Article de méthode

Reprogrammation de lignées de cellules souches pluripotentes induites à partir d’échantillons de Buffy Coat gelés

DOI :

10.3791/70522

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10 avril 2026

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1Center for Molecular Medicine, University of Georgia, 2Interdisciplinary Neuroscience, University of Georgia, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Georgia, 4Department of Infectious Diseases, College of Veterinary Medicine, University of Georgia, 5Division of Pediatric Endocrinology, Emory University School of Medicine, 6Dysautonomia Center, New York University Langone Health, 7Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, Emory University School of Medicine, 8Stem Cell Core, Columbia Stem Cell Initiative, Columbia University, 9Department of Cellular Biology, University of Georgia

Dans cet article

Résumé

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Le protocole actuel détaille les étapes de dépannage de la dérivation des cellules souches pluripotentes induites (iPSC) à partir des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) d’échantillons de patients qui ont été difficiles à reprogrammer conformément aux instructions du fabricant. Ce protocole est spécifique aux échantillons de couche buffy congelée mais peut aussi être appliqué à la reprogrammation des PBMC purifiés.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) sont un outil précieux pour la modélisation des maladies. D’autres cellules souches peuvent être reprogrammées à partir de cellules somatiques adultes, appelées cellules souches pluripotentes induites (iPSC). La technologie iPSC permet l’évaluation de participants et populations spécifiques à l’étude et s’aventure dans la médecine personnalisée. Le sang est régulièrement prélevé et cryopréservé à des fins de recherche. Ces échantillons sont traités soit sous forme de couches buffy, un échantillon sanguin contenant des globules blancs et des plaquettes, soit comme cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC), qui représentent une population plus purifiée de globules blancs sans éosinophiles, basophiles, plaquettes ou globules rouges. Les deux sont une source facilement disponible et relativement non invasive pour les cellules somatiques reprogrammables. Plusieurs rapports détaillent la reprogrammation à partir des PBMC, tandis qu’un seul décrit ce processus à partir de manteaux buffy gelés. Des expériences récentes ont révélé que les protocoles de reprogrammation PBMC disponibles dans la littérature et auprès des fabricants échouent lorsqu’ils sont appliqués à des échantillons de couche buffy congelée, nécessitant les adaptations et stratégies de dépannage décrites ici. Pour de nombreux chercheurs qui utilisent les technologies iPSC, il est impératif de disposer de protocoles rigoureux avec un taux de réussite élevé, surtout dans les cas où les échantillons de patients peuvent contenir peu de cellules, sont obtenus à de larges intervalles de temps, proviennent d’un bassin de participants limité ou sont autrement très précieux. Ici, des points de contrôle et des stratégies de dépannage sont identifiés pour augmenter les chances de reprogrammer des buffy coats humains congelés ou des PBMC purifiés. En fin de compte, ce protocole permettra aux chercheurs d’identifier des prédicteurs du succès de la reprogrammation et de définir des stratégies alternatives pour améliorer les chances de dérivation réussie de l’iPSC.

Introduction

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La technologie des cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) est une source facilement évolutive et renouvelable de cellules humaines qui peuvent être différenciées en n’importe quel type cellulaire du corps, permettant aux chercheurs d’étudier des types cellulaires et tissulaires difficiles à obtenir ou inaccessibles chez les patients. De plus, les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) peuvent être dérivées directement à partir des cellules somatiques du patient1. Cela permet de différencier les types cellulaires spécifiques aux patients, un outil inestimable pour la modélisation des maladies et la découverte de médicaments. Ainsi, des méthodes rigoureuses, reproductibles et efficaces pour reprogrammer les cellules somatiques en iPSC sont essentielles.

Les fibroblastes, cellules urinaires etcellules sanguines 2,3, chacune avec ses propres limites, sont parmi les sources de cellules somatiques les plus fréquemment utilisées pour la dérivation de l’iPSC. Les fibroblastes, historiquement le choix le plus populaire pour la reprogrammation3, ne sont pas très faciles à obtenir, nécessitant une biopsie cutanée quelque peu invasive. Les cellules reprogrammables peuvent être extraites d’échantillons d’urine, qui sont faciles à obtenir et non invasifs, mais le processus de reprogrammation doit commencer avec des échantillons frais jusqu’à 48 heures après la4e collecte. Le sang offre une excellente source de cellules reprogrammables, car il est peu invasif à obtenir et facilement accessible. Il existe de nombreux protocoles de reprogrammation disponibles à partir des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC), des cellules sanguines à noyau unique, incluant les lymphocytes, les monocytes et les cellules tueusesnaturelles 5. Comme les PBMC sont moins denses que les autres cellules sanguines, ils peuvent être isolés/purifiés à partir d’échantillons de sang entier fraîchement isolés par centrifugationà gradient de densité 5. Alternativement, lors de la centrifugation, le sang total se sépare en trois couches distinctes : plasma, manteau buffy et globulesrouges 6. Les pelages buffy contiennent des PBMC ainsi que des plaquettes et certains érythrocytes. Cependant, les PBMC sont moins facilement disponibles dans la plupart des biobanques, tandis que les manteaux à sang entier ou à la poche buffy sont abondants etaccessibles 7. Malgré la disponibilité de buffy coats dans les biobanques et la présence de PBMC reprogrammables dans ces échantillons, très peu de protocoles détaillent la reprogrammation à partir de BuffyCoats 8 congelés, laissant cette ressource inexploitée.

Actuellement, de nombreux protocoles1, 8, 9 et les kits10 sont publiés pour simplifier la reprogrammation ; Cependant, ils ne cherchent pas en profondeur à maximiser le succès des cellules de donneurs de patients difficiles à reprogrammer. Il est communément admis que certaines cellules ne se reprogramment tout simplement pas, et lorsque cela arrive, de nombreux chercheurs peuvent essayer avec un autre type de cellule donneuse ou un autre patient. Cependant, cela peut ne pas être une option viable pour de nombreux chercheurs ou populations de patients. Contrairement aux protocoles8 et 9 précédemment publiés, ce protocole inclut un guide avec des points de contrôle et des critères, sur lesquels prédire le succès de la reprogrammation, et adopte une approche unique en purifiant les couches buffy gelées par centrifugation à gradient de densité lors de la décongélation.

