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Article de méthode

Séquençage à ARN unicellulaire du tissu pulmonaire dans un modèle rat du syndrome de détresse respiratoire aiguë

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DOI :

10.3791/70491

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7 avril 2026

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1Dongzhimen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine

Dans cet article

Résumé

Cet article présente un protocole standardisé pour l’analyse du séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) du tissu pulmonaire dans un modèle de rat du syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA). Il détaille les étapes allant de l’établissement du modèle induit par le LPS à l’analyse bioinformatique, identifiant 21 groupes cellulaires et 6 sous-populations de macrophages, et met en lumière les principales voies inflammatoires impliquées dans la pathogenèse du SDRA.

Résumé

Le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) est une affection inflammatoire pulmonaire sévère avec une forte mortalité, caractérisée par des réponses immunitaires dérégulées et des lésions alvéolaires, mais son hétérogénéité cellulaire reste incomplètement comprise. Le séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) offre une résolution sans précédent pour disséquer des mécanismes spécifiques à chaque type cellulaire, mais son application dans le SDRA est entravée par la variabilité technique. Ici, nous présentons un protocole standardisé pour l’analyse scRNA-seq du tissu pulmonaire dans un modèle de SDRA de rat induit par les lipopolysaccharides (LPS). Cette méthode inclut une dissociation tissulaire optimisée, un contrôle qualité rigoureux, le retrait des doublets, la correction d’effet batch et des pipelines bioinformatiques complets pour le clustering, l’annotation et l’analyse d’expression différentielle. Notre approche identifie de manière fiable 21 populations cellulaires distinctes et révèle six sous-populations de macrophages/monocytes présentant des signatures transcriptionnelles uniques dans le SDRA. L’expression différentielle des gènes et l’analyse d’enrichissement fonctionnel spécifiques à un sous-groupe ont également identifié les gènes clés et les voies sous-jacentes à la pathogenèse du SDRA. Ce flux de travail reproductible permet une caractérisation approfondie de la diversité cellulaire, des voies inflammatoires et des cibles thérapeutiques candidates, fournissant une base solide pour des études mécanistes et translationnelles sur le SDRA.

Introduction

Le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) est une maladie respiratoire aiguë caractérisée par une inflammation diffuse des poumons et un œdème pulmonaire non cardiogénique, qui se manifeste principalement par une hypoxémie progressive et une insuffisancerespiratoire 1,2. Les mécanismes pathologiques du SDRA impliquent des cascades inflammatoires dérégulées, la perturbation de la barrière alvéolaire-capillaire, ainsi que l’activation et les interactions anormales de plusieurs types de cellulesimmunitaires 3,4. Au cours de la progression du SDRA, les cellules immunitaires du tissu pulmonaire entraînent des cascades inflammatoires par sécrétion de médiateurs inflammatoires et la modulation des réponses immunitaires, perturbant ainsi l’endothélium pulmonaire, déclenchant l’activation de la cascade de coagulation extrinsèque et aggravant la lésionpulmonaire 5,6,7. Cependant, la compréhension actuelle des mécanismes pathologiques au niveau cellulaire du SDRA reste limitée, ce qui limite le développement de thérapies pharmacologiques spécifiques, tandis que les stratégies de prise en main actuelles consistent principalement en diverses modalités de soutien à l’oxygène et de ventilationmécanique 1. La caractérisation approfondie de l’hétérogénéité cellulaire et des changements dynamiques lors de la pathogenèse du SDRA est d’une importance capitale pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et développer de nouvelles stratégiesthérapeutiques 8,9,10.

