Article de méthode

Évaluation de sphéroïdes 3D pour des études de transduction par AAV

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DOI :

10.3791/70517

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14 août 2026

 , 
1Office of Gene Therapy, Office of Therapeutic Products, Center for Biologics Evaluation and Research

Dans cet article

Résumé

Les systèmes de culture tridimensionnels en sphéroïdes améliorent les modèles conventionnels en 2D pour le développement de la thérapie génique par AAV. Cette méthodologie permet une détection sensible de la transduction par l'AAV à faibles doses, une pertinence physiologique accrue et une surveillance robuste à long terme. La plateforme permet l'évaluation de la puissance, le criblage à haut débit et l'optimisation des vecteurs sur diverses lignées cellulaires et sérotypes d'AAV.

Résumé

Les virus adéno-associés (AAV) sont des vecteurs puissants utilisés pour la livraison de gènes dans les produits de thérapie génique. Leur développement nécessite des systèmes in vitro capables de détecter de manière fiable les différences dans la conception du vecteur, la performance du sérotype, la force des éléments régulateurs et la cinétique d'expression. Ces systèmes doivent également permettre des applications telles que l'évaluation de la puissance et l'optimisation du vecteur. Nous décrivons ici une plateforme simplifiée en trois dimensions, sous forme de sphéroïdes, optimisée pour évaluer la puissance des AAV, la cinétique d'expression du transgène et l'efficacité de transduction spécifique à chaque sérotype dans diverses lignées cellulaires. Des sphéroïdes uniformes sont générés à l'aide de plaques à adhérence ultra-faible et maintenus dans des conditions favorisant une architecture stable et un imagerie à long terme. Après la transduction par les AAV, les signaux fluorescents ou luminescents sont surveillés en temps réel à l'aide de systèmes d'imagerie de cellules vivantes. Cela permet une évaluation quantitative du signal rapporteur, de la réponse à la dose, de l'activité des éléments régulateurs et du délai d'apparition grâce à une imagerie cinétique continue. La plateforme permet de distinguer efficacement les conceptions de génomes vecteurs puissants de celles qui sont faibles, ainsi que différents sérotypes d'AAV. Cette méthode montre des performances robustes, tant sur des lignées cellulaires à division lente que rapide. Ces résultats établissent son utilité comme système évolutif et physiologiquement pertinent pour l'évaluation et le développement précliniques de thérapies géniques.

Introduction

Les vecteurs AAV sont devenus l'un des systèmes de transfert génique privilégiés pour les applications in vivo en raison de leur profil de sécurité et de leur capacité à assurer une expression génique persistante1. La thérapie génique par AAV connaît des succès dans le traitement de plusieurs maladies rares, avec des centaines de produits en cours de développement2. De plus, des applications émergentes incluent la livraison in vivo de composants d'édition du génome tels que Cas9, offrant un fort potentiel pour aider au traitement de pathologies difficiles à traiter3. Les principaux défis du développement comprennent les coûts élevés de fabrication et la capacité limitée des essais in vitro actuels à prédire la qualité du produit et l'efficacité clinique4.

Le développement des thérapeutiques à base d'AAV est fondamentalement limité par l'absence de tests d'activité prédictifs et normalisés capables de prévoir avec précision les performances cliniques4,5. Ces tests constituent un élément essentiel du processus de développement, car ils sont utilisés à plusieurs fins, notamment le criblage de bibliothèques de vecteurs conçus, l'optimisation des modifications de la capside pour améliorer le ciblage, et l'évaluation de la tropisme tissulaire spécifique. Ils permettent également de caractériser l'influence des séquences régulatrices sur l'expression du transgène6. Au-delà du choix des candidats, les tests de transduction par l'AAV contribuent également de manière cruciale au contrôle qualité de la fabrication, grâce à des tests de puissance utilisés pour la libération des lots, les études de comparabilité entre lots et les évaluations de stabilité6,7.

Le défi scientifique consiste à développer des tests capables de saisir la complexité des interactions vecteur-hôte tout en restant réalisables dans la pratique pour une utilisation courante7,8. Les approches actuelles incluent l'utilisation de lignées cellulaires immortalisées représentant l'organe cible dans des cultures traditionnelles en monocouche bidimensionnelle. Ces conditions de culture manquent de pertinence physiologique et nécessitent des doses élevées de médicaments, ce qui crée un écart important entre les prédictions de laboratoire et la transposabilité clinique. De nouvelles lignées cellulaires conçues, telles que les systèmes surexprimant AAVR ou activés par CRISPR, constituent des progrès importants, mais ne parviennent pas à reproduire l'architecture tridimensionnelle et les interactions avec la matrice extracellulaire caractéristiques des tissus natifs9,10,11. Des modèles de nouvelle génération capables de mieux simuler les microenvironnements in vivo pourraient combler cet hiatus translationnel12,13,14.

Nous avons récemment mis au point un système de sphéroïdes tridimensionnels optimisé pour la transduction par les AAV afin d'améliorer la transposabilité des tests de transduction par les AAV. Ce système améliore de manière significative l'efficacité de la transduction par les AAV dans plusieurs lignées cellulaires et sérotypes d'AAV par rapport aux tests bidimensionnels considérés comme la norme. En plus d'une sensibilité accrue et d'une meilleure conservation du produit utilisé dans le test, ces modèles surpassent les monocouches bidimensionnelles en offrant des interactions cellulaires réalistes, variables selon la localisation cellulaire au sein du sphéroïde. Ils permettent également une étude pertinente de la pénétration des médicaments, simulant des conditions organiques réelles11,15,16. Par ailleurs, cette approche par sphéroïdes présente des avantages pratiques par rapport à des systèmes plus complexes comme les organoïdes ou les cocultures, car elle utilise du matériel de laboratoire standard et ne nécessite ni milieu spécialisé ni support particulier. Cette simplicité garantit reproductibilité et possibilité de mise à l'échelle, ce qui la rend particulièrement adaptée aux tests de thérapie génique de routine et aux procédés de développement de vecteurs17.

Cette plateforme en sphéroïdes tridimensionnels est particulièrement bien adaptée aux applications nécessitant une détection sensible de la transduction par les AAV à faible dose et à l'évaluation comparative de conceptions de génomes viraux. Elle permet également d'évaluer le tropisme dépendant du sérotype. Elle est particulièrement avantageuse pour les lignées cellulaires présentant une efficacité de transduction relativement faible et nécessitant de fortes doses d'AAV dans les cultures conventionnelles en deux dimensions. Dans ces contextes, la sensibilité accrue et la pertinence physiologique améliorée de la plateforme tridimensionnelle sont essentielles. Toutefois, ce système peut être moins adapté aux études nécessitant des composants immunitaires, une distribution vasculaire ou une complexité tissulaire complète. En effet, les sphéroïdes ne reproduisent pas intégralement l'environnement in vivo .

Ainsi, nous présentons un protocole simple de sphéroïdes tridimensionnels optimisé pour les tests de transduction par AAV, comportant deux lectures critiques et complémentaires : l'efficacité de la transduction (définie ici comme le signal rapporteur total par sphéroïde) et la cinétique de transduction. Cette méthode fournit une plateforme rentable, physiologiquement pertinente et informative pour l'évaluation de la puissance des AAV, la conception de vecteurs et les tests de neutralisation.

Protocole

Cette étude a utilisé des lignées cellulaires humaines établies (HEK293T, HeLa, Huh7, HEP3B, HEPG2 et A375) provenant de sources commerciales ou publiées précédemment. Aucun échantillon humain primaire ni animal n'a été utilisé, et aucune approbation éthique n'était donc requise.