Le processus commence par prélever le sang des individus choisis et isoler soit les PBMC, soit les pelages buffy. Pour les nouvelles expériences, cela inclura probablement le recrutement de nouveaux donneurs qui subiront de nouvelles prises de sang sous l’approbation de l’IRB et avec un formulaire de consentement approprié. L’étape suivante est l’expansion des cellules somatiques, dans laquelle les cellules sanguines gelées sont décongelées et cultivées dans des conditions favorisant la prolifération des cellules souches hématopoïétiques et des progéniteurs érythroïdes, les cellules sanguines les meilleures candidates pour la reprogrammation11. Après 10 à 14 jours, les cellules devraient être prêtes à être reprogrammées, comme en témoigne une morphologie distincte non abordée dans les protocoles précédents, puis sont transduites par inoculation avec un virus Sendai portant les facteurs Yamanaka Oct4, Sox2, c-Myc et Klf41. Après la transduction, les cellules commencent à exprimer les facteurs de transcription Yamanaka et reviennent à un état pluripotent, à nouveau noté par un changement morphologique distinct et une prolifération en colonies de cellules souches. Les colonies émergentes sont ensuite sélectionnées individuellement, étendues et cryopréservées. Après dix passages, la caractérisation par confirmation de l’expression des marqueurs de tige et du potentiel de différenciation dans les trois couches germinales valide une ligne iPSC reprogrammée avec succès.

Ce protocole fonctionne mieux pour les manteaux buffy cryopréservés, qui ont été stockés pendant < 1 mois, ou les PBMC cryopréservés stockés jusqu’à 2 ans avec au moins 1 million de cellules viables à la décongélation. Cependant, les points de contrôle décrits peuvent aider à dépanner la reprogrammation à partir de tout échantillon sanguin de qualité. De plus, les détails sur l’adaptation des iPSC reprogrammés à des conditions sans alimentation peuvent être applicables à tout flux de reprogrammation des iPSC, quel que soit le type de cellule somatique de départ.

Ce protocole, établi par un dépannage pratique, détaille la reprogrammation des iPSC à partir de couches buffy congelées et identifie les indicateurs morphologiques du succès de la reprogrammation, fournissant un guide pratique pour reprogrammer des échantillons difficiles. En fin de compte, la mise en œuvre de ces stratégies permet d’économiser du temps, de l’argent, des réactifs et des échantillons.

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Protocole

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Ce protocole suit les directives du comité d’éthique de la recherche humaine de l’Université de Géorgie. Toutes les études sur des sujets humains ont été réalisées conformément aux directives de la Déclaration d’Helsinki de l’Association médicale mondiale. D’après leur auto-déclaration, les volontaires ne souffraient pas des maladies suivantes : mucoviscidose kystique, pneumopathie obstructive chronique, tuberculose, asthme, diabète ou infections aiguës des voies respiratoires. Des volontaires âgés de 18 à 50 ans, des deux sexes, ont été recrutés. Les femmes enceintes ont été exclues de l’étude.

1. Extraction et cryoconservation par couche buffy ou PBMC

Critères de décision : Si les échantillons seront conservés longtemps, il est préférable de choisir l’option 2. Si les réactifs pour la purification PBMC ne sont pas disponibles, ou si des échantillons seront conservés pendant une courte période, l’option 1 est appropriée.

  1. Option 1 : Extraction du pelage buffy
    1. Effectuez une phlébotomie (ponction veineuse pour prélever du sang) selon les meilleures pratiquesde l’OMS 12 et prélevez 7 à 10 mL de sang total dans des tubes de collecte sanguine recouverts d’anticoagulant. Gardez les échantillons au frais.
    2. Transférez 7 à 10 mL de sang total dans une sonde conique de 15 mL. Faites tourner le sang à l’aide d’une centrifugeuse à seau pivotant à 200 x g pendant 15 minutes à 4 °C sans frein. Cela doit former 3 couches avec un plasma jaune sur le dessus, la couche blanche buffy au centre, et les érythrocytes rouges en bas.
    3. Collectez le plasma à l’aide d’une pipette sérologique stérile sans déranger la couche de couche buffy. Jetez le plasma. Transférez la couche blanche buffy dans un tube conique frais de 15 mL (environ 1 à 2 mL).
      ATTENTION : Jetez le plasma dans la poubelle à déchets bio-dangereux appropriée.
      REMARQUE : Une certaine contamination plasmique du pelage buffy est acceptable car elle aide à la récupération après décongélation.
    4. Ajoutez du DMSO à la couche buffy de sorte que la composition finale soit 10 % DMSO v/v et congelez immédiatement en cryovial (1 mL/flacon) à -80 °C. Le lendemain, transférez les fioles à l’azote liquide pour un stockage à long terme.
      REMARQUE : Par exemple, pour 2 ml de manteau buffy, ajoutez 200 μl de DMSO, mélangez bien, puis aliquotez dans 2 flacons. Cela se traduit généralement par 1 à 3 fioles congelées par échantillon.
  2. Option 2 : Purification PBMC
    1. Effectuez une phlébotomie (ponction veineuse pour prélever du sang) selon les meilleures pratiquesde l’OMS 12 et prélevez 7 à 10 mL de sang total dans des tubes de collecte sanguine recouverts d’anticoagulant. Gardez les échantillons au frais.
    2. Ajoutez 4 mL de solution de gradient de densité 1 dans un nouveau tube conique de 15 mL. Posez soigneusement 4 mL de sang sur la solution 1 du gradient de densité.
    3. Centrifugeuse à l’aide d’une centrifugeuse à seau pivotant à 400 x g en RT pendant 30 minutes, en désactivant les freins. Cela entraînera un plasma dans la couche supérieure, des PBMC dans la couche moyenne, et le reste du sang sera dans la couche inférieure.
    4. Collectez la fraction PBMC dans un tube conique neuf de 15 mL, puis lavez-la 2 à 3 fois avec 1 PBS en centrifugant dans une centrifugeuse à seau pivotant à 350 x g en RT pendant 5 minutes avec le frein activé. Jetez le surnageant. Pour éviter la cryoconservation et commencer immédiatement la reprogrammation, passez à l’étape 2.3.4.
      ATTENTION : Jetez le surnageant dans la poubelle à déchets bio-dangereux appropriée.
    5. Resuspendez le pellet dans un milieu de cryoconservation (90 % de sérum et 10 % de DMSO) et congelez immédiatement dans du cryovial (1 mL/fiole) à -80 °C. Le lendemain, transférez les fioles à l’azote liquide pour un stockage à long terme.
      REMARQUE : Des tubes de collecte sanguine isolant PBMC peuvent être utilisés plutôt que la centrifugation à gradient de densité pour la purification PBMC à partir de sang frais. Il est également possible de cryopréservation en utilisant des milieux de congélation alternatifs disponibles dans le commerce. Le rendement typique est de 1 à 4 fioles congelées par échantillon.