L’émergence de la technologie de séquençage à ARN unicellulaire (scRNA-seq) a apporté des avancées révolutionnaires dans la recherche sur le séquençage d’ARN, nous permettant de disséquer l’hétérogénéité cellulaire et la dynamique fonctionnelle dans la pathogenèse des maladies11,12. Comparée au séquençage traditionnel à ARN en masse, la technologie scRNA-seq peut identifier des sous-populations cellulaires rares mais critiques, révéler des processus dynamiques de transitions entre états cellulaires et découvrir des réseaux d’interactions intercellulaires complexes, des informations souvent masquées dans les analyses au niveaudes populations 13,14,15. Des études récentes sur le scRNA-seq dans le SDRA ont permis des avancées significatives, notamment l’identification de signatures spécifiques d’expression génique de monocytes, la découverte de schémas de polarisation anormales des macrophages, et l’élucidation des réseaux de communication intercellulaireprofibrotiques 16,17,18,19 . Ces résultats approfondissent non seulement notre compréhension des mécanismes physiopathologiques du SDRA, mais offrent également de nouvelles perspectives sur le développement des biomarqueurs, la stratification des maladies et la thérapie deprécision 20,21.

Cependant, la recherche actuelle sur le SCRNA-seq de l’ARDS rencontre des défis, notamment une standardisation méthodologique insuffisante, des différences substantielles dans les protocoles de traitement des échantillons et des pipelines d’analyse de données incohérents, qui limitent la reproductibilité des résultats de recherche et de leurs applications translationnellescliniques 22,23. Ce protocole répond aux défis techniques liés à l’analyse scRNA-seq du tissu pulmonaire ARDS en optimisant les procédures de traitement des tissus, de contrôle qualité et d’analyse des données, fournissant ainsi une base pour les études mécanistes et le développement thérapeutique. L’approche standardisée garantit la reproductibilité entre différents laboratoires et facilite les études comparatives dans la recherche sur l’hétérogénéité cellulaire sur le SDRA.

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Protocole

Douze rats mâles Sprague-Dawley (SD) sans agents pathogènes spécifiques (SPF), âgés de 6 à 7 semaines et pesant 220 g ± 10 g, ont été achetés auprès de Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Numéro de licence animale : SCXK (Jing) 2025-0008). Les rats ont été hébergés au Centre des animaux de laboratoire de l’hôpital Dongzhimen, Université de médecine chinoise de Pékin, conformément à la norme nationale « Besoins des animaux de laboratoire en matière d’environnement et d’hébergement » (GB 14925-2010, émise par le Comité technique de normalisation des animaux de laboratoire de Chine). Les procédures expérimentales ont été approuvées par le Comité de bien-être animal et d’éthique de l’hôpital Dongzhimen, Université de médecine chinoise de Pékin (Numéro d’approbation : 24-54). Les réactifs et l’équipement utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Établissement du modèle et collecte d’échantillons

REMARQUE : Avant l’expérience, soumettez tous les rats à une période d’acclimatation d’une semaine afin de minimiser les effets induits par le stress.

  1. Dissolver Escherichia coli lipopolysaccharide (LPS) dans une solution saline à 0,9 % pour obtenir une solution de LPS à 0,4 mg/mL.
  2. Divisez aléatoirement 12 rats mâles de Sprague-Dawley (SD) avec SPF en deux groupes : un groupe témoin (n = 6) et un groupe modèle ARDS (n = 6).
  3. Administrez 0,9 % de solution saline par injection intratrachéale à une dose de 0,5 mL/100g de poids corporel au groupe témoin.
  4. Administrez la solution LPS de 0,4 mg/mL par injection intratrachéale au même volume (0,5 mL/100g) au groupe modèle ARDS, puis après 16 heures, anesthésiez les rats à l’aide d’isoflurane (selon les protocoles approuvés par l’institution).
  5. Prélever du sang via l’aorte abdominale, puis centrifuger (4 °C, 1000 × g, 30 min) pour obtenir le sérum.
  6. Ouvrez la cavité thoracique et extrayez le tissu pulmonaire.
  7. Effectuer un lavage bronchoalvéolaire via le moignon bronchique à l’aide d’une seringue pour obtenir le liquide de lavage bronchoalvéolaire (BALF)24,25.
  8. Prélève le lobe pulmonaire droit et rince-le avec du PBS pour un examen pathologique ultérieur.
  9. Prélever le lobe pulmonaire gauche et le rincer avec PBS pour les expériences ultérieures de séquençage unicellulaire et de biologiemoléculaire 26,27.