1. Installation stérile et préparation initiale de la hotte

  1. Activer la cabine de sécurité biologique.
  2. Allumer la cabine de sécurité microbiologique à flux laminaire de classe II 15 minutes avant le début des travaux afin de permettre un temps suffisant pour la stabilisation de l'écoulement de l'air.
  3. Asperger toutes les surfaces intérieures de la hotte avec de l'éthanol à 70 % (v/v).
  4. Préparer une solution désinfectante à 5 % (v/v) d'eau de Javel dans un bécher en verre de 500 mL pour l'élimination du surnageant cellulaire et des débris cellulaires.
  5. Nettoyer le matériel en désinfectant soigneusement toutes les micropipettes et boîtes de pointes à l'aide d'éthanol à 70 % (v/v).

2. Préparation du milieu de culture cellulaire

  1. Préparer 500 mL de milieu de base DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) à haute teneur en glucose.
  2. Compléter le milieu de base avec 10 mL de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur (FBS), 1 mL de solution de pénicilline/streptomycine (100 unités/mL de pénicilline et 100 µg/mL de streptomycine) et 5 mL de L-glutamine 2 mM.
    REMARQUE : Les techniques stériles doivent être respectées tout au long des procédures. Un milieu frais doit être préparé pour chaque expérience. Veuillez vous référer au Tableau des matériaux pour les spécifications détaillées du matériel.

3. Préparation des sphéroïdes

  1. Préparer le milieu DMEM complet comme décrit ci-dessus.
  2. Chauffer le milieu de culture dans un bain d'eau à 37 °C pendant 10 à 15 minutes.
  3. Retirer les lignées cellulaires d'intérêt du réservoir d'azote liquide.
  4. Dégeler rapidement les cellules cryoconservées HEK293T, Huh7, HEP3B, HEPG2, A375 et HeLa en les plaçant dans un bain d'eau à 37 °C.
  5. Retirer immédiatement du bain d'eau dès que le dernier cristal de glace a fondu.
  6. Diluer 1 mL de cellules dégelées dans 9 mL de milieu DMEM complet.
    NOTE : Toutes les lignées cellulaires utilisées dans ce protocole sont maintenues dans le même milieu DMEM et les mêmes conditions de culture.
  7. Centrifuger les cellules à 350 × g pendant 5 minutes à température ambiante.
  8. Jeter le surnageant.
  9. Resuspendre le culot dans 5 mL de milieu DMEM complet.
  10. Ensemencer les cellules dans un flacon de culture cellulaire T75.
  11. Placer les flacons ensemencés dans une étuve à culture cellulaire maintenue à 37 °C, 5 % de CO2 et 95 % d'humidité.

4. Surveillance de la croissance cellulaire

  1. Ajouter 15 mL de milieu de culture tous les 3 jours.
  2. Passager les cellules HEK293T, Huh7, HEP3B, HEPG2, A375 et HeLa lorsqu'elles atteignent une confluence de 70 %, puis aspirer le milieu DMEM complet des flacons T75. 
  3. Laver les cellules en ajoutant 5 mL de PBS dans les flacons T75 contenant les cellules. 
  4. Aspirer les 5 mL de PBS 30 secondes après leur ajout dans les flacons T75. 
  5. Répéter cette étape de lavage une fois supplémentaire.  
  6. Traiter les cellules avec 5 mL de trypsine-EDTA à 0,05 % pendant 5 minutes. 
  7. Incuber les flacons dans une étuve à 37 °C pendant 5 minutes afin de permettre un détachement complet des cellules. 
  8. Ajouter 5 mL de milieu DMEM complet pour neutraliser la trypsine. 
  9. Centrifuger les cellules à 350 × g pendant 5 minutes afin d'éliminer la trypsine. 
  10. Resuspendre le culot cellulaire dans 5 mL de DMEM. 
  11. Diviser les cellules selon un facteur de dilution de 1:10 pour le passagement courant. 
    REMARQUE : Il est recommandé de réaliser deux passages cellulaires avant de commencer les expériences, afin de permettre aux cellules d'atteindre la phase exponentielle et de devenir métaboliquement actives. 
  12. Poursuivre l'incubation dans ces conditions contrôlées jusqu'à ce que les cellules atteignent une confluence de 70 %, puis procéder aux étapes expérimentales suivantes.
    REMARQUE : La morphologie cellulaire et les profils de croissance doivent être surveillés régulièrement. Veiller à positionner correctement les flacons pour assurer un échange gazeux optimal. Des conditions stériles sont essentielles tout au long de la période d'incubation.

5. Récolte des cellules et préparation initiale des cellules

  1. Éliminer le milieu de culture en aspirant le milieu existant des flacons T75.
  2. Laver les cellules HEK293T, Huh7, HEP3B, A375, HEPG2 et HeLa trois fois avec du PBS afin d'éliminer le milieu résiduel et les débris.
  3. Ajouter 5 mL de solution de trypsine 1× préchauffée à ces cellules pour détacher les cellules adhérentes de la surface du flacon.
    NOTE : Veiller à ce que la trypsine soit préchauffée afin de maintenir une activité enzymatique optimale. Placer les flacons dans une étuve à 37 °C pendant 5 min pour permettre un détachement complet des cellules. Surveiller attentivement la durée de trypsination afin d'éviter une sur-digestion.
  4. Ajouter 5 mL de milieu de culture complet pour inactiver l'enzyme trypsine.
  5. Pipeter le mélange plusieurs fois de haut en bas pour homogénéiser la solution.
  6. Récupérer chaque suspension cellulaire en transférant entièrement la suspension dans des tubes de centrifugation individuellement étiquetés.
    NOTE : Les cellules doivent être manipulées délicatement lors de la resuspension afin de préserver leur viabilité.
  7. Centrifuger les cellules en effectuant une rotation à 350 × g pendant 5 min à température ambiante afin d'obtenir un culot cellulaire.
  8. Jeter le surnageant et resuspendre délicatement le culot cellulaire dans 5 mL de milieu de culture frais.

6. Numération cellulaire et évaluation de la viabilité à l'aide d'un compteur de cellules

  1. Homogénéisez la suspension en pipetant doucement plusieurs fois de haut en bas afin d'assurer une distribution uniforme des cellules dans tout le tube de centrifugeuse.
  2. Préparez des tubes de comptage pour les cellules HEK293T, Huh7, HEP3B, HEPG2, A375 et HeLa.
  3. Préparez une dilution 1:10 de l'échantillon dans du milieu de culture DMEM complet. Par exemple, 40 µL de suspension cellulaire dans 360 µL de milieu DMEM complet.
  4. Pipetez doucement le mélange de haut en bas quatre fois pour assurer une dilution homogène.
  5. Étiquetez l'échantillon dans le système de connexion, puis indiquez le type cellulaire utilisé, la dilution et le nom de l'échantillon.
  6. Chargez l'échantillon sur le compteur de cellules et placez le tube contenant la suspension cellulaire diluée dans le numéro attribué.
    NOTE : Le compteur de cellules est un compteur automatisé qui aspire les échantillons cellulaires et les mélange avec du bleu de trypan, réduisant ainsi la variabilité d’un opérateur à l’autre.
  7. Laissez la suspension cellulaire se décanter pendant 1 minute avant de compter l'échantillon.
  8. Resuspendez uniformément les cellules avant le comptage afin d'obtenir des résultats précis.
  9. Calculez le nombre total de cellules.
  10. Utilisez la concentration totale de cellules viables pour déterminer le semis cellulaire pour les expériences.
  11. Utilisez des cellules viables présentant une viabilité > à 90 %.
  12. Distinguez les cellules viables (non colorées) des cellules non viables (colorées en bleu).
    NOTE : Des critères de comptage cohérents doivent être maintenus pour tous les échantillons.