2. Préparer des échantillons pour l’expansion des cellules somatiques

  1. Préparation aux médias
    1. Préparez le média d’expansion (EM)9 en citant 45 mL de base EM. Ajoutez 127,8 μL d’acide L-ascorbique (50 μg/mL provenant d’un stock de 100 mM) et 450 μL de pénicilline-streptomycine (100 fois le stock).
    2. Préparer EM + cytokinesde 13 à 4 ml EM, ajouter 2 μL de facteur de cellules souches (SCF) (50 ng/mL à partir de 100 μg/ml), 2 μL d’interleukine-3 (IL-3) (10 ng/mL à partir de 20 μg/mL), 16 μL d’érythropoïétine (EPO) (2 U/mL à partir de stock de 500 U/mL), 4 μL de facteur de croissance insulinique 1 (IGF1) (40 ng/mL d’un stock de 40 μg/ml), et 4 μL de dexaméthasone (1 μM à partir d’un stock de 1 mM). Utilisez EM + cytokines le même jour où elle est préparée.
      REMARQUE : Des systèmes commerciaux alternatifs de milieux d’expansion peuvent être utilisés.
  2. Option 1 : Purification PBMC à partir de Frozen Buffy Coat
    Critères de décision : si l’option 1 de l’étape 1 a été choisie (c’est-à-dire extraction du manteau buffy), alors choisissez l’option 1 à l’étape 2 (c’est-à-dire la purification PBMC à partir du manteau buffy congelé).
    1. Récupérer la solution 2 du gradient de densité et la laisser atteindre la température ambiante. Mélangez soigneusement en inversant la bouteille. Transférer aseptiquement la solution 2 du gradient de densité de 3 mL dans un tube conique de 15 mL.
    2. Préparez un autre tube conique de 15 mL avec 12 mL de solution tampon phosphate de Dulbecco (DPBS).
    3. Récupérez le flacon de Buffy Coat congelé dans l’azote liquide. Gardez sur la glace jusqu’à ce que vous soyez prêt à dégeler. Décongelez doucement l’échantillon en le faisant tourner dans un bain-marie à 37 °C. Retirez quand il ne reste plus qu’un petit cristal de glace.
    4. Transférez soigneusement (goutte dans la goutte) le contenu du flacon dans le tube conique contenant le DPBS. Rincez le flacon avec 1 mL de DPBS et ajoutez au tube conique contenant les cellules récupérées.
    5. Centrifugeuse à l’aide d’une centrifugeuse à seau pivotant à 200 x g en RT pendant 10 minutes. Retirez soigneusement le surnageant et remettez le comprimé cellulaire dans 4 mL de DPBS avec du sérum bovin fœtal (FBS) à 1 %.
    6. Superposez doucement le mélange de couche buffy sur la solution à gradient de densité, en faisant attention à ne pas laisser le mélange. Centrifugeuse dans un seau pivotant à 800 x g pendant 20 minutes en mode réflexe avec le frein désactivé.
    7. Avec une pipette, retirez et éliminez la couche supérieure de plasma sans perturber l’interface plasma :gradient. Avec une pipet, retirez la couche PBMC à l’interface (Figure 1A) et transférez dans un tube propre de 15 mL.
      ATTENTION : Jetez les autres couches dans la poubelle à déchets bio-dangereux appropriée.
    8. Lavez les PBMC avec 3 mL EM en centrifugant à 200 x g pendant 10 minutes en RT. Retirez soigneusement le surnageant et remettez le pellet en suspension dans 2 mL EM + cytokines. Placez dans un puits d’une plaque à 12 puits.
    9. Placez la plaque dans l’incubateur à 37 °C, 5 % de CO2 et 20 % d’O2.
  3. Option 2 : Congélation des PBMC surgelés
    Critères de décision : si l’option 2 de l’étape 1 a été choisie (c’est-à-dire la purification par PBMC), ou s’il y a un risque que les couches buffy congelées aient une faible viabilité (c’est-à-dire en stockage plus d’un mois) (Figure 1B), alors choisissez l’option 2 à l’étape 2 (c’est-à-dire décongeler les PBMC congelés).
    1. Préparez un tube conique de 15 mL avec 12 mL de DPBS.
    2. Récupérez le flacon de PBMC congelés à partir de l’azote liquide. Gardez sur la glace jusqu’à ce qu’elle soit prête à dégeler. Décongelez doucement l’échantillon en le faisant tourner dans un bain-marie à 37 °C. Retirez quand il ne reste plus qu’un petit cristal.
    3. Transférez soigneusement (goutte dans la goutte) le contenu du flacon dans le tube conique. Veillez à récupérer toutes les cellules du flacon en rinçant le flacon avec 1 mL de DPBS.
    4. Centrifugeuse dans un seau pivotant à 200 x g en température réactive pendant 10 minutes. Retirez soigneusement le surnageant et resuspendez le pellet (Figure 1C) dans 2 mL EM, puis prenez 10 μL pour effectuer le test d’exclusion du bleu de trypan afin d’obtenir un nombrede cellules 14.
      ATTENTION : Jetez le surnageant dans la poubelle à déchets bio-dangereux appropriée.
    5. Plaque 1,0 x 106–2,0 x 106 cellules/mL dans 2 mL EM + cytokines dans un puits d’une plaque à 12 puits. Placez la plaque dans l’incubateur à 37 °C, 5 % de CO2 et 20 % d’O2.

