Isolement et caractérisation de petites vésicules extracellulaires à partir de coussinets adipeux infrapatellaires chez les patients atteints d’arthrose

Summary

RÉSUMÉ Ce protocole présente un flux de travail standardisé pour isoler et caractériser les petites vésicules extracellulaires (sEV) à partir des tissus du coussinet adipeux infrapatellaire des patients atteints d’arthrose.

Abstract

Les vésicules extracellulaires (EV), en particulier les petites vésicules extracellulaires (sEV) définies comme des vésicules de moins de 200 nm, servent de médiateurs essentiels de la communication intercellulaire et sont libérées par presque tous les types cellulaires dans divers fluides biologiques. Le coussin adipeux infrarotulaire (IPFP) est étroitement associé au développement et à la progression de l’arthrose du genou (OA). Cependant, les méthodes standardisées pour isoler directement les sEVs à partir des explants IPFP restent limitées. Nous présentons un protocole reproductible pour l’isolement et la caractérisation des sEVs dérivés de tissus IPFP obtenus sur des patients atteints d’arthrose. Le milieu conditionné prélevé à partir de cultures tissulaires IPFP est séquentiellement éliminé des cellules et des débris par centrifugation à basse vitesse, suivie d’une ultracentrifugation pour enrichir les vésicules dans la plage de taille du sEV. Les vésicules résultantes sont caractérisées selon des informations minimales pour des études sur les recommandations de vésicules extracellulaires (MISEV2023) à l’aide d’un ensemble de marqueurs protéiques représentatifs dans différentes catégories fonctionnelles : CD63 en tant que tétrasspanine associée à la membrane, ALIX et TSG101 comme protéines cytosoliques impliquées dans la biogenèse médiée par la machinerie Endosomal Sorting Complex Required for Transport (ESCRT), et Calnexin comme protéine résidente dans le réticule endoplasmique pour surveiller le potentiel Contamination non vésiculaire. Ce flux de travail permet de préparer des sEV bien définis, adaptés à des applications en aval telles que les essais fonctionnels ou le profilage protéomique dans la recherche sur l’arthrose.

Introduction

Les petites vésicules extracellulaires (sEV) sont un sous-type hétérogène de vésicules extracellulaires qui, selon la classification opérationnelle proposée par la Société internationale des vésicules extracellulaires (ISEV) dans les lignes directrices des informations minimales pour les études sur les vésicules extracellulaires (MISEV2023), sont définies comme des vésicules généralement inférieures à 200 nm de^{diamètre 1}. Les sEVs sont libérées par pratiquement tous les types cellulaires dans des fluides biologiques et ont attiré une attention croissante en raison de leur rôle essentiel en tant que médiateurs de la communication intercellulaire, tant dans des contextes physiologiques que pathologiques ^2,3.

La membrane des sEVs est enrichie de multiples protéines fonctionnelles. Parmi eux, les tétraspanines telles que CD63 sont associées à l’organisation de la membrane vésiculaire et à la^{fusion 4}. De plus, les protéines cytosoliques associées au complexe de tri endosomal nécessaire au transport (ESCRT), telles qu’ALIX et TSG101, sont essentielles à la biogenèse et à la sécrétion du sEV. Par conséquent, elles servent de marqueurs fiables pour confirmer l’origine endosomale des vésicules^{isolées 5,6}.

Le coussin adipeux infrarotulaire (IPFP) a été reconnu comme un tissu actif associé à l’articulation, étroitement lié à l’initiation et à la progression de l’arthrose (OA^)7,8. Dans des conditions inflammatoires et dégénératives, les sEVs dérivés de l’IPFP sont hypothétisés comme transportant des médiateurs inflammatoires et des signaux pathogènes, contribuant ainsi à l’inflammation synoviale et à la dégradation^{du cartilage 9}. La caractérisation des sEV libérés par les tissus IPFP des patients atteints d’arthrose peut donc fournir des informations cruciales sur les réseaux de communication intercellulaires associés à la maladie.