7. Semis des sphéroïdes et optimisation de la taille

  1. Pipeter la suspension cellulaire de haut en bas pour homogénéiser la solution.
  2. Ensemencer différentes densités cellulaires à partir de cellules HEK293T, Huh7, HEP3B, HEPG2 ou HeLa.
  3. Commencer par ensemencer 1 x 104 cellules dans 200 µL dans une plaque ULA (ultra-low attachment) de 96 puits à fond rond.
  4. Diluer progressivement les 1 x 104 cellules/puit par dilutions deux fois consécutives jusqu'à atteindre la densité cellulaire souhaitée pour les expériences.
  5. Ajouter 1 volume de milieu complet à toutes les rangées (1B-1H), sauf à la rangée supérieure.
  6. Ajouter 2 volumes de 1 x 104 cellules/puit dans la rangée 1A (rangée supérieure).
  7. Diluer progressivement la rangée 1A en ajoutant 1 volume de la rangée 1A dans la 1B, et ainsi de suite. Voir l'exemple de disposition expérimentale ci-dessous dans la Figure Supplémentaire 1.
    NOTE : Assurez-vous d'une resuspension homogène en tapotant doucement les côtés de la plaque.
  8. Centrifuger la plaque ULA à 350 × g pendant 5 min pour regrouper les cellules au centre et favoriser le contact cellule-cellule.
    NOTE : Si vous utilisez des lignées cellulaires autres que celles décrites ici, une optimisation des paramètres peut être nécessaire, car différentes lignées cellulaires présentent des taux de croissance et de formation de sphéroïdes variables.
  9. Éviter de déranger les plaques pendant les 24 à 48 premières heures afin de permettre la formation initiale des sphéroïdes. Laisser les sphéroïdes mûrir pendant 3 jours pour atteindre un diamètre d'environ 400 µm.
  10. Vérifier l'uniformité de la taille des sphéroïdes. S'assurer que les cellules sont resuspendues uniformément et que les plaques ne sont pas déformées.
    Note : Ne pas utiliser de plaques contenant des sphéroïdes de tailles incohérentes. Veiller à ce que les sphéroïdes aient un diamètre relativement uniforme dans chaque puit.
  11. Surveiller la morphologie des sphéroïdes.
    Note : Les sphéroïdes bien formés apparaissent ronds avec des bords bien définis.
  12. Former des sphéroïdes matures présentant une adhésion cellule-cellule étroite, et non des agrégats cellulaires lâches.
  13. Augmenter la densité d'ensemencement ou prolonger le temps de formation. Si les sphéroïdes ne sont pas compacts, augmenter la densité d'ensemencement ou prolonger le temps de formation.
  14. Minimiser la formation de multiples petits agrégats en réduisant la densité d'ensemencement ou en prolongeant l'étape de centrifugation.

8. Surveillance en temps réel des sphéroïdes en cellules vivantes

  1. Une fois les suspensions cellulaires centrifugées, transférer la plaque dans un incubateur à 37 °C (5 % de CO2, 95 % d'humidité) contenant un dispositif d'imagerie de cellules vivantes pour l'imagerie automatisée de cellules vivantes.
  2. Définir les paramètres pour l'imagerie en temps réel des sphéroïdes cellulaires selon les besoins de l'expérience :
    REMARQUE : Les paramètres suivants ont été utilisés pour toutes les lignées cellulaires testées.
  3. Connectez-vous au logiciel d'acquisition.
  4. Sélectionnez les commandes suivantes :|Programmer pour acquérir | Lancer Ajouter un vaisseau | Analyse prévue selon le programme | Créer un vaisseau : Nouveau.
  5. Sélectionner le type de numérisationSphéroïde. Sélectionner les canaux d'intérêt: Phase + Champ clair (pour suivre la croissance des sphéroïdes), Vert/Rouge (pour suivre la transduction par AAV, temps d'acquisition de 300 ms ou 400 ms respectivement).
  6. Sélectionnez le grossissement souhaité : 10x.
  7. Sélectionnez le modèle de plaque et sa position dans le tiroir.
  8. Sélectionnez la position des puits à imager et le nombre d'images souhaitées par puits.
  9. Saisissez la description de l'expérience : nom, type de cellules, nombre de cellules.
  10. Pour la configuration de l'analyse, sélectionner Reporter l'analyse à plus tard.
  11. Cliquez avec le bouton droit sur la chronologie et sélectionnez l'option Définir l'intervalle du groupe de balayage sélectionné
  12. Définir ajouter des analyses toutes les 6 h et Scanner indéfiniment. Régler le temps de départ souhaité (au moins 1 heure après l'incubation dans l'appareil d'imagerie automatisé).
  13. Vérifiez quotidiennement la croissance des sphéroïdes en vous connectant au logiciel d'imagerie.
  14. Choisir le Voir les analyses récentes option et double-cliquez sur l'expérience souhaitée. |Sélectionner Champ clair dans le panneau des canaux d'image| puis utilisez le |Mesurer l'image| caractéristiques outil permettant de mesurer le diamètre des sphéroïdes.
    REMARQUE : Un temps d'incubation optimal peut être nécessaire pour obtenir des sphéroïdes compacts à partir des cellules d'intérêt.
  15. Retirer la plaque le jour de la formation optimisée des sphéroïdes et l'utiliser pour la transduction par AAV.

9. Transduction par AAV

  1. Acheter ou produire des sérotypes d'AAV3 et les transgènes d'intérêt.
  2. Préparer un milieu DMEM supplémenté en 2 % de FBS pour les transductions par AAV en ajoutant 10 mL de FBS à 490 mL de milieu DMEM.
    NOTE : Pour le criblage des capsides ou des éléments régulateurs génomiques, un transgène GFP s'avère très efficace, comme illustré dans la section des résultats représentatifs. Diluer l'AAV d'intérêt dans du milieu DMEM supplémenté en 2 % de FBS, sans antibiotiques.
  3. Diluer dans une plaque ronde 96 puits désignée pour des dilutions sérielles.
  4. Effectuer des dilutions au 1/10 à partir du MOI initial afin de titrer les AAV1, AAV2, AAV5, AAV8 et AAV9.
  5. Voir l'exemple de disposition expérimentale ci-dessous dans la Figure supplémentaire 2. Calculer le MOI nécessaire pour la transduction par AAV, comme indiqué dans la section Discussion.
  6. Ajouter 33 µL de stock d'AAV à 297 µL de milieu pour obtenir un volume total de 330 µL correspondant à un MOI de 1 × 106.
  7. Effectuer des dilutions sérielles d'un facteur 10, en commençant avec un MOI de 1 × 106, en ajoutant 33 µL à 297 µL de milieu DMEM supplémenté en 2 % de FBS.
    NOTE : Il est recommandé d'éviter les MOI élevés afin de prévenir une viabilité cellulaire réduite. Une optimisation des conditions expérimentales peut être nécessaire pour chaque type cellulaire et chaque sérotype d'AAV, car ceux-ci peuvent fortement influencer le MOI optimal. Tous les génomes viraux ne sont pas infectieux ; les titres fonctionnels peuvent différer de la valeur en vg/mL.

10. Administration de la dose d'AAV

  1. Aspirez tout le milieu de la plaque de sphéroïdes déjà préparée à l’aide d’une pipette multicanal.
  2. Ajoutez 100 µL du MOI souhaité en transférant ce volume de la plaque de dilution vers la plaque de traitement, à l’aide d’une pipette multicanal.
  3. Replacez les plaques dans l’appareil d’imagerie et commencez le suivi de la transduction en mesurant l’intensité fluorescente verte pendant 72 h.
  4. Ajoutez 100 µL de milieu DMEM complet par puits tous les 3 jours pour renouveler les nutriments, si le suivi dépasse 3 jours.