3. Expansion des cellules somatiques (1 jour après le décongélation)

  1. Retirez soigneusement 1 mL de média usé de chaque puits. Les milieux usés peuvent être collectés dans un autre puits ou tube centrifugeuse et vérifiés pour s’assurer qu’aucune cellule n’a été perte.
  2. Remplacez le média usé par 1 mL d’EM + cytokines fraîches.
  3. Répétez les étapes 3.1 et 3.2 et prenez des photos des PBMC tous les deux jours jusqu’à ce qu’un changement significatif de morphologie soit observé, avec des cellules brillantes et rondes de grande et petite taille (Figure 2A, flèche orange et bleue, respectivement), qui sont les érythroblastes, le type cellulaire à reprogrammer. Cela prendra environ 10 à 14 jours.
    REMARQUE : Les cellules qui ne présentent pas ces morphologies, généralement dépourvues des cellules rondes plus grandes (Figure 2B), ont peu de chances de se reprogrammer avec succès et peuvent être mortes (Figure 2C).

4. Transduction (10–14 jours après la décongélation)

  1. Préparez le virus Sendai
    1. En utilisant la valeur de titre spécifique au lot, calculez le volume de chaque virus nécessaire à la transduction de 2,0 × 10cellules 5 en utilisant KOS : c-Myc : Klf4 avec une multiplicité d’infection (MOI) de 5:5:3, comme recommandé par le fabricant. L’équation de ce calcul se trouve dans les documents produit fournis par le fabricant.
    2. Récupérez les virus du congélateur et conservez-les au froid jusqu’à la décongélation. Un par un, décongelez doucement les virus en les faisant tournoyer dans un bain-marie à 37 °C.
    3. Préparez des aliquotes dans lesquelles les trois virus sont mélangés au volume approprié pour la transduction de 2,0 × 10cellules 5 à des MOI de 5:5:3. Congelez les aliquotes à -80 °C jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à l’emploi.
      ATTENTION : Assurez-vous de bien blanchir tous les déchets ayant touché le virus Sendai.
      REMARQUE : Les instructions du fabricant recommandent un comptage réel des cellules avec un calcul MOI pour déterminer le volume de virus ajouté, mais l’approximation de 2,0 × 105 a été conclue pour les besoins de ce protocole. L’aliquotation peut être plus rentable et réduit le nombre de cycles de congélation/dégel des virus.
  2. Jour de la transduction (d0)
    1. Si les PBMC n’ont pas été nourris la veille, retirez 1 mL de média usé et remplacez-les par 1 mL d’EM + cytokines fraîches. Dégelez l’aliquote du virus sur de la glace, puis ajoutez-le directement au puits et faites tourner le milieu.
    2. Enveloppez la plaque dans du parafilm et centrifugez la plaque dans une centrifugeuse à seau pivotant à 350 x g en RT pendant 90 minutes. Placez la plaque dans l’incubateur à 37 °C, 5 % de CO2 et 20 % d’O2 pendant la nuit.
      ATTENTION : Assurez-vous de bien blanchir tous les déchets ayant touché le virus Sendai.
  3. 1 jour après la transduction (d1)
    1. Rassemblez les cellules dans un tube conique de 15 mL. Rincez bien avec 2 mL d’électromagnétrie et vérifiez au microscope que toutes les cellules ont été collectées. Centrifuge les cellules à 300 x g en RT pendant 10 minutes.
    2. Retirez soigneusement le surnageant et resuspendez dans 2 mL EM + cytokines. Placez dans un puits frais d’une plaque à 12 puits et remettez la plaque dans l’incubateur à 37 °C, 5 % de CO2 et 20 % d’O2.
      ATTENTION : Assurez-vous de bien blanchir tous les déchets ayant été en contact avec le virus Sendai.

