat de la combinaison fosfomycine-méropémène. Des combinaisons de fosfomycine avec du métropène et de gentamicine ont montré une activité synergique in vitro contre E. coli résistante aux carbapénèmes. D’autres études in vitro sont nécessaires pour confirmer ces résultats.
Introduction
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
La famille des Enterobacterales comprend un groupe très diversifié de bacilles à gram négatif, dont beaucoup ont une importance cliniquesignificative 1. Parmi eux, Escherichia coli est l’espèce la plus fréquemment isolée dans les laboratoires de microbiologie clinique et est largement associée à des infections touchant presque tous les systèmes d’organes, y compris les infections urinaires, les infections des plaies, la pneumonie chez les patients immunodéprimés, la gastro-entérite et la méningite néonatale. C’est aussi une cause majeure de septicémie à Gram négatif et de choc septique médié par les endotoxines. Au-delà de la médecine humaine, E. coli est également un agent pathogène vétérinaire important, provoquant des infections respiratoires et systémiques chez diverses espèces animales, y compris les équidés, élargissant ainsi la perspective de l’étendue de l’hôte de la pathogenèse d’E. coli chez les hôtes humains et animaux2,3,4.
Les Enterobacterales productrices de bêta-lactamase à spectre étendu (ESBL), en particulier E. coli et Klebsiella pneumoniae, ont été associées à une mortalité accrue, à une hospitalisation prolongée et à des coûts de soins de santé plus élevés. L’utilisation généralisée des antibiotiques est un facteur majeur de la résistance multimédicamenteuse (MDR) chezces organismes 1. Les mécanismes de résistance incluent la production de carbapénènase, les ESBL, les enzymes modificatrices des aminochlorosides (AME), les mutations conférant une résistance aux quinolones, ainsi que les altérations des systèmes de porines et d’efflux. Chez E. coli et Klebsiella pneumoniae, la résistance est principalement médiée par des plasmides, facilitant le transfert horizontal des gènes. De tels traits de résistance sont également de plus en plus rapportés chez E. coli d’origine animale, y compris les isolats de bovins, soutenant le concept One Health et indiquant un risque potentiel de transmissionzoonotique 2,3.
Les carbapénèmes sont considérés comme des agents de dernière ligne pour les infections graves multirésistantes. Cependant, les Enterobacterales résistants aux carbapénèmes (CRE) sont devenus une préoccupation majeure pour la santémondiale 4. Cette résistance est principalement médiée par des carbapénèmes, y compris des métallo-bêta-lactamases de classe B, contribuant à desphénotypes 5 très résistants aux médicaments et à Pan.
Les souches MDR d’E. coli limitent considérablement les options thérapeutiques et compliquent la gestion de l’infection. Cela souligne la nécessité de stratégies de traitement alternatives telles que les thérapies combinées pour améliorer les résultats cliniques. De plus, ces souches résistantes sont de plus en plus rapportées non seulement dans des contextes cliniques, mais aussi dans des sources alimentaires telles que les produits laitiers. Cela élargit le contexte épidémiologique de la dissemination de la résistance aux antimicrobiens et soutient la thérapie combinée comme stratégie potentielle pour atténuer sa propagation et son impact clinique 6,7. Les aminochlorosides, la tigécycline et les polymyxines sont des agents thérapeutiques couramment utilisés dans les infectionsMDR 8. La fosfomycine a également démontré une activité contre l’E. coli productrice d’ESBL, en particulier dans les infectionsurinaires 9.
La fosfomycine, découverte pour la première fois en 1969, inhibe la synthèse précoce de la paroi cellulaire bactérienne et est réapparue comme un agent prometteur dans la thérapiecombinée 10. Des effets synergiques entre la fosfomycine et les aminoglycosides ou β-lactames ont été rapportés chez les organismesMDR 11,12. De plus, la fosfomycine a été évaluée dans de larges cohortes cliniques, démontrant son efficacité dans les infections sévères lorsqu’elle est utilisée seule ou dans des schémascombinés 13. Cependant, la plupart des études antérieures incluent des populations bactériennes hétérogènes, et les données portant spécifiquement sur E. coli résistantes aux carbapénèmes restent limitées.