Compte tenu de l’intérêt croissant pour les sEV comme médiateurs moléculaires et agents thérapeutiques potentiels, l’établissement d’une approche d’isolation à haut rendement, haute pureté et reproductible est essentielle. Bien que l’ultracentrifugation différentielle reste l’une des stratégies de purification les plus largement^{utilisées 10}, les protocoles optimisés pour les surnadants en culture cellulaire ou les biofluides peuvent ne pas être directement applicables aux tissus solides dérivés de l’adip tels que l’IPFP. La forte teneur en lipides, la matrice extracellulaire dense et les conditions digestives enzymatiques variables peuvent influencer la récupération et la pureté des vésicules.

La culture d’explant tissulaire offre une approche physiologiquement pertinente qui préserve l’architecture cellulaire native et les interactions cellule-cellule tout en minimisant les perturbations enzymatiques excessives, permettant ainsi la collecte des sEVs libérées dans des conditions proches de la nature. Cependant, un flux de travail standardisé spécifiquement conçu pour isoler les sEVs à partir des cultures d’explant IPFP fait actuellement défaut.

Ici, nous décrivons un protocole étape par étape pour isoler et caractériser de petites vésicules extracellulaires issues de cultures explantées de coussinets adipeux infrapatuteliers de patients atteints d’arthrose à l’aide d’ultracentrifugation différentielle, fournissant un cadre méthodologique reproductible pour les études fonctionnelles et translationnelles en aval.

Protocol

L’utilisation de tissus IPFP chez des patients atteints d’arthrose dans cette étude a été approuvée par le comité d’éthique du Premier Hôpital de l’Université Médicale du Hebei (Approbation n° [2024] 018). La collecte d’échantillons a été effectuée dans la période approuvée, et le consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les participants avant l’acquisition des tissus.

1. Préparation du milieu et des solutions

1. Préparez 500 mL de milieu complet DMEM/F12 appauvri en exosomes en mélangeant 445 mL de milieu basal DMEM/F12, 50 mL de sérum fœtal bovin sans exosomes (10 %) et 5 mL de pénicilline/Streptomycine/amphotéricine B (100 U/mL, 100 μg/mL et 0,25 μg/mL, respectivement). Filtrez-stérilisez à travers un filtre de 0,22 μm.
2. Préparez le tampon de passage western blot en mélangeant 950 mL d’eau distillée (_{dH 2}O) avec 50 mL de tampon 20x (Tris/MOPS/SDS).
3. Préparez le tampon de transfert western blot en mélangeant 800 mL de_dH2Oavec 100 mL de tampon de transfert 10x et 100 mL d’éthanol absolu.
   REMARQUE : Ce tampon de transfert rapide a été spécifiquement optimisé pour le transfert humide à fort courant (400 mA) à température ambiante. En raison de sa faible production de chaleur, un bain de glace n’est pas nécessaire pour des périodes de transfert inférieures à 45 minutes, ce qui a démontré qu’il maintient une grande efficacité de transfert pour les protéines comprises entre 10 et 250 kA.
   ATTENTION : L’éthanol absolu est inflammable. Manipulez dans un endroit bien ventilé et éloignez-vous des sources de chaleur.
4. Préparez le tampon de lavage en mélangeant 50 mL de 20 cuillères à soupe (200 mM Tris et 3 M NaCl au pH 7,5–7,6) et 2 mL Tween-20 avec 950 mL de_{dH 2}O.
5. Préparez la solution de travail chimiluminescente en mélangeant des volumes égaux de solution luminol/amplificateur et de tampon peroxyde (environ 0,1 mL de solution de travail est nécessaire par centimètre carré de membrane).
   ATTENTION : Les substrats chimiluminescents peuvent être irritants. Portez des gants et une protection oculaire. Éliminer les déchets chimiques conformément à la réglementation institutionnelle locale.