2. Évaluation histopathologique du tissu pulmonaire

  1. Immergez le tissu du poumon droit prélevé chez les rats dans du paraformoldéhyde à 4 % pour fixation pendant 12 heures.
  2. Après fixation, déshydratez le tissu à travers une série graduée d’éthanol (70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 100 % et 100 %), en laissant 2 heures à chaque concentration.
  3. Traitez le tissu déshydraté avec du xylène jusqu’à ce qu’il devienne transparent.
  4. Infiltrez le tissu transparent avec de la paraffine fondue dans un four à 60 °C pendant 2 heures.
  5. Placez le bloc de tissu infiltré dans un moule d’enrobage, versez de la paraffine fraîche, puis laissez-le refroidir et se solidifier en un bloc de paraffine.
  6. Coupez le bloc de paraffine en tranches de 4 μm d’épaisseur à l’aide d’un microtome, faites flotter les sections sur un bain-marie à 45 °C pour les étaler, puis soulevez-les avec des lames recouvertes de poly-L-lysine.
  7. Faites cuire les lames dans un four à 60 °C pour garantir une adhérence ferme des sections aux lames.
  8. Déparaffinez les sections par immersion dans le xylène et réhydratez-les à travers un gradient descendant d’éthanol (100 %, 95 %, 90 %, 80 % et 70 %).
  9. Rincez les sections avec du PBS, effectuez une coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (HE), et montez les bâtons de couverture avec une résine neutre.
  10. Évaluer la lésion pulmonaire sur des coupes à lames entières à l’aide d’un système de notation standardisé basé sur l’infiltration des neutrophiles, l’inflammation interstitielle, l’œdème et la congestion.
    REMARQUE : Chaque paramètre a été noté de 0 à 4 en fonction de l’étendue de l’implication pathologique : 0 (aucun) ; 1 (≤25 %) ; 2 (26-50%); 3 (51-75%); 4 (>75 %)28,29.

3. Dosage immunosorbant lié aux enzymes

REMARQUE : Les échantillons peuvent être maintenus à -80 °C si l’analyse ne peut pas être effectuée immédiatement après l’acquisition.

  1. Dissoudez les standards et laissez-les reposer à température ambiante pendant 15 minutes, puis effectuez une dilution en série selon les instructions du fabricant.
  2. Préparez la solution de travail des anticorps biotinylés, la solution conjuguée enzymatique et le tampon de lavage comme indiqué dans le manuel.
  3. Ajoutez 100 μL de chaque échantillon ou 100 μL d’étalons dilués en série dans les puits enrobés d’anticorps, puis incubez à 37 °C pendant 90 minutes.
  4. Lavez la plaque 4 fois avec une rondelle à plaques, ajoutez 100 μL de solution active à anticorps biotinylés, et incubez à 37 °C pendant 30 minutes.
  5. Lavez la plaque 4 fois, ajoutez 100 μL de solution de travail conjuguée enzymatique, puis incubez à 37 °C pendant 30 minutes.
  6. Ajoutez 100 μL de solution substrat par puits, incubez à l’abri de la lumière à 37 °C pendant 10 minutes.
  7. Ajoutez 100 μL de solution d’arrêt par puits, mélangez doucement, et mesurez la densité optique (OD) à 450 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques.
  8. Générez une courbe standard en représentant les valeurs de OD par rapport aux concentrations standard à l’aide du logiciel conçu.
  9. Déterminer les concentrations d’échantillon en fonction des valeurs de OD mesurées et de la courbe standard.

4. Préparation des suspensions à cellule unique pour le séquençage

REMARQUE : Après l’obtention du tissu pulmonaire, il doit être mis sur glace et traité rapidement pour maintenir la viabilité cellulaire.