Les méthodes standard de test de susceptibilité aux antimicrobiens incluent la dilution de l’agar, la dilution du bouillon et la diffusion du disque. Les tests combinés basés sur la dilution de l’agar permettent une évaluation quantitative des interactions antimicrobiennes en déterminant les MIC et en calculant les FICI. Des méthodes alternatives telles que la mise en échec du temps et la diffusion par gradient fournissent des données d’interaction dynamiques ou simplifiées, mais peuvent différer par la reproductibilité et lastandardisation 13,14. Ce protocole est le plus adapté à l’évaluation contrôlée in vitro de combinaisons d’antibiotiques définies. Cependant, elle ne reflète pas pleinement les conditions pharmacocinétiques invivo 15. Parmi celles-ci, la dilution de l’agar est considérée comme une méthode de référence pour la détermination de la CIM ; cependant, son utilisation pour évaluer l’activité combinée de la fosfomycine contre E. coli résistante aux carbapénèmes reste limitée.
Cette étude propose une évaluation systématique des combinaisons à base de fosfomycine comparées à des isolats d’E. coli résistants aux carbapénèmes cliniquement confirmés. Une approche standardisée de damier par dilution de l’agar a été utilisée, générant des données comparatives directes d’interaction sous des conditions contrôlées in vitro.
Par conséquent, la présente étude teste l’hypothèse selon laquelle la fosfomycine, en combinaison avec le méropène, la gentamicine ou la ceftriaxone, présente une activité synergique in vitro contre les isolats d’E. coli CRE.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Revue et perspective
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
L’approbation de cette étude a été obtenue par le Comité d’éthique de la recherche clinique non interventionnelle de la Faculté de médecine de l’Université Dicle (Décision n° 100, Date : 01.01.2021).
Le protocole ci-dessous décrit une méthode standardisée de damier de dilution de l’agar pour évaluer la synergie de combinaison de fosfomycine avec les isolats d’E. coli résistants aux carbapénems.
Collection d’isolats
Entre le 15.02.2021 et le 15.12.2021, un total de 60 souches d’E. coli résistantes aux carbapénèmes isolées à partir de divers échantillons cliniques (urine, sang, aspiration, plaie, liquide céphalorachidien et aspiration endotrachéale) ont été incluses auprès des patients hospitalisés des hôpitaux de la faculté de médecine de l’Université Dicle. L’identification a été réalisée à l’aide d’un système de spectrométrie de masse MALDI-TOF. Lorsque plusieurs isolats ont été récupérés sur le même patient, seul le premier isolat a été inclus. Les échantillons provenant de cliniques ambulatoires et de patients hospitalisés moins de 48 heures ont été exclus. Tous les isolats d’E. coli résistants aux carbapénèmes qui répondaient aux critères d’inclusion prédéfinis durant la période d’étude ont été inclus consécutivement ; par conséquent, la taille de l’échantillon a été déterminée par le nombre total d’isolats éligibles disponibles, et aucun calcul a priori de la taille de l’échantillon n’a été effectué. Les souches ATCC 13846 et ATCC 25922 d’E. coli étaient utilisées comme souches de contrôle qualité. Les souches de contrôle qualité ont été testées en parallèle avec des isolats cliniques sous des conditions de dilution d’agar identiques. Toutes les descentes ont été évaluées par deux observateurs indépendants. Les résultats des souches de contrôle qualité ont montré des schémas d’inhibition de croissance attendus dans toutes les expériences, et aucun résultat hors plage ou invalide n’a été observé.
Toutes les procédures impliquant des isolats cliniques ont été réalisées dans des conditions de niveau de biosécurité 2 (BSL-2). Un équipement de protection individuelle approprié (blouse de laboratoire, gants et protection oculaire) était utilisé, et toutes les manipulations étaient effectuées dans un cabinet de sécurité biologique certifié.
Identification des espèces et tests de susceptibilité aux antimicrobiens
Les tests de résistance aux carbapénens et de susceptibilité aux antimicrobiens ont été réalisés à l’aide d’un système automatisé d’identification microbienne et de tests de susceptibilité. La résistance aux carbapénèmes détectée par le système a été confirmée par des tests de diffusion sur disque avec des disques d’ertapénem, d’imipénem et de méropémène. Les diamètres des zones ont été interprétés selon les points de ruptureEUCAST 16,17 (Tableau 1). Tous les isolats ont été conservés dans un bouillon de soja tryptique contenant 20 % de glycérol et stockés à −20 °C.