2. Préparation du tissu IPFP et collecte du milieu conditionné

1. Lavez trois fois le tissu IPFP fraîchement obtenu (environ 10 g) avec 50 mL de PBS pré-refroidi par lavage par agitation manuelle douce dans le tube centrifugeuse pour éliminer complètement les résidus de sang.
2. Réduisez le tissu IPFP en morceaux d’environ 2 mm x 2 mm x 2 mm à l’aide de ciseaux stériles ou d’un scalpel.
3. Transférez des morceaux de tissu IPFP dans des flasques T175. Ajoutez 50 mL de milieu complet DMEM/F12 appauvri en exosomes. Incubez à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant 48 heures avec une agitation douce.
4. Collectez le milieu complet DMEM/F12 (c’est-à-dire un milieu conditionné) dans des tubes de 50 mL sur glace. Filtrez à travers une passoire de 70 μm pour enlever les débris tissulaires.

3. Isolation des sEV par ultracentrifugation différentielle

REMARQUE : Effectuez toutes les étapes suivantes à 4 °C ou sur glace.

1. Centrifugation initiale à basse vitesse pour éliminer les débris tissulaires
   1. Centrifugez le milieu conditionné à 300 x g pendant 10 minutes à 4 °C. Recueillez soigneusement le surnageant et transférez-le dans de nouveaux tubes centrifugeuses de 50 mL.
   2. Centrifugez le surnageant à 3 000 x g pendant 10 minutes à 4 °C. Récupérez le surnageant et transférez-le dans de nouveaux tubes, afin de vous assurer que la pastille n’est pas dérangée.
2. Centrifugation et filtration intermédiaires.
   1. Centrifugez le surnageant à 10 000 x g pendant 30 minutes à 4 °C.
   2. Collectez le surnageant et filtrez-le à travers un filtre à vide de 0,22 μm pour éliminer les vésicules plus grosses et les contaminants.
3. Première ultracentrifugation : pelletage sEV.
   1. Transférez le surnageant filtré dans des tubes centrifugeuses en polycarbonate de 40 mL.
   2. Ultracentrifugez les échantillons à 110 000 x g pendant 70 minutes à 4 °C à l’aide d’un rotor à angle fixe (facteur k = 70). Retirez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette.
   3. Résuspendez la pellete dans 10 mL de PBS stérile pré-refroidi. Filtrez la solution en suspension à travers un filtre à seringue de 0,22 μm pour garantir l’élimination de tout agrégat restant.
4. Deuxième ultracentrifugation : purification des sEV
   1. Ultracentrifuger la suspension à nouveau à 110 000 x g pendant 70 minutes à 4 °C en utilisant le rotor à angle fixe (facteur k = 70).
   2. Jetez soigneusement le surnageant, laissant la boule sEV au fond du tube. Resuspendez le dernier pellet de sEV à 200 μL de PBS stérile.
   3. Divisez la suspension sEV en aliquotes de 20 μL pour éviter les dommages causés par des cycles répétés de gel-dégel. Conservez les aliquotes à -80 °C pour une utilisation prolongée.