  1. Lavez le tissu pulmonaire 3 fois avec du PBS pré-refroidi à 4 °C.
  2. Ajoutez 2 mL de PBS pré-refroidi et réduisez-les en fragments plus petits à l’aide de ciseaux stériles pour atteindre environ 0,5mm 3 pouce.
  3. Utilisez une pipette Pasteur pour transférer le tissu haché avec le PBS dans un tube centrifugeuse de 15 mL.
  4. Ajoutez 1 mL supplémentaire de PBS pré-refroidi à 4 °C dans la boîte de culture, rincez et resuspendez les fragments de tissu restants, puis transférez la suspension dans le même tube.
  5. Ajustez le volume à 6,5 mL avec PBS pré-refroidi à 4 °C, digestez les fragments de tissu dans une solution enzymatique contenant la collagénase I (100 U/mL) et la Dispase II (1 U/mL), puis incubez avec un léger secouement à température ambiante pendant 30 minutes.
  6. Lorsque les fragments de tissu deviennent translucides et qu’il ne reste aucun morceau solide distinct, filtrez le tissu digéré à travers des filtres cellulaires de 70 μm et 40 μm, puis centrifugez (4° C, 500 × g, 5 min) et jetez le surnageant.
  7. Suspendez immédiatement le pellet dans 3 mL de tampon de lyse de globules rouges (RBC), mélangez doucement en pipettant, puis lisez sur de la glace pendant 10 minutes.
  8. Lorsque le surnageant apparaît jaune pâle ou presque incolore, ajoutez 7 mL de PBS pour terminer la réaction, centrifugez (4 °C, 500 × g, 5 min), puis jetez le surnageant.
  9. Ajoutez 3 mL de PBS pour resuspendre les cellules et déterminer la concentration et la viabilité cellulaires en utilisant la coloration au bleu de trypan.
    REMARQUE : Si la viabilité cellulaire est inférieure à 70 %, effectuez une procédure d’extraction des cellules mortes.
  10. Lavez les cellules deux fois avec un tampon de lavage contenant 0,04 % d’albumine sérique bovine (BSA) préparé dans le DPBS.
  11. Resuspendez les cellules pour le comptage et ajustez la concentration à 1 000 cellules/μL pour la charge et la détection ultérieures.

5. Contrôle qualité des données de séquençage monocellule

REMARQUE : Les bibliothèques d’ARN monocellulaire ont été préparées à partir de suspensions cellulaires en utilisant une méthode de construction de bibliothèque unicellulaire basée sur des gouttelettes. Les bibliothèques étaient séquencées sur une plateforme à haut débit utilisant la chimie de séquençage basée sur des nanobilles d’ADN. Environ 21 000 cellules ont été chargées par bibliothèque, visant un taux de récupération cellulaire de ~60 %. Le séquençage générait un total de 5,0 ×10 8 lectures par bibliothèque, avec une profondeur moyenne de 30 000 à 40 000 lectures par cellule. Les données brutes de séquençage ont été traitées à l’aide du pipeline d’analyse d’ARN unicellulaire correspondant pour produire la matrice d’expression génique de chaque échantillon.

  1. Construire la bibliothèque Oligo par PCR et marquage par code-barres, en assurant une concentration >10 ng/μL et un pic de 180 pb ±10 pb.
  2. Construisez la bibliothèque d’ADNc par fragmentation, réparation terminale, ligature par adaptateur et PCR, en assurant une concentration >10 ng/μL et un pic de 350–550 pb.
  3. Générez un objet Seurat pour chaque échantillon à partir de la matrice d’expression génique en utilisant la fonction Read10X dans le package Seurat (v4.3.0) dans le logiciel R (v4.2.0).
  4. Éliminer les cellules de faible qualité en éliminant celles présentant une proportion de gènes mitochondriaux >10 % ou une proportion de gènes d’hémoglobine >5 %.
  5. Normaliser les données en utilisant la méthode « LogNormalisation » avec un facteur d’échelle de 10 000.
  6. Identifier les caractéristiques très variables en utilisant la méthode « vst » et conserver les 2 000 premiers gènes pour une analyse en aval.
  7. Effectuez le score du cycle cellulaire en utilisant les gènes marqueurs du cycle cellulaire intégrés à Seurat et régressez les effets du cycle cellulaire (G2M. Score et S.Score) lors de l’échelisation des données.
  8. Détecter et supprimer les doublets potentiels à l’aide de DoubletFinder (v2.0.3) avec pN = 0,25, pK = 0,09, et un taux de doublets attendu de 0,06, et exclure ceux-ci du traitement ultérieur.
  9. Corrects effets de lot entre échantillons en utilisant le package Harmony (v0.1.1) avec theta = 2 et max.iter.harmony = 20.
  10. Ajoutez des colonnes d’information pour les noms d’échantillons individuels et les détails de regroupement du groupe de modèles ARDS et du groupe de contrôle aux métadonnées de l’objet Seurat.