Tableau 1 : Points de rupture du diamètre de zone pour les carbapénèmes déterminés pour E. coli par test de diffusion disque (DDT). Critères d’interprétation de diffusion de disque utilisés pour les tests de susceptibilité aux carbapénèmes. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Des flacons de culture sanguine adaptés aux échantillons pédiatriques et aérobies ont été incubés dans un système automatisé de culture sanguine. Les bouteilles positives ont été sous-cultivées sur de l’agar EMB, du lagar au sang de mouton à 5 % et de l’agar Sabouraud au dextrose.
Les échantillons d’urine et d’aspirate endotrachéale ont été cultivés par des méthodes quantitatives, tandis que d’autres échantillons ont été traités par des méthodes semi-quantitatives. Des échantillons d’aspirate endotrachéale ont été évalués par coloration de Gram, et seuls les échantillons avec un score de Bartlett > 0 et un score de Murray > 3 ont été considérés comme significatifs et comprenaient18.
Pour les échantillons de plaie, une évaluation par coloration de Gram a été réalisée selon le système de notation Q ; des échantillons avec un score Q supérieur à 0 ont été inclus19.
Les isolats bactériens ont été identifiés par spectrométrie de masse assistée par laser assistée par matrice/temps d’ionisation en vol. Un score de ≥2,0 a été considéré comme fiable pour l’identification au niveau du genre et de l’espèce, tandis que des scores entre 1,7 et 2,0 indiquaient une identification fiable au niveau du genre20,21. Seuls les isolats avec des scores de ≥2,0 étaient inclus.
Détermination de la susceptibilité à la fosfomycine par la méthode de dilution de l’agar
Selon le Comité européen pour les tests de susceptibilité aux antimicrobiens (EUCAST), la méthode de dilution de l’agar est recommandée pour déterminer la susceptibilité à la fosfomycine chez les membres de la familledes Enterobacterales 16.
Préparation de la fosfomycine et d’autres solutions antibiotiques agissant
Pour la méthode de dilution de l’agar, on utilisait de la poudre d’hydrate de sel disodique de fosfomycine, et de l’eau distillée stérile pour créer la dilution. Huit dilutions différentes étaient prévues pour chaque antibiotique, allant de 4 fois en dessous à 3 fois au-dessus de la valeur limite de CMI déterminée par EUCAST.
Une solution de fosfomycine (contenant 2560 μg/mL de fosfomycine) a été préparée en dissolvant 51,2 mg de fosfomycine stérile disodique, calculée à l’aide de la formule volume/poids/puissance (Volume (mL) = Poids (mg) × Puissance (μg/mg)/ Concentration (μg/mL)) et pesée en conditions stériles, dans 20 mL d’eau distillée stérile. La concentration finale était prévue à 256 μg/mL, résultant d’une dilution de 10 fois la solution standard lors de l’ajout de MHA.
En conséquence, des plages de dilution ont été déterminées pour la fosfomycine (2-256 μg/mL), le meropenème et la gentamicine (0,125–16 μg/mL), ainsi que la ceftriaxone (0,0625–8 μg/mL).
Les dilutions étaient préparées par des dilutions en série doubles dans des tubes coniques stériles contenant 10 mL d’eau distillée stérile. Un total de 7 dilutions en série doubles ont été effectuées dans les tubes jusqu’à atteindre une concentration de 2 μg/mL. Les 10 mL restants dans le dernier tube ont été jetés. Cela a donné huit concentrations différentes d’antibiotiques : 256, 128, 64, 32, 16, 8, 4 et 2 μg/mL.
La même méthode utilisée pour la fosfomycine a été utilisée pour les autres antibiotiques afin de préparer la solution initiale d’origine. 1,6 mg d’antibiotique en poudre a été pesé pour la ceftriaxone et 3,2 mg pour le métropène et la gentamicine à l’aide d’une balance de précision. Sept dilutions ont été réalisées pour chaque antibiotique. Ainsi, huit concentrations différentes de dilutions antibiotiques ont été obtenues pour le métropène, la gentamicine et la ceftriaxone (Figure 1).