5. Replacer les cellules transduites sur les cellules nourrisseuses

  1. Préparer la cellule d’alimentation
    1. À 43,5 mL, le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco ajoute 5 mL de Slim (concentration finale de 10 %), 0,5 mL de solution d’acides aminés non essentiels (MEM-NEAA) (à partir de 100 fois le stock), 50 μL de 2-mercaptoéthanol (55 μM à partir du stock de 55 mM) et 0,5 mL d’antibiotique-antimycotique (à partir de 100 fois le stock).
    2. Préparez des plaques à 6 puits recouvertes de gélatine en ajoutant 600 μL de gélatine (0,1 % à partir de 2 % de stock) à 12 mL de DPBS et en distribuant 2 mL par puits. Incubez à température ambiante pendant 20 minutes.
    3. Récupérer un flacon congelé de fibroblastes embryonnaires irradiés de souris (MEF) et décongeler doucement en le faisant tournoyer dans un bain-marie à 37 °C.
    4. Ajouter goutte à goutte un tube conique de 15 mL contenant 10 mL de DPBS et rincer le flacon avec 1 mL supplémentaire de DPBS. Centrifugez à 200 x g en RT pendant 5 minutes.
    5. Retirez soigneusement le surnageant et resuspendez la granule cellulaire dans un milieu fibroblastique de 1 mL. Retirez 10 μL pour effectuer le test d’exclusion bleu de trypan afin d’obtenir le nombre de cellulesde 14.
    6. Retirez la solution de gélatine des plaques à 6 puits et placez les MEF irradiées à 2,5 × 104 cellules/cm 2. Incuber en incubateur à 37 °C, 5 % deCO2 et 20 % d’O2 pendant 6 à 48 heures.
      REMARQUE : Les plaques des cellules d’alimentation doivent être préparées avant le replacage des cellules transduites. Les meilleurs résultats ont été observés lorsque les MEF irradiés sont incubés environ 2 jours avant le replaquet, mais une incubation d’au moins 6 heures peut suffire.
  2. Cellules transdudues à replaque
    1. Préparez des milieux iPSC de 90 mL DMEM/F12 avec 10 mL de FBS (concentration finale de 10 %), 1 mL de mem-neaa (à partir de 100 mM de stock), 1 mL de L-glutamine (2 mM à partir de 200 mM de stock), 1 mL de pénicilline-streptomycine (à partir de 100x stock), 100 μL de 2-mercaptoéthanol (55 μM à partir de 55 mM), et 100 μL de facteur de croissance de fibroblastes 2 (FGF2) (10 ng/mL à partir de 10 μg/mL). Ajoutez de l’acide L-ascorbique (50 μg/mL) frais à chaque repas.
    2. Au troisième jour après la transduction, collectez tous les milieux et cellules du puits transduits dans un tube conique de 15 mL. Rincez bien avec au moins 1 mL supplémentaire d’EM et centrifugez dans une centrifugeuse à seau pivotant à 300 x g en RT pendant 10 minutes.
    3. Resuspendez la pastille dans un support iPSC de 6 mL. Aspirez le média de 3 puits de la plaque avec des MEF irradiés.
    4. Les cellules transduites par plaques sur ces 3 puits de MEF irradié (2 ml/puits). Incuber en incubateur à 37 °C, 5 % deCO2 et 20 % deO2.

6. Entretien jusqu’à l’émergence de la colonie

  1. Les jours 4, 5 et 6 après la transduction, ajoutez 1 mL de milieux iPSC frais à chaque puits chaque jour. Cela limite la perturbation inutile des cellules fraîchement reprogrammées lorsqu’elles se déposent sur les nourrisseurs, tout en leur fournissant des nutriments frais.
  2. Le 7e jour après la transduction, retirez tout le vieux substrat et remplacez-le par 2 mL de substrat iPSC frais par puits. Continuez à vous nourrir avec des milieux iPSC un jour sur deux jusqu’à ce que les colonies commencent à émerger.
  3. Préparez un média hES de 78 mL de DMEM/F12 avec 20 mL de supplément sans FBS (20 %), 1 mL de mem-neaa (100x), 1 mL de L-glutamine (2 mM à partir de 200 mM de stock), 1 mL de pénicilline-streptomycine (100x), 100 μL de 2-mercaptoéthanol (55 μM à partir de 55 mM de stock), et 100 μL de FGF2 (10 ng/mL à partir de 10 μg/ml). Ajoutez de l’acide L-ascorbique (50 μg/mL) frais à chaque repas.
  4. Une fois que de petites colonies ont commencé à émerger, continuez à maintenir les cellules transduites en vous nourrissant tous les deux jours avec un milieu hES (Figure 3A).
    REMARQUE : Les colonies commenceront à apparaître dès 7 jours après la transduction. Si aucune colonie n’a émergé trois semaines après la transduction, il est peu probable qu’elles émergent un jour.

7. Choisir les colonies une fois qu’elles ont grandi (Figure 3B)

REMARQUE : Parfois, les cellules transduites subissent un changement morphologique qui ne donne pas lieu à une colonie semblable à une cellule souche (Figure 3C). Cela n’est pas considéré comme une colonie pouvant mener à une lignée iPSC réussie.

REMARQUE : Dès l’émergence de la colonie, les lignées d’iPSC devront être adaptées aux conditions de culture hPSC préférées du laboratoire. Ce protocole démontrera comment les lignées d’iPSC ont été adaptées à des conditions sans alimentation, cultivées sur des plaques recouvertes de vitronectine (VTN), nourries avec des milieux hPSC définis chimiquement et disponibles commercialement. Si les colonies ne s’adaptent pas bien aux nouvelles conditions, elles peuvent avoir besoin d’une transition plus douce, comme être piégées sur des cellules nourricières avec un milieu hES.