4. Caractérisation des sEV par analyse western blot

1. Préparez les échantillons de protéines sEV.
   1. Mélangez le pellet de sEV (à partir de l’étape 3.5.2) avec 80 à 120 μL de tampon de lyse RIPA complétés par des inhibiteurs de protéase.
      REMARQUE : Visez un rapport d’environ 1 μL de tampon RIPA pour 0,5 à 1,0 μg de protéine estimée. Une concentration finale de protéines d’au moins 1,0 μg/μL est recommandée pour assurer une séparation électrophorétique efficace et une détection de signal de haute qualité lors de l’analyse par western blot.
      ATTENTION : Le tampon RIPA contient des détergents et des irritants. Utilisez un équipement de protection individuelle.
   2. Faites un vortex brièvement et faites couver les échantillons sur glace pendant 15 à 30 minutes en faisant doucement osciller.
      REMARQUE : Un mélange approfondi à ce stade est essentiel pour une rupture complète de la membrane et une libération optimale des protéines. Un vortex insuffisant peut entraîner une lyse incomplète et des concentrations de protéines incohérentes entre les réplications.
   3. Centrifugez le lysat à 12 000–14 000 x g pendant 10 à 15 minutes. Rassemblez soigneusement le surnageant.
   4. Déterminer la concentration totale en protéines du lysat de sEV à l’aide d’un test protéique à haute sensibilité à l’acide bicinchoninique (BCA).
      REMARQUE : Un test BCA à haute sensibilité est recommandé plutôt que le test BCA standard pour les échantillons de vésicules extracellulaires en raison de sa plage de détection plus faible (0,5–20 μg/mL), ce qui permet une quantification précise des concentrations de protéines généralement faibles obtenues à partir de préparations purifiées de sEV. Effectuez le test selon le protocole du kit.
2. Analyse Western Blot.
   1. Mélangez les échantillons de protéines avec 5 x tampon de chargement SDS-PAGE.
      REMARQUE : Pour la détection du CD63, préparez les échantillons à l’aide d’un tampon de charge 5x non réducteur (sans β-mercaptoéthanol) et incubez à 70 °C pendant 10 minutes. Ces conditions préservent les épitopes conformationnels et empêchent l’agrégation thermique induite par la chaleur de cette protéine tétraspanine. Pour d’autres marqueurs, notamment ALIX (protéine X interagissant avec ALG-2), TSG101 (gène de susceptibilité tumorale 101) et Calnexine, préparez des échantillons en utilisant un tampon de charge réduit 5x contenant 10 % de β-mercaptoéthanol et chauffez à 95 °C pendant 5 minutes pour assurer une dénaturation complète des protéines.
   2. Chargez les échantillons préparés (généralement 20 à 40 μg de protéine totale) dans un gel préfabriqué en gradient (4 % à 12 %).
   3. Chargez le marqueur de poids moléculaire de la protéine dans le puits assigné selon les recommandations du fabricant.
   4. Faites passer le gel dans un tampon de fonctionnement à une tension constante de 100 V.
   5. Continuez la distillation pendant 1 à 1,5 heure, ou jusqu’à ce que le colorant atteigne le fond du gel.
      REMARQUE : La durée de fonctionnement peut varier selon le système d’électrophorèse et le pourcentage de gel.
   6. Transférez les protéines du gel vers les membranes PVDF en utilisant un système de transfert humide à 400 mA pendant 30 minutes.
      REMARQUE : La durée du transfert peut varier selon la marque de tampon de transfert utilisé.
   7. Bloquez les membranes dans un tampon bloqueur sans protéines préparé dans une solution saline tri-tampon contenant 0,2 % de Tween-20 (TBS-T) pendant 30 minutes à température ambiante avec une légère agitation. Le tampon bloqueant est formulé sans protéines sériques, biotine ou protéines phosphorylées afin de minimiser la liaison non spécifique et les interférences de fond.
   8. Incubez la membrane avec des anticorps primaires spécifiques dilués dans un tampon de dilution anticorps sans sérum contenant des stabilisateurs à base de protéines et des additifs conservant les anticorps à 4 °C pendant la nuit (12–16 h) avec une agitation douce.
   9. Lavez les membranes dans un tampon de lavage (TBST contenant 0,2 % Tween-20) sous une légère agitation sur un shaker.
   10. Incubez les membranes avec les anticorps secondaires appropriés à température ambiante pendant 1 h avec une légère agitation.
   11. Lavez à nouveau les membranes dans un tampon de lavage sous une légère agitation sur un shaker.
   12. Visualisez les bandes protéiques à l’aide d’un substrat chimiluminescent.
       ATTENTION : Les substrats chimiluminescents peuvent irriter la peau et les yeux. Portez des gants et des lunettes de sécurité appropriés. Éliminez le substrat conformément aux directives institutionnelles concernant les déchets dangereux.