Figure 1 : Étapes de préparation des solutions de dilution de fosfomycine. Étapes de dilution en série utilisées pour obtenir les concentrations de travail. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.
Préparation du milieu agar
L’agar Mueller-Hinton ajusté par cations (CAMHA) a été préparé en suivant les instructions du fabricant. Il a été stérilisé à 121 °C et 1 atm pendant 15 à 20 minutes à l’aide d’un autoclave, puis conservé à 45–55 °C dans un bain-marie.
Tous les matériaux biologiques ont été stérilisés par autoclavage à 121 °C pendant 15 à 20 minutes avant leur élimination. Les déchets contenant des antibiotiques ont été éliminés conformément aux protocoles institutionnels de biosécurité et de gestion des déchets chimiques.
Étape critique : Maintenir la température de l’agar entre 45 et 55 °C avant l’ajout d’un antibiotique. Une chaleur excessive peut réduire l’activité de la fosfomycine et affecter les résultats de la CMI.
Ajout du G6P au support
Pour déterminer la susceptibilité à la fosfomycine, EUCAST recommande d’ajouter 25 μg/mL de glucose-6-phosphate (G6P) à l’agar et au milieudu bouillon 5. Pour chaque litre d’agar, 25 mg de G6P étaient dissous dans 20 mL de MHA, filtrés pour stériliser, puis mélangés dans le lot principal d’agar.
Préparation des plaques de dilution d’agar
Pour déterminer les valeurs de CMI en monothérapie pour la fosfomycine, le meropenème, la gentamicine et la ceftriaxone, une plaque de Petri a été utilisée par dilution (par exemple, 8 dilutions pour la fosfomycine, allant de 2 à 256 μg/mL). Les concentrations d’antibiotiques ont été notées sur les plaques.
Pour l’étude combinée, les concentrations de fosfomycine et de l’autre antibiotique étudié ont été notées sur les plaques (par exemple, fosfomycine 256 μg/mL et meropenème 32 μg/mL). Ainsi, 64 plaques ont été préparées pour chaque combinaison, et la concentration de fosfomycine et de l’autre antibiotique utilisé a été notée sur les plaques. Un total de 32 plaques de meropenème-gentamicinetri ont été préparées pour la monothérapie et 192 pour la combinaison. Un dessin standard contenant 56 petits carrés de 1 cm a été réalisé sur une surface en marbre. Toutes les plaques ont été inoculées directement sur ce dessin. Ainsi, la lecture et l’inoculation ont été standardisées (Figure 2 et Figure 3).
Figure 2 : Diagramme standard créé à des fins d’inoculation et de lecture. Schéma standardisé utilisé pour l’inoculation et l’évaluation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.
Figure 3 : Méthode d’évaluation des plaques de dilution d’agar. Évaluation de la croissance bactérienne pour la détermination de la CMI. F = fosfomycine ; M = meropenème. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.
Deux millilitres de solution antibiotique ont été mélangés à 18 mL de CAMHA en fusion pour obtenir la concentration finale de travail. Ce milieu, préparé selon l’insert du fabricant, était refroidi à 45−55 °C dans un bain chaud. Une partie (2 mL) du mélange antibiotique a été utilisée, et 9 parties (18 mL) de MHA ont été mélangées dans les boîtes de Petri (l’antibiotique a été dilué à 1/10). Le volume final de la plaque d’agar a été standardisé à environ 20 mL par plaque (18 mL d’agar + 2 mL de solution antibiotique), et les concentrations finales d’antibiotiques ont été calculées après dilution. Ainsi, les concentrations d’antibiotiques ont été obtenues dans les plaques de dilution de l’agar (2–256 μg/mL pour la fosfomycine, 0,0625–8 μg/mL pour la ceftriaxone, et 0,125–16 μg/mL pour le métropène et la gentamicine). Des plaques préparées à partir du milieu sans solution antibiotique ont été utilisées comme contrôles de croissance (Figure 4). Les mélanges composés de substrat et de solution antibiotique ont été laissés solidifier à température ambiante.
Figure 4 : Milieu témoin sans solution antibiotique. Un milieu sans antibiotiques est utilisé pour confirmer la viabilité bactérienne. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.