  1. Préparez les plaques recouvertes de VTN en décongelant et en mélangeant soigneusement le VTN. Pour une plaque à 24 puits, préparez 12 mL de DPBS avec 120 μL de VTN (5 μg/mL à partir d’un stock de 500 μg/mL) et distribuez 0,5 mL de solution/puits de VTN. Incubez à température ambiante pendant 1 heure.
  2. Préparez le milieu hPSC en décongelant une bouteille de complément hPSC à 4°C pendant la nuit. Une fois décongelé, ajoutez un supplément de 10 mL de hPSC à une bouteille de 500 mL de médium basal hPSC.
  3. Préparez les plaques pour le prélèvement en retirant la solution VTN des puits de la plaque à 24 puits et en ajoutant un milieu hPSC de 0,5 mL avec 0,5 μL de Y-27632 (10 μM à partir d’un stock de 10 mM) à chaque puits.
  4. Apportez la nouvelle plaque, le 6-puits contenant les cellules/colonies transduites, les aiguilles stériles à seringue, ainsi qu’une pipette p200 et les pointes devant un microscope disséquant dans des conditions stériles.
  5. Placez la plaque contenant les cellules transduites et les colonies émergentes sur le microscope de dissection et utilisez le microscope pour localiser une colonie à prélever. Soulevez le couvercle de la plaque pour exposer le puits.
  6. Ouvrez la seringue de façon aseptique et exposez l’aiguille. Guidé par le microscope, utilisez la pointe de l’aiguille pour détacher la colonie des cellules nourricières environnantes en suivant le contour de la colonie avec l’aiguille.
  7. Utilisez la pointe de l’aiguille pour couper la colonie en quelques morceaux de taille égale. Si les morceaux de la colonie ne se sont pas déjà détachés de la plaque, utilisez le côté de l’aiguille pour les retirer ou les gratter de la plaque afin qu’ils flottent.
    ATTENTION : Jetez l’aiguille dans le contenant approprié pour objets tranchants.
  8. Avec le p200, utilisez le microscope pour déplacer la colonie choisie. Aspirez la colonie flottante avec la pipette et transférez dans un puits de la plaque préparée à 24 puits. Essayez de faire entrer toute la colonie dans le puits sans avoir d’autres colonies ou cellules nourrissantes.
  9. Placez la plaque dans l’incubateur à 37 °C, 5 % de CO2 et 20 % d’O2.
  10. Nourrissez les colonies choisies avec 1 mL de milieu hPSC chaque jour jusqu’à ce qu’elles soient en confluent.
    REMARQUE : Les colonies ont le potentiel d’être génétiquement distinctes les unes des autres. Chaque puits de la plaque à 24 puits ne doit contenir qu’une seule colonie choisie. Chaque colonie choisie reçoit un identifiant distinct et, à partir de là, elle est traitée comme une lignée cellulaire différente des autres colonies choisies. Pour une série rigoureuse de reprogrammation, choisissez au moins 24 colonies et développez et caractérisez au moins 3.

8. Étendre

  1. Maintenance hPSC
    1. Les colonies cueillies sont prêtes à se diviser lorsqu’elles sont grandes et rondes avec des bords lumineux (Figure 4A). Les colonies se brisent en plusieurs morceaux lorsqu’elles sont cueillies. S’il y a plusieurs colonies dans un même puits, séparez-les avant qu’elles ne soient assez grandes pour entrer en contact et commencer à se différencier.
    2. Préparer une plaque à 6 puits revêtue de VTN : Pour une plaque à 6 puits, préparez 12 mL de DPBS avec 120 μL de VTN (5 μg/mL à partir d’un stock de 500 μg/mL) et distribuez 1 mL de solution/puits de VTN. Incubez à température ambiante pendant 1 heure. La solution de VTN peut être remplacée par du DPBS et conservée à 37 °C, 5 % deCO2 pendant un mois. Dans les puits qui seront divisés, aspirez le DPBS et remplacez-le par un milieu hPSC de 1 mL.
    3. Aspirez le média du puits pour le fendre, puis rincez une fois avec 1 mL de DPBS. Aspirez le DPBS et ajoutez 500 μL de tampon de dissociation EDTA 0,5 mM (préparé à 500 mL DPBS avec 0,9 g de NaCl et stérilisé par filtre)15. Incubez à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 2 minutes, jusqu’à ce que les colonies commencent à se desserrer, et que les cellules de chaque colonie commencent à s’enrouler et à se détacher les unes des autres.
    4. Retirez la plaque de l’incubateur, aspirez le tampon de dissociation de l’EDTA. À l’aide d’une pipette p1000, collectez les cellules avec un milieu hPSC de 1 mL en pipettant doucement de haut en bas jusqu’à ce que les colonies soient complètement détachées et légèrement brisées. Transférez 1 mL de milieu et de cellules dans le nouveau 6 puits contenant 1 mL de milieu hPSC frais. Cette première division se fait à un ratio de séparation 1:1, toutes les cellules de la plaque d’origine sont transférées vers la nouvelle plaque.
    5. Placez les cellules dans l’incubateur à 37 °C, 5 % de CO2 et 20 % d’O2. Nourrissez les iPSC quotidiennement jusqu’à ce que le puits soit confluent et prêt à se diviser.
      REMARQUE : Une mauvaise morphologie des cellules souches (Figure 4B) peut être atténuée en ajustant le protocole de séparation, comme en clivant plus tôt, en utilisant un temps d’incubation EDTA plus court, ou en ajustant le ratio de séparation.
    6. Élargissez en un plat de 10 cm.
      1. Une fois les cellules confluentes dans chaque puits des plaques à 6 puits, recouvrir une antenne de 10 cm de VTN (7 mL DPBS avec 70 μL de VTN (5 μg/mL à partir de 500 μg/mL), incubée pendant 1 h à RT).
      2. Répétez le protocole de séparation, cette fois en s’étendant du puits 6 vers la boîte de culture tissulaire de 10 cm (ratio de division 1:1). Utilisez 7 à 10 mL de médium hPSC par antenne de 10 cm.
      3. Une fois que les cellules de l’antenne de 10 cm sont confluentes, on répète ce processus de séparation (passage). À chaque passage, notez le numéro du passage. Le rapport de séparation dépend de la morphologie et de la densité cellulaires. Un ratio typique est de 1:10, où un dixième des cellules de la plaque d’origine est transféré vers la nouvelle plaque.
  2. Congelations et préparatifs de stock
    1. Après environ 3 passages, élargissez en quatre bolles de culture de 10 cm pour les stocks de passage précoce. Une fois que les cellules des antennes de 10 cm sont confluentes, elles sont prêtes à être congelées.
    2. Préparez les cryovials et mettez-les au congélateur pour qu’ils refroidissent. Assurez-vous que l’étiquette inclut la lignée cellulaire, le clone, le numéro de passage et la date de la congélation.
    3. Préparez un milieu congelant : 90 % de medium hPSC et 10 % de DMSO, il vous faudra 1 mL/flacon (3 fioles congelées par plat de 10 cm).
    4. Exécutez le protocole de séparation normalement, en utilisant un tampon de dissociation de 4 mL 0,5 mM EDTA pour chaque antenne de 10 cm.
    5. Après l’incubation de l’EDTA, aspirez l’EDTA. Ajoutez doucement 10 mL de médium hPSC à la plaque.
    6. Lavez doucement les cellules de la plaque en pipettant le substrat. Les cellules se détachent facilement du sol de la plaque et se mélangent au substrat. Pipettez seulement 2 à 5 fois pour briser doucement les colonies mais évitez la dissociation en cellules uniques.
    7. Centrifugez pendant 5 minutes à 200 x g en RT. Aspirez le surnageant et resuspendez la pellete cellulaire dans un milieu congelant.
    8. Isoler et congeler immédiatement à -80 °C. Transférez les fioles congelées dans la cuve d’azote liquide pour un stockage à long terme.
    9. Congelez plus de stocks de la même manière une fois la caractérisation terminée.