6. Réduction de dimensionnalité, regroupement et annotation des types de cellules

  1. Effectuer une analyse en composantes principales (PCA) sur des gènes très variables en utilisant la fonction RunPCA dans Seurat.
  2. Déterminez le nombre optimal de composantes principales grâce à la visualisation ElbowPlot.
  3. Identifiez les principaux clusters cellulaires en appliquant l’algorithme de Leiden via la fonction FindClusters et la fonction FindNeighbors de Seurat, avec une résolution de 0,1.
  4. Réaliser la réduction de dimensionnalité de l’UMAP en utilisant les composants principaux sélectionnés.
  5. Annoter les types cellulaires en identifiant les gènes marqueurs avec la fonction FindAllMarkers.
  6. Visualisez l’expression génique des marqueurs à travers les types cellulaires à l’aide de la fonction DotPlot.
  7. Ajoutez une nouvelle colonne d’information des résultats d’annotation de cellules aux métadonnées et visualisez l’annotation par type de cellule avec Umap.
  8. Calculez la proportion de chaque groupe expérimental au sein de chaque type cellulaire identifié à l’aide de fonctions dplyr pour compter les cellules et calculer les pourcentages.
  9. Générez des graphiques à barres empilées avec ggplot2 pour illustrer la composition des groupes par type de cellule, incluant des pourcentages et des comparaisons statistiques entre groupes.

7. Analyse des sous-populations

  1. Extraire la sous-population de cellules cibles en utilisant la fonction de sous-ensemble et créer un objet Seurat correspondant pour une analyse au niveau de la sous-population en aval.
  2. Renormalisez et réajustez les données de sous-population tout en régressant les gènes mitochondriaux, les gènes de l’hémoglobine, les numéros d’UMI et les scores du cycle cellulaire.
  3. Effectuer une analyse PCA secondaire et appliquer la correction par lots de Harmony spécifiquement pour la sous-population.
  4. Effectuer un regroupement en utilisant les fonctions FindNeighbors et FindClusters pour identifier des sous-types distincts au sein des sous-populations cellulaires cibles.
  5. Générez de nouveaux embeddings UMAP et visualisez les sous-groupes de sous-populations avec des annotations de type cellulaire en suivant la même approche que précédemment.

8. Analyse différentielle de l’expression génique

  1. Identifier les gènes différenciellement exprimés (DEG) entre le groupe modèle ARDS et le groupe témoin pour chaque sous-groupe à l’aide de la méthode statistique MAST.
  2. Incorporer la régression à variables latentes pour contrôler les effets de profondeur du séquençage lors des tests d’expression différentielle.
  3. Filtrez les DEG en fonction de seuils de changement logaritarithiques prédéfinis et ajustez les valeurs p à l’aide de la fonction FindMarkers.
  4. Générez des graphiques volcaniques avec la fonction ggplot pour chaque sous-groupe afin de visualiser les schémas d’expression génique différentiels avec un marquage de signification.
  5. Exportez les résultats de DEG et créez des tableaux résumés complets pour faciliter l’enrichissement fonctionnel et d’autres analyses en aval.