5. Caractérisation des sEV par analyse de suivi de nanoparticules (NTA)

1. Allumez l’analyseur de suivi de nanoparticules et le module pompe à seringue selon les instructions du fabricant, et laissez le système s’équilibrer pendant au moins 30 minutes avant la mesure.
2. Décongelez doucement les échantillons EV sur de la glace et diluez les échantillons dans une solution stérile sans particules tamponnée phosphate (PBS) afin d’obtenir une concentration optimale de particules dans la plage de mesure recommandée (environ 1 x 10⁸ à 1 x 10⁹ particules/mL).
3. Chargez 1 mL de l’échantillon dilué dans une seringue stérile et injectez lentement l’échantillon dans la chambre de mesure, en veillant à ce qu’aucune bulle d’air ne soit introduite.
4. Ajustez le niveau et la mise au point de la caméra pour visualiser clairement les particules individuelles présentant un mouvement brownien.
5. Enregistrez trois vidéos d’une durée de 60 s pour chaque échantillon sous des conditions de débit constant en utilisant la pompe à seringue pour assurer une distribution constante des particules.
6. Analysez les vidéos enregistrées avec un logiciel NTA avec un seuil de détection fixé à 12, la taille de flou sur Auto, et la distance maximale de saut sur Auto.
7. Générez des profils de distribution et de concentration de la taille des particules en utilisant la fonction d’analyse automatisée du logiciel.
8. Exportez les données brutes, les graphiques de distribution des tailles de particules et les mesures de concentration pour une analyse statistique supplémentaire.
9. Nettoyez soigneusement la chambre de mesure avec de l’eau stérile sans particules, suivi d’un éthanol à 70 %, puis rincez à nouveau avec de l’eau stérile sans particules pour éviter la contamination croisée entre échantillons.

6. Caractérisation des sEVs par microscopie électronique de transmission (TEM)

1. Utilisez des grilles en cuivre de 200 mailles recouvertes de carbone. Effectuer une décharge lumineuse sur les grilles pendant 30 s en utilisant un système de décharge lumineuse, si disponible.
2. Appliquez 10 μL de suspension sEV (resuspendue dans un PBS stérile et filtré) sur la grille et incubez pendant 2 à 5 minutes à température ambiante.
3. Enlevez l’excès de liquide en touchant doucement le bord de la grille avec du papier filtre.
4. Lavez la grille en plaçant séquentiellement la surface chargée dans l’échantillon sur trois gouttes distinctes d’eau ultrapure.
5. Appliquez 10 μL de solution d’acide phosphotungstique à 2 % (pH 7,0) sur la grille et incubez pendant 1 à 2 minutes à température ambiante.
   ATTENTION : L’acide phosphotungstique est un réactif acide corrosif qui peut irriter la peau, les yeux et les voies respiratoires. Manipuler selon les directives de sécurité institutionnelles tout en portant un équipement de protection individuelle approprié, y compris des gants et des protections oculaires. Éliminez les déchets tachés et les matériaux contaminés selon les procédures approuvées pour les déchets chimiques dangereux.
6. Enlevez l’excès de tache à l’aide de papier filtre et laissez la grille sécher complètement à l’air à température ambiante pendant au moins 10 minutes.
7. Examinez les grilles à l’aide d’un microscope électronique à transmission actionné à une tension accélérée de 80 kV.
8. Acquérir des images représentatives à des grossissements appropriés pour évaluer la morphologie de la vésicule.

Results

L’isolement réussi de petites vésicules extracellulaires (sEV) à partir des tissus de la plaque adieuse infrapatutelaire humaine (IPFP) a été confirmé grâce à une caractérisation multimodale.