9. Caractérisation des iPSC :

  1. Expression des marqueurs de tige. Après avoir été dilaté pendant au moins 10 passages, lorsque les colonies dans un 24-puits sont prêtes à être divisées, fixez avec 4 % de paraformodéhyde et colorez par immunohistochimie pour le marqueur de tige NANOG. Il faudra au moins 10 passages pour que les colonies soient négatives au virus de Sendai (SeV), ce qui peut être confirmé par immunofluorescence (Figure 4C).
  2. Capacité de pluripotence de test : Trois différenciations de la couche germinale. La pluripotence de l’iPSC est confirmée par une différenciation réussie en chacune des trois couches germinales. Chaque différenciation commence à partir d’une antenne confluente de 10 cm présentant une bonne morphologie hPSC (Figure 4A).
    1. Ectoderme16
      1. La veille du début de la différenciation (jour 1) : Semez des iPSC sur des plaques à 24 puits recouvertes de matrice à une densité de 2,6 × 105 cellules/cm 2 pouces de milieu hPSC avec Y-27632 (concentration finale de 10 μM) et XAV-939 (concentration finale de 2 μM).
      2. Jour 0–jour 1 : Alimentation avec 1 mL/base de différenciation de puits avec LDN (concentration finale de 100 nM), SB (concentration finale de 10 μM) et XAV (concentration finale de 2 μM).
      3. Jour 2 – jour 7 : Alimentation avec 1 mL/base de différenciation de puits avec LDN (concentration finale de 100 nM) et SB (concentration finale de 10 μM). À partir de d3, nourrissez un jour sur deux.
      4. Jour 8 : fixer avec 4 % de paraformodéhyde et colorer par immunohistochimie pour le marqueur ectoderme PAX617 et confirmer la perte du marqueur de pluripotence NANOG (Figure 4D).
    2. Mésoderme18 :
      1. La veille du début de la différenciation (jour -1) : Séminez des iPSC sur des plaques à 24 puits recouvertes de matrice à une densité de 2,5 × 105 cellules/cm 2 in milieu hPSC avec Y-27632 (concentration finale de 10 μM).
      2. Jour 0 : Alimentation avec DMEM/F12 avec acide L-ascorbique (concentration finale de 64 μg/mL), sélénite de sodium (concentration finale de 13,6 ng/mL), holotransférrine (concentration finale de 10 μg/mL), concentré lipidique défini chimiquement (100x) et CHIR (concentration finale de 5 μM).
      3. Jour 1 : Alimentation avec DMEM/F12 avec acide L-ascorbique (concentration finale de 64 μg/mL), sélénite de sodium (concentration finale de 13,6 ng/mL), holotransférrine (concentration finale de 10 μg/mL), concentré lipidique défini chimiquement (100x) et héparine (concentration finale de 0,6 U/mL).
      4. Jour 2 : Fixer avec 4 % de paraformoldéhyde et colorer par immunohistochimie pour BRACHYURY-T19 et confirmer la perte du marqueur de pluripotence NANOG (Figure 4E).
    3. Endoderme20
      1. La veille du début de la différenciation (jour -1) : Séminez des iPSC sur des plaques de 24 puits recouvertes de matrice à une densité de 1,0 × 105 cellules/cm 2 in milieu hPSC avec Y-27632 (concentration finale de 10 μM).
      2. Jour 0–jour 4 : Au jour 0, laver avec DPBS et nourrir avec RPMI avec substitut de L-glutamine (100x), FBS (0,5 % de concentration finale) et Activine A (concentration finale de 100 ng/mL). À partir de d0, nourrissez quotidiennement avec le même média.
      3. Jour 5 : Fixer avec 4 % de paraformodéhyde et colorer par immunohistochimie pour le marqueur endodermique SOX1721 et confirmer la perte du marqueur de pluripotence NANOG (Figure 4F).
        REMARQUE : Les différenciations ont été effectuées selon des protocoles précédemment publiés. D’après notre expérience, les revêtements matriciels peuvent être interchangeables.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le succès de ce protocole peut être suivi à différentes étapes. Le tableau 1 présente un résumé des exemples sur lesquels ce protocole a été réalisé. Les échantillons de départ, qui sont soit des couches buffy cryopréservées stockées pendant une semaine, soit des PBMC cryopréservés, qui présentent une bonne qualité d’échantillon lors de la décongélation et une apparence morphologique distincte après expansion cellulaire, ont été reprogrammés avec succès 6 fois sur 7 (