9. Analyse de l’enrichissement

  1. Associez les symboles génétiques aux identifiants ENTREZ en utilisant l’organisation. Rn.eg.db base de données d’annotation pour la compatibilité de l’analyse des voies.
  2. Combinez les DEG de tous les sous-groupes et filtrez les gènes significatifs en fonction des seuils de changement logaritmique et des valeurs p ajustées (test de somme de rang de Wilcoxon, logfc.threshold = 0,25, p_val < 0,05).
  3. Effectuer une analyse d’enrichissement par ontologie génique (GO) en utilisant la fonction d’enrichissement GO avec les catégories d’ontologies de processus biologiques, de fonction moléculaire, de composants cellulaires et la méthode de correction de Benjamini-Hochberg.
  4. Réaliser une analyse d’enrichissement des voies de l’Encyclopédie des gènes et génomes de Kyoto (KEGG) en utilisant la fonction d’enrichissement KEGG avec la base de données des organismes rats et appliquer des seuils de signification statistique.
  5. Générez des diagrammes de points pour les résultats d’enrichissement GO et KEGG en utilisant la fonction dotplot, affichant les 15 termes les plus significativement enrichis avec des rapports géniques et des valeurs p ajustées.
  6. Exportez les résultats d’enrichissement sous forme de fichiers CSV et enregistrez les graphiques de visualisation pour une interprétation complète de l’analyse des voies.

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Résultats

La coloration HE du tissu pulmonaire de rat a montré des structures alvéolaires claires avec une inflammation minimale chez les témoins, tandis que le groupe modèle ARDS a présenté des cavités alvéolaires déformées, des parois épaissies et une infiltration significative des cellules inflammatoires, comme le montrent les scores correspondants de lésions pulmonaires (Figure 1A–E). Des niveaux élevés d’IL-6, TNF-α et IL-1β dans le BALF et le sé...

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Discussion

Ce protocole propose une approche standardisée pour l’analyse du séquençage de l’ARN unicellulaire du tissu pulmonaire dans un modèle rat du syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA). Ces résultats démontrent l’établissement réussi du modèle SDRA induit par le LPS, confirmé par l’examen histopathologique, des scores élevés de lésions pulmonaires et des niveaux accrus de cytokines inflammatoires dans les BALF et le sérum. L’analyse transcriptomique unicellulaire a révélé 21 populatio...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs souhaitent reconnaître le soutien du Projet Horizontal de l’Hôpital Dongzhimen, Université de Médecine Chinoise de Pékin (HX-DZM-202114).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Solution bleue de Trypan à 0,4 %Gibco, États-Unis15250061
4 % de paraformoldéhydeServicebio, ChineG1101
Albumine sérique bovine (BSA)Sangon Biotech, ChineA600332-0005
Colagnase IYEASEN, Chine40507ES60
CurveExpertDéveloppement des Hyamsv1.4
Dispase IIYEASEN, Chine40104ES60
Escherichia coli lipopolysaccharide (LPS) & nbsp ;Sigma, USAL6511
Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (HE)Solarbio, ChineG1120
Séquenceur de gènes à haut débit   ;MGI Tech Co., LtdMGISEQ-2000RS
Inhibiteur de phosphataseBeyotime Biotechnology, ChineP1081
Solution tamponnée au phosphateSolarbio, ChineP1020
PMSFSolarbio, ChineR0010
R software  ;Lucent Technologies, États-Unisv4.2.0
rat IL-1 et bêta ; Kit ELISA4abio, ChineCRE0006
kit rat IL-6 ELISA4abio, ChineCRE0005
rat TNF-& alpha ; Kit ELISA4abio, ChineCRE0003
Tampon de lyse des globules rouges (globules rouges)Solarbio, ChineR1010
Tampon de lyse des globules rougesTiangen Biotech, ChineRT122-1
Eau sans RNaseAmbion, États-UnisAM9937
Tampon TE, pH 8,0Ambion, États-UnisAM9858
Tampon de transfert de tris-glycineServicebio, ChineG2017

Références

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