11. Imagerie en direct sur cellules vivantes, suivi de la transduction et analyse des données

  1. Remettre la plaque dans l'appareil après avoir ajouté l'AAV et le MOI souhaités au groupe traité.
  2. Commencer l'enregistrement de l'efficacité de transduction toutes les 6 heures.
    NOTE : L'expression optimale de la GFP prend généralement entre 3 et 5 jours. Cela dépend du promoteur et de la configuration du génome utilisée.
  3. Analyser les données en créant une définition d'analyse spécifique aux cellules et aux gènes rapporteurs d'intérêt.
    NOTE : En alternative, conserver la plaque dans un incubateur standard à 37 °C et évaluer l'efficacité de transduction par qPCR, immunobuvardage (western blotting) ou ELISA.
  4. Définir les paramètres d'analyse en effectuant une analyse en champ clair pour la détection des sphéroïdes primaires.
  5. Optimiser les paramètres de segmentation comme suit :
    1. Type d'analyse : "Spheroid Brightfield."
    2. Méthode de segmentation : "Seuil adaptatif."
    3. Plage de seuil : 0,3–0,8 (ajustement automatique recommandé initialement)
    4. Filtre top-hat : 200–500 µm (supprime l'éclairage inégal)
  6. Optimiser les paramètres en champ clair comme suit :
    1. Charger des images représentatives provenant de différents points temporels.
    2. Tester la plage de seuil (0,2–0,9) afin de trouver une détection optimale.
    3. Ajuster les filtres de taille en fonction de la gamme de taille attendue des sphéroïdes.
    4. Valider la segmentation par inspection visuelle du recouvrement (overlay).
  7. Optimiser le canal vert pour l'évaluation de la transduction par AAV comme suit :
    1. Déterminer les niveaux de fond des puits non traités (MOI=0).
    2. Régler le seuil à 2–3× au-dessus du bruit de fond.
    3. Tester avec l'échantillon traité au MOI le plus élevé.
  8. Optimiser le temps d'exposition afin d'éviter la saturation tout en maintenant le signal
    NOTE : Pour les transductions par AAV, rapporter le signal de fluorescence total par sphéroïde comme mesure de l'efficacité de transduction.

12. Analyse des données

  1. Sélectionnez les paramètres appropriés en ajustant les filtres et les masques afin de sélectionner les cellules sur l'image et non le bruit de fond.
  2. Sélectionnez une image représentative pour entraîner le logiciel.
  3. Appliquez les paramètres optimisés à toutes les images de l'étude.
  4. Extrayez les données soit sous forme de valeurs individuelles, soit regroupées, puis transférez-les vers un système d'analyse statistique pour une présentation ultérieure des données.

13. Calcul du temps de début

  1. Calculer le temps nécessaire pour détecter le premier signal GFP par MOI.
  2. Réaliser une interpolation à la moyenne des puits non traités (MOI = 0) + 3 écarts-types (ET).
  3. Copier l'intensité de fluorescence verte de chaque sphéroïde à chaque point temporel depuis le logiciel d'imagerie en temps réel vers un logiciel statistique.
  4. Faire la moyenne des réplicats.
  5. Calculer les signaux moyens et les ET de tous les puits contenant des sphéroïdes non traités (MOI = 0).
  6. Utiliser un ajustement de courbe sigmoïde asymétrique à cinq paramètres (5PL) pour interpoler le temps d'apparition pour chaque MOI.
  7. Par exemple, les valeurs d'interpolation suivantes ont été utilisées dans Tableau 1 :
    1. Pour scGFP : 254 955 (moyenne) + 3 × 288 055 (ET) = 1 412 120 (signal d'interpolation)
    2. Pour ssGFP : 2 417 941 (moyenne) + 3 × 26 093  (ET) =  3 200 746 (signal d'interpolation)

14. Mesurer la fluorescence à l'aide d'un lecteur de plaques doté de capacités de fluorescence.

  1. Lancer le logiciel du lecteur de plaques à fluorescence sur l'ordinateur connecté au lecteur de plaques.
  2. Naviguer à Fichier > Ouvrir Protocole et choix du type de plaque (par exemple, 96 puits, 384 puits) et vérification de la sélection du bon agencement des puits. 
  3. Régler le temps d'intégration pour la détection de la fluorescence, qui détermine la durée pendant laquelle le lecteur collecte la fluorescence de chaque puits.
  4. Ajuster aucun gain ou sensibilité paramètres
    si le essai nécessite plus élevé ou inférieur signal détection
  5. Régler les paramètres de fluorescence pour la GFP comme suit : excitation : 485 nm et émission : 528 nm.
  6. Cliquez sur Exécuter dans le logiciel pour démarrer la mesure.
  7. Mesurer fluorescence de chaque bien.
    REMARQUE - Après l'analyse, le logiciel affiche les valeurs brutes de fluorescence, qui peuvent être utilisées pour générer des graphiques en calculant les moyennes et en soustrayant le fond.
  8. Exporter résultats dans le préféré format pour en outre analyse ou rapport.
    REMARQUE : Si le protocole échantillon a été modifié, utilisez Fichier > Enregistrer sous pour créer une version unique, en préservant l'original pour une utilisation future.

15. Transduction du transgène luminescent

  1. Suivre le protocole de semis et d'administration d'AAV décrit ci-dessus.
  2. Ajouter 100 µL d'AAV1, d'AAV2, d'AAV5, d'AAV8 et d'AAV9 portant un transgène de nano-luciférase avec des MOI différents allant de 0 à 106 à 100 µL de sphéroïdes de HeLa déjà cultivés dans des plaques ULA.
  3. Incuber les plaques dans une étuve standard à 37 °C et évaluer l'efficacité de la transduction après 3 jours de transduction.

16. Préparer l'inhibiteur de la luminescence extracellulaire et le substrat de luminescence pour la détection dans un dosage sur cellules vivantes

  1. Retirer les plaques de dosage de l’incubateur au jour 3 (point final).
  2. Ajouter directement aux cellules l'inhibiteur de la luminescence extracellulaire et le substrat.
    NOTE : Aucune élimination du milieu n'est nécessaire.
  3. Sortir l'inhibiteur extracellulaire du stockage à −20 °C et le laisser décongeler à température ambiante.
  4. Centrifuger brièvement pour récupérer le liquide provenant du bouchon et des parois du tube.
  5. Préparer la quantité souhaitée d'inhibiteur de luminescence extracellulaire reconstitué à 15X en mélangeant 1 volume d'inhibiteur extracellulaire avec 14 volumes de milieu DMEM complet.
    1. Par exemple, si l'expérience nécessite 1,0 mL de réactif, ajouter 67 µL d'inhibiteur à 933 µL de DMEM. Pour 1 plaque, préparer 1 mL de DMEM et ajouter 67 µL d'inhibiteur.
  6. Transférer l'inhibiteur préparé à l'étape 16.5 dans un réservoir stérile pour réactif.
  7. Utiliser une pipette multicanal pour distribuer 10 µL d'inhibiteur dans les puits transduits avec l'AAV.
  8. Sortir le substrat pour cellules vivantes du stockage à −20 °C et mélanger.
  9. Centrifuger brièvement pour récupérer le liquide provenant du bouchon et des parois du tube.
  10. Préparer la quantité souhaitée de réactif pour cellules vivantes reconstitué à 3,6X.
  11. Préparer 4 mL de DMEM et ajouter 144 µL de substrat pour 1 plaque.
  12. Transférer le substrat préparé à l'étape 16.11 dans un réservoir stérile pour réactif.
  13. Utiliser une pipette multicanal pour distribuer 50 µL de substrat dans les mêmes puits transduits avec l'AAV.
    NOTE : Le volume des réactifs devra peut-être être ajusté si plusieurs plaques de dosage sont utilisées simultanément.
  14. Agiter la plaque à 300 tr/min pendant 5 min à température ambiante.
  15. Lire la plaque à l’aide d’un instrument d’imagerie in vivo dans les 2 h suivant l’ajout des réactifs de détection de la luminescence.
    NOTE : L’intensité de la luminescence diminuera progressivement au cours des 2 heures.