Étape critique : Une profondeur d’agar inégale ou un mélange insuffisant des antibiotiques peut conduire à une interprétation inexacte de la CIM et à de fausses interactions possibles.
Préparation et inoculation des isolats
Les souches pures précédemment stockées ont été placées sur de l’agar sanguin de mouton à 5 % à température ambiante et incubées à 37 °C pendant 16 à 24 heures. Des colonies issues de cultures fraîches étaient en suspension dans une solution saline stérile, et une turbidité McFarland de 0,5 a été obtenue à l’aide d’un lecteur optique.
La méthode de dilution de l’agar nécessitait un inoculum bactérien d’environ 10,4 UFC par tache. Une valeur de McFarland de 0,5 contient environ 108 UFC/mL de bactéries. Une densité bactérienne de10,7 UFC/mL a été obtenue en diluant la solution à 1:10 avec du sérum stérile.
2 μL de chaque suspension bactérienne étaient prélevés du tube à l’aide d’une pipette automatique. Ce volume correspond à environ 2 × 104 UFC par tache. L’inoculation a été réalisée sur des zones ciblées de la surface de l’agar, en commençant par la plaque contenant la plus faible concentration de fosfomycine et en progressant vers la plus élevée.
Ainsi, l’inoculation a été définie comme une UFC par tache, chaque point d’inoculation contenant environ 10UCC 4 . L’inoculation de chaque suspension bactérienne a été réalisée en moins de 15 minutes.
Avant d’inoculer les plaques contenant la fosfomycine, une plaque de contrôle de la croissance a été inoculée pour vérifier la contamination possible. L’inoculation a été laissée sécher à température ambiante. L’incubation a été réalisée à 35–37 °C pendant 16–24 heures dans des conditions aérobies, et la turbidité a été mesurée à l’aide d’un densitomètre calibré.
Une densité excessive d’inoculations peut entraîner une croissance traînée et une difficulté dans la détermination des points de départ. Réajustez la turbidité à 0,5 McFarland et répétez l’inoculation si une croissance confluente survient.
Essais combinés
Les antibiotiques en poudre meropenème, fosfomycine, gentamicine, ceftriaxone et glucose-6-phosphate ont été utilisés.
Les quantités d’antibiotiques ont été calculées à l’aide de la formule volume/poids/puissance. Après préparation des solutions d’origine, les solutions antibiotiques ont été préparées à des concentrations de trois dilutions doubles au-dessus et quatre dilutions doubles en dessous de la plage de CMI sensible. Les plages de dilution ont été calculées comme 2 à 256 μg/mL pour la fosfomycine, 0,0625 à 8 μg/mL pour la ceftriaxone, et 0,125 à 16 μg/mL pour la gentamicine et le meropenème (Tableau 2, Tableau 3 et Tableau 4).
Tableau 2 : Préparation des solutions antibiotiques pour la combinaison Fosfomycine-Gentamicine. Étapes de préparation et concentrations utilisées pour le stock et les solutions de travail. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau 3 : Préparation des solutions antibiotiques pour la combinaison fosfomycine-mériopenème. Étapes de préparation et concentrations utilisées pour le stock et les solutions de travail. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau 4 : Préparation des solutions antibiotiques pour la combinaison fosfomycine-céftriaxone. Étapes de préparation et concentrations utilisées pour le stock et les solutions de travail. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Dans cette étude, des solutions distinctes de stock de fosfomycine ont été préparées pour la monothérapie et des expériences combinées afin de compenser les différences des facteurs de dilution finaux lors des tests à base d’agar. Une solution standard standard était utilisée pour les expériences en monothérapie, tandis qu’une solution standard ajustée à plus haute concentration était utilisée pour les expériences combinées afin de compenser la dilution supplémentaire lors de la prémixation d’antibiotiques.
Des solutions d’extraction étaient préparées comme première étape pour la dilution en série. Pour la fosfomycine, 256 mg de poudre étaient pesés avec précision à l’aide d’une balance analytique dans des conditions stériles et dissous dans 50 mL d’eau distillée stérile avec un mélange continu (agitateur magnétique) jusqu’à une dissolution complète, aboutissant à une concentration finale de 5120 μg/mL de fosfomycine disodique. Des solutions stock séparées de gentamicine, meropenem et ceftriaxone ont été préparées.