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La technologie iPSC possède un potentiel immense dans le domaine biomédical en ce qui concerne la découverte des mécanismes de maladie, la médecine personnalisée et les « essais cliniques dans un plat »22,23. Des protocoles efficaces et adaptables pour la reprogrammation des iPSC à partir d’échantillons sanguins sont essentiels pour libérer le grand potentiel de la technologie iPSC, car ils sont faciles à collecter et souvent fac...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous déclarons que la recherche a été menée sans relations commerciales ou financières pouvant être interprétées comme un conflit d’intérêts potentiel.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les sujets humains ont été recrutés et ont reçu leur consentement éclairé pour le don de sang selon le protocole IRB UGA# 2012-10769-06, NYU# s21-01701, Emory# 2024P008659, et Emory# 000002114. Les recherches rapportées dans cette publication ont été soutenues par le National Institute of General Medical Sciences de l’Institut national de la santé sous le numéro 5T32GM142623 à J. Art, R01MH115174 à V. Michopoulos, et R01NS114567 à N. Zeltner. Le contenu relève uniquement de la responsabilité des auteurs et ne reflète pas nécessairement les opinions officielles des National Institutes of Health.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Plats standards de culture tissulaire de 10 cmFaucon353003
Plaques à 12 puitsFaucon353043
Tubes coniques de 15 mLFisher7200886
Plaques à 24 puitsCorning7200740
Solution de paraformodéhyde à 4 %Thermo ScientificJ19943-K2
Plaques à 6 puitsFisher ScientificFB012927
accuSpin1RFisher Scientific75003449
Activine ABio-techne338-AC
AF488-âne et alpha ; chèvreinvitrogenA11055
AF555-âne et alpha ; RBTinvitrogenA31572
AF647-âne et alpha ; minvitrogenA31571
AF647-âne et alpha ; RBTinvitrogenA31573
Antibiotique-Antimycotique (100X)Fisher15 240 096  ;
Pipets sérologiques en polystyrène BasixFisher14955233
14955234
14955235
14955236
Seringues tuberculines BDFisher14-826-87
Tubes de préparation à cellules mononucléaires en verre (CPT) en vacuum de BDFisher Scientific02-685-125Tubes de collecte sanguine isolés par le PBMC
BD  ; Tubes de collecte de sang en plastique Vacutainer avec K2EDTA : fermeture HemogardFisher Scientific02-657-32Tubes de collecte sanguine recouverts d’anticoagulants
B-MercaptoéthanolFisher21 985 023  ;
Gélatine bovineSigmaG1393
IgG polyclonal polyclonal de chèvre à anticorps Brachyury-TR& DAF2085
CellDrop BFDenovixCellDrop BF
Centrifugeuse 5702EppendorfEP022628102-1EA
concentré lipidique défini chimiquementFisherNC9022744
Chir 99021  ;R& D4423
Incubateur CO2SanyoMCO-20AIC
Système de stockage de cryopréservationSystèmes biogéniques personnalisésV-1500AB
CryoStor CS10Technologies des cellules souches100-1061Milieu de congélation alternatif
Kit de reprogrammation Sendai CytoTune-iPS 2.0FisherA16517
DexaméthasoneSigmaD2915
DMEMFisher11965118
DMEM/F12Fisher11330057
DMSOFisherBP231-1
DPBS 1X SANS CA MG  ;FisherMT21031CM
EDTAFisherAM9262
Érythropoeitine (EPO)Bio-Techne287-TC-500
Moyen Essentiel 6 (E6)FisherA1516401Base de différenciation &NBSP ;
Moyen Essential 8 (E8)FisherA1517001Milieu basal hPSC
Microscope EVOS FLThermoAMF4300
Sérum fœtal bovinVWR45000-734
FGF basique (FGF2)Bio-techne233-FB/CF  ;
GeltrexFisherA1413202Revêtement matriciel
Solution d’acides aminés non essentiels Gibco MEM (100X)Fisher11140050
GlutamaxFisher35050061Substitut de L-glutamine  ;
HéparineTechnologies des cellules souches7980
Histopaque 1077Sigma10771solution du gradient de densité 1  ;
HolotransferrineSigmaT0665
Facteur des cellules souches humaines (SCF)Peprotech300-07-100UG
Facteur de croissance comparable à l’insuline 1 (IGF1)Peprotech100-11-100UG
Interleaukine-3 (IL-3)Peprotech200-03-2UG
Bain marie Isotemp 210Fisher Scientific210
Remplacement du sérum par KO (KSR)Fisher10828028supplément gratuit FBS & nbsp ;
Acide L-ascorbiqueSigmaA4544-100G
LDN193189Stemgent04-0074
L-GlutamineFisher25030081
LymphoprepTechnologies des cellules souches7801Solution du gradient de densité 2
MatrigelCorningCB-40234Revêtement matriciel
Fibroblastes embryonnaires de sourisFisherA34964  ;
IgG polyclonal de chèvre nanogR& DAF1997-SP
Biobanque Nunc et tubes cryogéniques en culture cellulaireFisher Scientific12-565-163N
Pénicilline/StreptomycineFisher15140122
IgG polyclonal polyclonal de lapin anti-Pax-6 purifiéBiolégende901301
QBSF-60 Milieu Sérum LibreQualité biologique160-204-101Base EM
Milieu de Congélation en Culture Cellulaire de RécupérationThermo Fisher Scientific12648010Milieu de congélation alternatif
rhVitronectine (VTN)FisherA31804
RPMI 1640 MoyenFisher11875093
SB431542R& D1614
Virus de Sendai HN Anticorps monoclonal Souris IgG2aInvitrogen14649482
Sélénite sodiqueSigmaS5261
IgG polyclonal de chèvre à anticorps Sox17R& Daf1924
Supplément d’expansion érythroïde StemSpanTechnologies des cellules souches2692Supplément alternatif commercial de support d’expansion
Médium StemSpan SFEM IITechnologies des cellules souches9605Milieu commercial alternatif d’expansion
Congélateur à ultra basse températureThermo Fisher ScientificTSX60086A
Pointes de pipette universelles - FiltréesVWR76322-132
76322-134
76322-150
76322-156
XAV939Bio-techne3748/10
Y-27632 DihydrochlorureBioGems1293823

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Mots-clés

Cellules souches pluripotentes induitesreprogrammation de la couche leucocytairereprogrammation des PBMCmorphologie des cellules souchestransduction par le virus Sendaimarqueur de pluripotence NANOGdiff renciation rythroblastiquemarquage par immunofluorescenceisolement par gradient de densitcellules souches pluripotentes humaines

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