17. Imagerie par bioluminescence

  1. Allumez le système d'imagerie bioluminescente au moins 30 min avant l'acquisition afin de permettre au refroidissement de la caméra CCD (−90 °C).
  2. Vérifiez que les plaques sont prêtes pour l'imagerie (par exemple, ajout du substrat pour l'imagerie en cellules vivantes destiné à la détection bioluminescente).
  3. Retirez le couvercle de la plaque pour éviter les réflexions et la diffusion de la lumière.
  4. Nettoyez le fond de la plaque si l'imagerie est effectuée par en dessous.
  5. Placez la plaque dans la chambre d'imagerie sur la platine.
  6. Positionnez la plaque centrée sous la caméra.
  7. Réglez les paramètres d'imagerie pour la luminescence : exposition automatique ou réglez le temps d'exposition (généralement 1–60 s), le binning (moyen recommandé), le nombre f (1 pour une sensibilité maximale).
  8. Prenez une photographie pour référence anatomique.
  9. Acquérez l'image luminescente.

18. Analyse des données d'imagerie par bioluminescence

  1. Utilisez les outils de région d'intérêt (ROI) pour délimiter les puits ou les zones d'intérêt.
  2. Veillez à maintenir une taille de ROI cohérente entre les échantillons pour permettre la comparaison.
  3. Mesurez le flux total (photons/seconde) pour la bioluminescence.
  4. Mesurez l'efficacité rayonnante.
  5. Exportez les données vers un tableur pour analyse statistique.
  6. Enregistrez les fichiers d'image et les résultats d'analyse.
  7. Exportez les images au format TIFF ou JPEG pour les présentations.

Résultats

Ici, nous montrons que les sphéroïdes tridimensionnels peuvent être utilisés comme outil pour évaluer la transduction par les AAV, distinguer les conceptions de génomes viraux telles que les formes auto-complémentaires (sc) et simples brins (ss), et analyser la cinétique de transduction. Un aperçu du processus est présenté dans la Figure 1. Brèvement, les cellules sont d'abord amplifiées en culture bidimensionnelle puis ensemencées dans des plaques à adhérence ultra-faible (ULA) afin de former des sphéroïdes compacts (Figure 1A). Ensuite, les plaques sont centrifugées pour favoriser l'agrégation (Figure 1B) et transférées vers un système d'imagerie de cellules vivantes afin de surveiller en temps réel la formation des sphéroïdes (Figure 1C). Au jour 3, les sphéroïdes sont transduits par l'AAV à différents MOI (Figure 1D). La cinétique de transduction est suivie longitudinalement par imagerie de cellules vivantes (Figure 1E), et une analyse en point final est réalisée à l'aide de lectures de fluorescence ou de luminescence basées sur des plaques (Figure 1F).

Figure 2 montre la morphologie de sphéroïdes provenant de 6 lignées cellulaires différentes, illustrant une variété de densités, de degrés de circularité et de formes. Toutes les lignées cellulaires ont été cultivées dans un milieu DMEM complet pendant plusieurs passages avant d'être utilisées dans une expérience. Une fois les cellules en phase logarithmique, les cellules HEP3B, HEK293T, A375, HeLa, HEPG2 et Huh7 ont été récoltées et diluées en série dans des plaques à fond rond ULA, en partant d'une densité cellulaire de 10 000 cellules par puits, puis diluées par deux (la disposition de la plaque est indiquée dans la Figure supplémentaire 1  et des résultats représentatifs sont présentés dans la Figure supplémentaire 2). La taille des sphéroïdes peut être aussi petite que 50 µm tout en conservant une structure de sphéroïde et une bonne susceptibilité à la transduction. Après la mise en culture des cellules, la plaque ULA à fond rond a été centrifugée à 350 × g. pendant 5 min, ce qui permet aux cellules de se regrouper au centre du puits et de s'auto-assembler en sphéroïdes. Cette étape est particulièrement bénéfique pour les cellules qui n'ont pas naturellement tendance à s'agréger. La durée de centrifugation peut être prolongée de 5 à 15 min pour les cellules très résistantes, comme les lymphocytes. Les sphéroïdes bien formés présentent un phénotype rond et compact, tel qu'observé dans les cellules HEK293T et Huh7, tandis que les sphéroïdes mal formés sont faiblement agrégés et sujets à la désintégration lors des changements de milieu.

Ensuite, la plaque est transférée dans un incubateur à 37 °C équipé d'un instrument de suivi en temps réel des cellules vivantes. Les plaques sont surveillées quotidiennement par intervalles de 6 h afin d'évaluer la formation des sphéroïdes pour chacune des lignées cellulaires décrites ici. La plupart des lignées cellulaires nécessitent 3 jours pour s'auto-assembler en sphéroïdes. Comme illustré dans la Figure 2, chaque lignée cellulaire présentait des caractéristiques morphologiques distinctes et des degrés variables de compaction après 3 jours de semis. Les lignées hépatiques (Huh7, HEPG2 et HEP3B) formaient des sphéroïdes plus compacts et denses que les autres lignées cellulaires. La lignée HEK293T formait une structure sphérique très ronde avec un noyau nécrotique bien défini, tandis que la lignée A375 formait un agrégat cellulaire de forme irrégulière (décrit précédemment comme un sphéroïde déformé)18,19. Ces différences morphologiques sont considérées comme des indicateurs des états physiopathologiques des maladies, ce qui renforce davantage l'utilité des modèles tridimensionnels par rapport aux systèmes de culture bidimensionnels18,19. Le protocole d'assemblage des sphéroïdes est hautement reproductible sur les six lignées cellulaires testées et a été appliqué à toutes les transductions présentées ici.

Après avoir optimisé la concentration cellulaire, la durée de formation des sphéroïdes et le niveau de fluorescence autofluorescente verte/rouge (présenté dans la figure supplémentaire 3), nous avons procédé à tester la transduction par AAV dans les sphéroïdes à l’aide d’un système d’imagerie en temps réel sur cellules vivantes et d’un lecteur de plaques (un exemple de disposition de la plaque pour la titration d’AAV est illustré dans la figure supplémentaire 4). La figure 3 présente le protocole optimisé de formation des sphéroïdes appliqué à quatre lignées cellulaires différentes (HEK293T, Huh7, HEP3B et HEPG2). Au troisième jour de formation des sphéroïdes, ceux-ci ont été transduits avec deux vecteurs AAV2 portant des conceptions distinctes de génomes viraux, marqués par la GFP, à diverses multiplicités d’infection (MOI). Ces deux conceptions de transgènes AAV représentent des variants GFP à haute puissance (scGFP) et à faible puissance (ssGFP). Une fois la transduction réalisée, les plaques ont été placées dans un système d’imagerie sur cellules vivantes afin de surveiller en temps réel la transduction par AAV. Au point temporel de 72 heures, l’intensité de fluorescence verte a été mesurée à l’aide d’un logiciel d’imagerie sur cellules vivantes. Dans la figure 3, les lignes bleues représentent les génomes sc-GFP, tandis que les lignes rouges représentent les génomes ss-GFP. Les sphéroïdes se sont révélés très sensibles à la transduction par AAV, avec une transduction forte détectée à des titres très faibles d’AAV et dans différentes lignées cellulaires pour le scGFP. Des vidéos représentatives de la transduction par AAV dans diverses lignées cellulaires et à différentes MOI, capturées en temps réel, sont présentées dans les vidéos supplémentaires 1, 2, 3, 4, 5 et 6. En revanche, la transduction des sphéroïdes par l’AAV ssGFP a été observée à des niveaux plus faibles, ce qui reflète la transduction plus faible et plus lente attendue pour ce type d’élément régulateur20,21. Ceci démontre l’utilité des sphéroïdes en 3D pour étudier des transductions AAV fortes et faibles, ainsi que pour discriminer entre des gènes fortement transduits, comme le sc-GFP, et des gènes moins puissants, comme le ss-GFP. Nous avons observé une différence de 100 fois dans la fluorescence relative entre les transgènes sc et ss à une MOI de 106 dans les cellules HEK293T, et une différence de 3 fois dans des lignées cellulaires plus difficiles à transduire, comme HEP3B.