Pour les dilutions en série double, sept tubes coniques stériles contenant 25 mL d’eau distillée stérile ont été préparés. À partir de la solution standard, 25 mL ont été transférés dans le premier tube à l’aide d’une pipette réglable, suivis d’un transfert séquentiel dans les tubes suivants pour obtenir des dilutions en série doubles. Chaque tube a été mélangé soigneusement avec un mélangeur vortex pendant 5 à 10 secondes après chaque étape de transfert. Du tube final, 25 mL étaient éliminés pour maintenir des volumes égaux. De cette manière, une série de dilution a été obtenue, donnant une concentration minimale de 40 μg/mL, et un total de huit concentrations différentes de fosfomycine ont été préparées.
La même procédure a été appliquée pour la gentamicine, le meropenème et le ceftriaxone. Cependant, en raison des différences dans les plages de concentration ciblées, 16 mg de gentamicine et de meropenème (pour une plage de 0,125–16 μg/mL) et 8 mg de ceftriaxone (pour une plage de 0,0625–8 μg/mL) ont été pesés et dissous séparément dans de l’eau distillée stérile de 50 mL sous conditions aseptiques à température ambiante. Des dilutions en série doubles ont été réalisées comme décrit ci-dessus. Les concentrations finales les plus basses étaient de 2,5 μg/mL pour la gentamicine et le meropenème, et 1,25 μg/mL pour la ceftriaxone. Pour chaque antibiotique, huit tubes contenant 25 mL de concentrations différentes ont été préparés. Comme la fosfomycine a été testée en combinaison avec trois antibiotiques, un total de 24 tubes de dilution à la fosfomycine (8 × 3) ont été préparés.
Pour la préparation de l’agar, 18 mL d’agar Mueller–Hinton complétés en glucose-6-phosphate (25 μg/mL) ont été pré-refroidis à 45–50 °C et distribués dans des boîtes de Petri stériles. Par la suite, 1 mL de solution de fosfomycine et 1 mL de la seconde solution antibiotique ont été ajoutés à l’aide de pipettes stériles. Les plaques étaient délicatement mélangées par rotation circulaire pour assurer une distribution homogène et laissées solidifier à température ambiante. Grâce au mélange à volume égal et à l’ajout d’agar, les concentrations d’antibiotiques ont été réduites d’environ 9 fois.
Pour les tests combinés, 1 mL de la concentration la plus basse de fosfomycine (40 μg/mL) a été combiné avec 1 mL de chacune des huit dilutions de gentamicine (2,5–320 μg/mL), puis ajouté dans des boîtes de Petri séparées et délicatement mélangé. La même procédure a été répétée pour la concentration suivante de fosfomycine (80 μg/mL), puis poursuivie étape par étape jusqu’à 5120 μg/mL, garantissant que toutes les combinaisons possibles de concentrations étaient testées. Une nouvelle pointe de pipette stérile a été utilisée pour chaque transfert afin d’éviter la contamination croisée. Au total, 64 boîtes de Petri (8 × 8 combinaisons) ont été préparées pour la combinaison fosfomycine-gentamicine (Tableau 5).
La même procédure a été appliquée à la fosfomycine en combinaison avec le métropène et la céftriaxone, aboutissant à 64 plaques pour chaque combinaison d’antibiotiques (Tableau 6 et Tableau 7).
Tableau 5 : Disposition de la combinaison fosfomycine-gentamicine sur le médium MHA. Disposition des concentrations d’antibiotiques sur l’agar Mueller–Hiton. FF = fosfomycine ; GN = gentamicine. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau 6 : Disposition de la combinaison fosfomycine-mériopenème sur le milieu MHA. Disposition des concentrations d’antibiotiques sur l’agar Mueller–Hiton. FF = fosfomycine ; MEM = meropenème. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau 7 : Disposition de la combinaison fosfomycine-céphtriaxone sur un milieu MHA. Disposition des concentrations d’antibiotiques sur l’agar Mueller–Hiton. FF = fosfomycine ; CRO = ceftriaxone. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Après la préparation des mélanges antibiotiques, 18 mL d’agar Mueller–Hinton en fusion (45–50 °C) ont été ajoutés à chaque plaque contenant 1 mL du mélange antibiotique, garantissant que les conditions de température ne compromettaient pas l’activité antibiotique. Cela a entraîné une dilution d’environ 9 fois la solution initiale d’antibiotique.