La microscopie électronique en transmission (TEM) a révélé que les vésicules isolées présentaient la morphologie caractéristique en forme de coupe avec des membranes lipidiques bien définies, cohérentes avec les caractéristiques structurelles des sEVs (Figure 1)

Discussion

Ce protocole offre un flux de travail reproductible et pratique pour isoler de petites vésicules extracellulaires (sEV) des tissus de la bouillie adieuse infrapatellaire humaine (IPFP) à l’aide d’une culture explantée suivie d’une ultracentrifugation différentielle. Les vésicules isolées ont été validées par des méthodes de caractérisation complémentaires, incluant la microscopie électronique en transmission (TEM), l’analyse de suivi des nanoparticules (NTA) et la détection par Western b...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubes centrifugeuses PET de 40 mL	HiMac (Eppendorf Himac Technologies)	5720411148	Polyéthylène térephtalate, 26 x 90 mm
70 & micro ; Filtre cellulaire m	Technologie Lanjieke de Pékin	560049	Pour l’élimination des débris tissulaires
Anticorps anti-Alix	Shanghai Abways Biotechnologie	CY7215	Marceur positif sEV
Anticorps anti-Calnexin	Shanghai Abways Biotechnologie	CY5839	Marqueur négatif (contamination par la zone d’urgence)
Anticorps anti-CD63	Biosciences d’affinité	DF2305	Marqueur tétraspanine
Anticorps anti-TSG101	Shanghai Abways Biotechnologie	CY5985	Marceur positif sEV
Kit de test protéique BCA	Shanghai YaMei Biotechnologie	ZJ102	Pour la quantification des protéines
Flacon de culture cellulaire (T175)	NEST Biotechnologie	560229	Pour la culture d’explant IPFP
Tube centrifugeuse (50 mL)	BIOFIL	560041	Pour les premières étapes à basse vitesse
Sérum bovin fœtal appauvri en exosomes	Cyagen Biosciences	FBSNE-01061	Pour la culture tissulaire
HRP IgG anti-Lapins	Shanghai Abways Biotechnologie	AB0101	Anticorps secondaire pour la WB
Tampon de charge instantanée de protéines (Dénaturant, Réducteur, 5 fois ;)	Shanghai YaMei Biotechnologie	LT101	Pour la dénaturation des protéines
Kit de test de protéines micro BCA	Thermo Scientific	23235	Pour la quantification des protéines
Unité de filtration Millex-GP (0,22 & micro ; m)	Technologie Lanjieke de Pékin	560360	Stérile, pour la filtration par vésicule
Analyseur de suivi de nanoparticules	Malvern Panalytical	NanoSight NS300	Pour l’analyse de taille et de concentration
Tampon de transfert rapide sans glace Omni-Flash	Shanghai YaMei Biotechnologie	PS201S	Pour le transfert de protéine Western blot
Acide phosphotongstique (2 %)	Sigma-Aldrich	P4006	Pour la coloration négative TEM
Tampon de charge protéique (dénaturant, non réducteur, 5 fois ;	Shanghai YaMei Biotechnologie	LT103	Pour la dénaturation des protéines
Tampon de blocage rapide sans protéines (5 fois et 5 fois)	Shanghai YaMei Biotechnologie	PS108	Pour bloquer les membranes
Tampon de lyse RIPA	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd	R0010	Pour l’extraction des protéines sEV
TBS (20 et plus fois)	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd	T1080	Pour préparer le tampon de lavage
Microscope électronique à transmission	Hitachi	HT7800	Pour la caractérisation morphologique
Tampon d’électrophorèse Tris/MOPS/SDS	Shanghai YaMei Biotechnologie	PS120	Pour la séparation des protéines
Préadolescent-20	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd	T8220	Pour préparer le tampon de lavage
Ultracentrifuge	HiMac (Eppendorf Himac Technologies)	CP100NX	Système d’isolation à grande vitesse
Kit de détection chimioluminescente ultra-sensible	Shanghai YaMei Biotechnologie	SQ201	Pour la visualisation des bandes protéiques
Tampon universel de dilution d’anticorps	Shanghai YaMei Biotechnologie	PS119L	Pour les anticorps primaires/secondaires