Nous avons ensuite procédé à l'évaluation de la transduction par les AAV de divers sérotypes de manière dépendante de la dose, à la fois dans des sphéroïdes HEK293T et dans des sphéroïdes Huh7. Comme illustré dans la Figure 4, les sphéroïdes tridimensionnels se sont révélés perméables à la transduction par AAV-scGFP de quatre sérotypes différents. Après 72 heures de transduction, le scGFP a été mesuré à l’aide d’un lecteur de plaques à fluorescence (Figure 4A,B) et d’un logiciel d’imagerie en temps réel sur cellules vivantes (Figure 4C,D). Les quatre sérotypes ont été correctement détectés à l’aide de ces deux instruments. Le système d’imagerie sur cellules vivantes a montré une gamme plus étendue entre le signal et le bruit par rapport au lecteur de plaques à fluorescence, bien que le signal normalisé n’ait pas révélé de différences significatives. Nous avons observé que l’AAV2 présentait l’efficacité de transduction la plus élevée dans les deux lignées cellulaires, suivi par l’AAV1, tandis que l’AAV5 et l’AAV9 montraient une transduction significativement plus faible.

Ensuite, nous avons évalué la transduction par luminescence en utilisant le protocole de sphéroïdes. Pour ce faire, des cellules HeLa ont été cultivées sous forme de sphéroïdes tridimensionnels selon le protocole optimisé décrit ici. Au jour 3, les sphéroïdes de cellules HeLa ont été transduits avec 5 sérotypes différents d'AAV exprimant un gène rapporteur de nano-luciférase. Après 72 heures de transduction par l'AAV, les cellules ont été traitées avec un substrat pour cellules vivantes et incubées pendant 5 minutes à température ambiante. Ensuite, la luminescence a été mesurée et visualisée à l’aide d’un système d’imagerie bioluminescente (Figure 5A). Une transduction efficace a été observée pour tous les sérotypes d'AAV à l’aide de ce système. Une discrimination sensible entre l’efficacité de transduction des différents sérotypes d'AAV a été obtenue, indiquant que le protocole n’est pas limité aux détections par fluorescence. Conformément aux tendances observées dans Figure 5, la transduction par AAV-nano-luciférase dans les cellules HeLa a montré que l’AAV2 est le sérotype le plus puissant, comme cela avait été observé avec les vecteurs AAV-GFP. De même, la plus faible efficacité de transduction a été observée pour le sérotype AAV9, comme le montrent les vecteurs fluorescents et luminescents (Figure 4 et 5). Une image représentative de la transduction par AAV-nano-luciférase est présentée dans Figure 5B.

Outre l'intensité de la transduction, les protocoles de sphéroïdes en 3D permettent une surveillance cinétique de la transduction. Figure 6 présente des résultats représentatifs des cinétiques de transduction de sphéroïdes 3D HEK293T par AAV2-scGFP et AAV2-ssGFP, lorsqu'ils sont transduits à différents MOI (0-106) (Figure 6A-G). Nous avons constaté que la transduction par AAV2-scGFP est détectable à des MOI aussi faibles que 101, avec une augmentation du signal GFP détectable environ 34 h après traitement par rapport aux cellules non traitées, à l'aide d'un système d'imagerie de cellules vivantes. Le signal AAV2-ssGFP est nettement plus faible et plus lent que le signal AAV2-scGFP. Afin de comparer davantage la vitesse de transduction, nous avons calculé le moment d'apparition, c'est-à-dire le temps auquel le signal GFP devient détectable. Nous avons observé que scGFP transduit les cellules en moyenne 4 fois plus rapidement que ssGFP. Les temps d'apparition individuels sont indiqués dans Tableau 1. Ces mesures cinétiques révèlent un aspect supplémentaire de l'efficacité de la transduction, utile pour l'optimisation des tests.

Schéma du flux de travail en culture cellulaire : formation de sphéroïdes, transduction et analyse à l'aide d'IncuCyte.
Figure 1 : Aperçu des transductions par AAV utilisant des cultures 3D. (A) Les cellules sont amplifiées en culture 2D puis ensemencées dans des plaques à adhérence ultra-faible (ULA) pour former des sphéroïdes. (B) Les plaques sont centrifugées pour favoriser l'agrégation, puis transférées vers un (C) système IncuCyte S3 afin de surveiller en temps réel la formation des sphéroïdes. (D) Au jour 3, les sphéroïdes sont transduits par l'AAV à différents MOI. (E) La cinétique de transduction est suivie longitudinalement par imagerie de cellules vivantes, et (F) une analyse en point final peut être réalisée à l'aide de lectures de fluorescence ou de luminiscence en plaque. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure. 

Comparaison de sphéroïdes en culture cellulaire ; image de microscopie de six lignées cellulaires différentes dans le dispositif expérimental.
Figure 2 : Caractérisation morphologique des sphéroïdes chez plusieurs lignées cellulaires. Des images représentatives de sphéroïdes obtenus à partir des cellules HEP3B, HEK293T, A375, HeLa, HEPG2 et Huh7 montrent une variabilité en taille, morphologie et compacité, tout en présentant une forte reproductibilité entre réplicats (échelle, 50 µm). Toutes les lignées cellulaires ont été ensemencées à raison de 1 x 104 cellules/puits pendant 3 jours. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Analyse de l'expression génique dans les cellules marquées au GFP ; relation entre le MOI et la fluorescence, plusieurs lignées cellulaires, graphique, images.
Figure 3 : Comparaison de l'efficacité de transduction des AAV entre des vecteurs auto-complémentaires (scGFP) et simples brins (ssGFP) dans différentes lignées cellulaires. Des sphéroïdes tridimensionnels de (A) HEK293T, (B) Huh7, (C) HEP3B et (D) HEPG2 ont été auto-assemblés puis transduits avec différents MOI d'AAV2-scGFP (en bleu) et d'AAV2-ssGFP (en rouge). L'intensité totale de fluorescence verte a été quantifiée 72 heures après la transduction. Images représentatives de sphéroïdes traités au MOI le plus élevé pour chaque AAV, acquises après 72 heures à l’aide d’un système d’imagerie en temps réel sur cellules vivantes. Les barres d'échelle correspondent à 200 µm. Les barres d'erreur indiquent l'écart type (SD). Veuillez cliquer ici pour consulter une version agrandie de cette figure.