Pour une évaluation systématique, les plaques étaient disposées selon un format damier (dilution bidimensionnelle). Les concentrations de fosfomycine étaient organisées selon l’axe vertical (rangées A–H), la concentration la plus élevée étant à la rangée A et les concentrations décroissantes vers la rangée H. Le deuxième antibiotique était disposé le long de l’axe horizontal (colonnes 1 à 8), avec des concentrations croissantes de la colonne 1 à la colonne 8. Chaque position bien équivalente représentait donc une combinaison unique de deux concentrations d’antibiotiques, permettant une évaluation complète des effets d’interaction.
Évaluation des résultats
Les résultats de la concentration inhibitrice minimale ont été évalués selon les recommandations de l’EUCAST v.11. Les plaques de contrôle de la croissance ont montré une croissance bactérienne visible, tandis que les plaques de contrôle de stérilité (non inoculées) n’ont montré aucune croissance. La CMI a été définie comme la concentration la plus basse à laquelle aucune croissance visible n’a été produite. Pour les tests combinés, les effets d’interaction ont été interprétés à l’aide des valeurs FICI. La synergie était définie comme FICI ≤ 0,5, l’indifférence comme > 0,5–4, et l’antagonisme comme > 4. Pour la fosfomycine, les valeurs de CMI ≤ 32 μg/mL étaient considérées comme susceptibles, et celles > 32 μg/mL étaient considérées comme résistantes. Pour la gentamicine et le meropenème (dans les infections à méningite), les valeurs de CMI ≤ 2 μg/mL étaient considérées comme susceptibles, et celles > 2 μg/mL étaient jugées résistantes. Pour le métropène (dans les infections non méningites), les valeurs de CMI ≤ 2 μg/mL étaient considérées comme susceptibles. Les valeurs > 8 μg/mL ont été jugées résistantes, la CMI ≤ 1 μg/mL pour la ceftriaxone (pour les infections non méningitées) a été jugée susceptible, la CMI ≤ 2 μg/mL pour la ceftriaxone (pour les infections à méningite) a été jugée susceptible, et la CMI > 1 μg/mL pour la ceftriaxone (pour les infections à méningite) a été considérée commerésistante à 16.
L’analyse statistique des données de l’étude a été réalisée à l’aide de logiciels statistiques.
Statistiques : Les variables catégorielles étaient exprimées en nombres et en pourcentages. Le test du chi-carré de Pearson a été utilisé pour des comparaisons où tous les décomptes cellulaires attendus étaient ≥5. Le test exact de Fisher a été utilisé pour des analyses avec de petites tailles d’échantillons ou lorsque le nombre de cellules attendu était de <5. Plus précisément, le test du chi-carré a été utilisé pour des comparaisons globales des taux de résistance à la fosfomycine, tandis que le test exact de Fisher a été utilisé pour des analyses de sous-groupes des taux d’interaction synergiques, additives et antagonistes dues à des distributions de basse fréquence dans certaines combinaisons. Une valeur P ≤ 0,05 était considérée comme statistiquement significative.
Note d’interprétation : De minuscules colonies uniques dans les zones d’inhibition n’étaient pas considérées comme en croissance à moins d’être confluentes ou reproductibles lors de tests répétés.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Conclusions
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Un total de 60 isolats d’E. coli résistants aux carbapénens ont été inclus dans l’étude. Tous les isolats ont été obtenus auprès de patients hospitalisés en unités de soins intensifs ou en service clinique des hôpitaux de la faculté de médecine de l’Université Dicle. Les patients adultes représentaient 83,3 % des cas, tandis que les patients pédiatriques représentaient 16,7 % (Tableaux 8 et Tableau 9). La résistance multimédicamenteuse a été observée dan...
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.
Remerciements
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Cette étude a été soutenue par l’Unité de coordination des projets de recherche scientifique de l’Université Dicle (DÜBAP) avec le numéro de projet SBE.21.004.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE
Demander une autorisation