Graphiques d'intensité de fluorescence pour les sérotypes d'AAV dans les cellules HEK293T et Huh7 ; MOI, variable temporelle.
Figure 4 : La transduction par l'AAV dans des sphéroïdes en 3D permet de distinguer l'activité de différents sérotypes d'AAV. Des sphéroïdes en 3D provenant des cellules (A,C) HEK293T et (B,D) Huh7 ont été transduits avec les AAV1, AAV2, AAV5 et AAV9 portant le transgène scGFP, à différents MOI. L'intensité de fluorescence a été mesurée après 72 h à l'aide d'un lecteur de plaques à fluorescence (A,B) et d'un système d'imagerie en temps réel sur cellules vivantes (C,D). Les barres d'erreur représentent l'écart type (SD). Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Graphique de l'efficacité de transduction des AAV et carte thermique ; MOI contre flux total ; analyse du vecteur viral.
Figure 5 : Transduction des AAV dans des sphéroïdes tridimensionnels portant des capteurs luminescents. Des sphéroïdes de cellules HeLa ont été transduits avec des AAV1, AAV2, AAV5, AAV8 et AAV9 exprimant un transgène rapporteur nanoluciférase à des MOI croissants. La luminescence a été visualisée et mesurée à l’aide d’un dosage en point final réalisé avec le système d’imagerie de luminescence 72 h après la transduction. (A) Valeurs du flux total. (B) Exemple représentatif de lecture en point final à partir d’images de luminescence de plaques de sphéroïdes, montrant la distribution du signal selon les MOI et les sérotypes. Chaque vecteur AAV a été testé en deux réplicats horizontaux. Les barres d’erreur représentent l’écart type (SD). Veuillez cliquer ici pour consulter une version agrandie de cette figure.

Analyse de l'expression génique ; graphiques MOI en fonction du temps ; intensité de fluorescence de sgGFP ; résultats expérimentaux.
Figure 6 : Évaluation de la cinétique de transduction dans des sphéroïdes en 3D. Des sphéroïdes HEK293T ont été transduits avec AAV2-scGFP (bleu) et AAV2-ssGFP (rouge) selon une gamme de 7 MOI (A–G). L'intensité verte totale a été mesurée sur une période de 72 h, avec des intervalles de 6 h, à l'aide du système de suivi de la formation/croissance des sphéroïdes. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

MOIscGFP (h)ssGFP (h)
1>72 h>72
1034,2>72
10016,554,2
10005,623,1
100003,313
1000001,98

Tableau 1 : Temps d'apparition de la détection de la GFP.

Figure supplémentaire 1 : Disposition des puits pour la titration des sphéroïdes. (A) Exemple de disposition des puits illustrant le schéma de dilution pour les sphéroïdes HEK293T, Huh7, HEP3B et HEPG2, obtenus à partir de densités initiales de semis variant de 10 000 à 78 cellules. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : Formation de sphéroïdes selon différentes densités d'ensemencement. Images microscopiques représentatives de sphéroïdes d'HEK293T et de Huh7 obtenus à partir de densités initiales d'ensemencement variant de 10 000 à 78 cellules au jour 3. L'échelle indique 50 µm.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 3 : Informations sur les lignées cellulaires pour la formation de sphéroïdes en 3D.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 4 : Agencement des puits pour les dilutions sérielles d'AAV. (A) Agencement représentatif des puits illustrant le schéma de dilution sérielle d'AAV utilisé pour les AAV1, AAV2, AAV5 et AAV9, en partant d'un MOI de 106. Le témoin négatif, situé à la ligne H, représente les sphéroïdes non traités.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Film supplémentaire 1 : Imagerie en temps réel de cellules vivantes montrant la transduction par AAV2-scGFP dans des sphéroïdes HEK293T à un MOI de 106.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Film supplémentaire 2 : Imagerie en temps réel de cellules vivantes montrant la transduction par AAV2-scGFP dans des sphéroïdes Huh7 à un MOI de 106.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Film supplémentaire 3 : Imagerie en temps réel de cellules vivantes montrant la transduction par AAV2-scGFP dans des sphéroïdes HEP3B à un MOI de 106.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Film supplémentaire 4 : Imagerie en temps réel de cellules vivantes montrant la transduction par AAV2-scGFP dans des sphéroïdes HEK293T à un MOI de 106, dans le cadre d'une étude de dépendance à la dose.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Film supplémentaire 5 : Imagerie en temps réel de cellules vivantes montrant la transduction par AAV2-scGFP dans des sphéroïdes HEK293T à un MOI de 104.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Film supplémentaire 6 : Imagerie en temps réel de cellules vivantes montrant la transduction par AAV2-scGFP dans des sphéroïdes HEK293T à un MOI de 101.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 1 : Calcul du MOI nécessaire pour la transduction par AAV.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Nous présentons ici une plateforme 3D in vitro  simplifiée pour le développement et le test de l'efficacité des AAV. Cette plateforme exploite une transduction améliorée, une haute sensibilité et une meilleure prévisibilité translationnelle grâce à une culture cellulaire tridimensionnelle qui reproduit plus fidèlement l'architecture des tissus humains. Ce système parvient à distinguer avec succès l'efficacité de transduction entre différents sérotypes d'AAV et différents éléments régulateurs, y compris les vecteurs simples brins et auto-complémentaires, dans plusieurs lignées cellulaires. Nous notons que, contrairement aux essais conventionnels en 2D, où l'efficacité de transduction est souvent définie comme le pourcentage de cellules positives pour le transgène, le système de sphéroïdes en 3D ne permet pas facilement une quantification à la résolution monocellulaire. Par conséquent, l'efficacité de transduction dans cette étude est définie comme l'intensité globale du signal rapporteur (fluorescent ou luminescent), reflétant la contribution combinée de la proportion de cellules transduites et du niveau d'expression du transgène par cellule. La grande sensibilité des sphéroïdes réduit considérablement le besoin de grandes quantités de produit, ce qui rend la méthode rentable, polyvalente et physiologiquement pertinente pour la recherche et le développement d'AAV.

Cette approche répond aux principaux défis posés par les essais classiques de culture cellulaire en 2D, qui reposent sur l'adhésion à des surfaces artificielles et manquent d'organisation cellulaire, ce qui pourrait entraîner de mauvaises prévisions du rendement des vecteurs dans des contextes cliniques. Le système de sphéroïdes en 3D imite mieux la structure tissulaire et les profils de distribution des médicaments, fournissant des données sur le comportement des vecteurs qui correspondent plus étroitement aux conditions biologiques réelles22,23. Le protocole utilise des plaques simples à adhérence ultra-faible, ce qui le rend facilement reproductible dans des conditions de laboratoire standard.

Ce système adaptable pourrait être utilisé pour des dosages de neutralisation des AAV, pour étudier la pénétration des AAV, et pour développer des expériences de co-culture plus complexes afin d'analyser les effets de différents environnements cellulaires sur la transduction par les AAV. De plus, des plates-formes de criblage à haut débit de médicaments et de vecteurs peuvent facilement être intégrées à la plateforme de sphéroïdes, permettant l'automatisation et la réduction des coûts dans les flux de travail de découverte de vecteurs pour le développement de produits plus ciblés.

Un avantage pratique majeur des sphéroïdes est leur capacité à croître de manière continue pendant des semaines sans passage cellulaire, permettant des études prolongées de l'activité des AAV. Ce système de culture stable préserve d'importantes interactions entre cellules et des composants de la matrice, évitant les interruptions dues aux prélèvements cellulaires répétés nécessaires dans les cultures en 2D24. L'environnement cellulaire préservé soutient une organisation naturelle des protéines et des structures membranaires essentielles à l'évaluation de la liaison et de l'entrée des AAV dans les cellules25.

Bien que les sphéroïdes tridimensionnels présentent un grand potentiel pour l'évaluation de la transduction par les AAV, ils présentent également certaines limites translationnelles par rapport aux modèles in vivo , principalement en raison de leur structure simplifiée par rapport aux tissus natifs. Les sphéroïdes manquent de composants physiologiques essentiels, notamment une vascularisation pour la délivrance du vecteur, des cellules immunitaires permettant d'évaluer l'immunogénicité, et des barrières tissulaires spécifiques telles que la barrière hémato-encéphalique, qui pourraient avoir un impact significatif sur les performances des AAV26. Ces limitations indiquent que, malgré leur niveau de complexité intermédiaire entre les cultures conventionnelles en 2D et les modèles animaux in vivo, les sphéroïdes restent insuffisants pour recréer complètement le microenvironnement physiologique nécessaire à une évaluation exhaustive des AAV.

Le protocole de sphéroïdes présenté ici décrit un seul type cellulaire à la fois. Ce protocole peut être développé pour inclure 2 à 3 types cellulaires supplémentaires qui s'agrègent en une structure tridimensionnelle de base. Des modèles 3D plus complexes, tels que les organoïdes ou les systèmes de microfluidique, sont des systèmes multicellulaires qui reproduisent la diversité cellulaire et l'organisation d'organes spécifiques, contenant 10 types cellulaires distincts ou plus disposés selon des motifs semblables à ceux des tissus. De tels organoïdes 3D avancés peuvent inclure plusieurs cellules27, des cultures encapsulées dans des hydrogels, des techniques en goutte pendante et des plateformes de microfluidique11,27,28. Bien que ces méthodes offrent une architecture tissulaire plus complexe pouvant contribuer à approfondir notre compréhension de la biologie des AAV, elles nécessitent généralement des réactifs et un équipement spécialisés, ainsi qu'une expertise technique considérable. En revanche, les sphéroïdes 3D formés dans des plaques à adhérence ultra-basse sont nettement plus simples et conviennent à de nombreux laboratoires en raison de leur faible coût et de leur reproductibilité.

Les étapes critiques pour la mise en œuvre réussie de ce protocole incluent le maintien d'une viabilité cellulaire élevée, car les cellules altérées peuvent compromettre la formation des sphéroïdes et l'efficacité de la transduction. L'utilisation de plaques à adhérence ultra-basse et l'optimisation de la centrifugation sont également essentielles pour obtenir une compacité adéquate des sphéroïdes. L'optimisation du MOI pour chaque type cellulaire et sérotype d'AAV est indispensable afin d'éviter des signaux faibles ou une saturation. Le choix de la méthode de détection appropriée est également crucial, en particulier pour les analyses cinétiques, où une compatibilité avec les systèmes d'imagerie en temps réel continue des cellules vivantes est requise. Plusieurs considérations techniques sont importantes pour une interprétation précise de la transduction par l'AAV dans les sphéroïdes tridimensionnels.

Un signal de transduction faible ou absent peut résulter d'un faible titre viral, d'un MOI sous-optimal ou d'un temps d'incubation insuffisant ; cela peut être corrigé en vérifiant les titres viraux, en optimisant le MOI et en prolongeant le temps d'incubation (généralement 3 à 5 jours). Des signaux de fluorescence ou de luminescence faibles peuvent refléter une faible expression du transgène ou une pénétration limitée des réactifs au sein de la structure tridimensionnelle, ce qui peut être amélioré en optimisant les paramètres d'exposition ou en accordant davantage de temps à la diffusion du substrat. Un défi majeur dans certaines lignées cellulaires, comme les cellules HeLa, est l'autofluorescence, qui peut entraîner un signal de fond élevé et une sensibilité réduite dans les tests basés sur la fluorescence. Pour pallier cette limitation, nous avons mis en œuvre un système de rapporteur nanoluciférase basé sur la luminescence, qui offre un meilleur rapport signal sur bruit et permet une détection plus précise de la transduction dans des fonds autofluorescents. En outre, le signal de fond peut provenir d'un seuil mal défini ou d'une fluorescence liée au milieu, et doit être contrôlé à l'aide de puits non traités (MOI = 0) afin de définir les niveaux de base. Enfin, une saturation du signal à des MOI élevés peut survenir en raison d'une quantité excessive de virus ou de limitations du détecteur ; cela peut être atténué en réduisant la gamme de MOI et en optimisant les paramètres d'exposition du détecteur pour maintenir les mesures dans la plage dynamique linéaire.

Dans l'ensemble, cette méthodologie de sphéroïdes en 3D fournit un système rationalisé et reproductible pour évaluer la transduction, la puissance et la cinétique des AAV. En comblant l'écart entre les essais conventionnels en 2D et les études in vivo, elle permet un développement plus éclairé des vecteurs et soutient l'avancement de stratégies de thérapie génique pertinentes sur le plan clinique.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs remercient Morten Seirup et Trish Hoang pour avoir fourni le plasmide destiné à la production de nanoluciférase AAV ainsi que les réactifs substrat vivants. Ce projet a bénéficié du soutien d'un poste dans le programme de participation à la recherche ORISE au CBER, U.S. Food and Drug Administration, géré par l'Institut Oak Ridge pour les sciences et l'éducation dans le cadre d'un accord interagences entre le ministère américain de l'Énergie et la FDA.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Incubateur à 37 °CThermoFisher Scientific#51025983Conditions standard de culture
Cellules A375ATCCCRL-1619Ligne cellulaire
Plasmide AAV1Addgene112862Plasmide AAV
Plasmide AAV2Addgene104963Plasmide AAV
Plasmide AAV5Addgene104964Plasmide AAV
Plasmide AAV8Addgene112864Plasmide AAV
Plasmide AAV9Addgene112865Plasmide AAV
Lecteur de plaques BioTek GEN5Agilent TechnologiesNALecture finale de fluorescence ou de luminescence
CentrifugeuseThermoFisher Scientific#TSO-MX1RMaintien de la suspension des sphéroïdes
Phosphate Buffered Saline (PBS) pour culture cellulaire Corning™ (1X)Fisher Scientific#MT21040CMXPBS pour rincer les cellules
DMEM à forte teneur en glucose, supplément GlutaMAX, pyruvateThermoFisher Scientific#10569010Milieu de croissance complet
Inhibiteur extracellulaire NanoLuc PromegaN235BÉteint tout signal NanoLuc® provenant de l’environnement extracellulaire  
Sérum de veau fœtal (FBS)Sigma-Aldrich#F4135-500mLFournit des facteurs de croissance
Cellules HEK293TATCCCRL-3216Ligne cellulaire
Cellules HeLaATCCCRM-CCL-2Ligne cellulaire
Cellules HEP3BATCCHB-8064Ligne cellulaire
Cellules HEPG2ATCCHB-8065Ligne cellulaire
Cellules Huh7ABMT8973Ligne cellulaire
Microscope inversé IncuCyte S3SartoriusNASurveillance de la formation et de la croissance des sphéroïdes
Imager IVIS SpectrumSpectralinvivoNALecture finale de la luminescence
Kit d’essai Nano-Glo® pour cellules vivantes PromegaN2013Réactif substrat luminescent pour la détection en cellules vivantes
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)ThermoFisher Scientific# 15140122Prévention de la contamination bactérienne
Flacons de culture tissulaire T75 avec ventilationFisher Scientific#NC0509296 Flacons pour la culture cellulaire
Trypsine-EDTA (0,05 %)ThermoFisher Scientific#25300120Détachement enzymatique des cellules
Plaques à adhérence ultra-faibleCorning#7007Prévention de l’adhérence cellulaire pour favoriser la formation de sphéroïdes

Références

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