Un protocole standardisé pour évaluer la toxicité au cadmium chez les organoïdes colorrectaux humains via un test de viabilité basé sur la luciférase

Résumé

Le protocole vise à identifier les organoïdes colorectales humains et à évaluer un test de bioluminescence ATP à base de luciférase pour détecter la toxicité induite par le cadmium. Il évalue la faisabilité et la sensibilité du test en quantifiant les variations dépendantes de la dose et du temps dans la viabilité des organoïdes.

Résumé

Le cadmium (Cd) est classé comme un cancérogène de groupe 1 et constitue un grave problème environnemental mondial. Cette étude visait à établir un modèle organoïde colorectal humain et à évaluer la faisabilité et la sensibilité d’un test de bioluminescence à base de luciférase pour détecter les réponses toxiques des organoïdes colorectaux (COs) à l’exposition au CD. Les cellules souches ont été isolées à partir de tissu colorectal humain et cultivées dans une matrice membranaire basale tridimensionnelle afin de générer des COs. Les organoïdes ont été traités avec une série graduée de concentrations de Cd pour différentes durées d’exposition. Un réactif de viabilité luminescent a été ajouté à un rapport de volume égal, délicatement mélangé en le balanceant à température ambiante pour favoriser la lyse et la pénétration du réactif, puis incubé pour permettre à la réaction bioluminescente de se dérouler. La luminescence était enregistrée en mode luminescence sur un lecteur de microplaques multimode. L’ajustement de la courbe dose-réponse a été utilisé pour calculer la concentration inhibitrice demi-maximale et pour évaluer les variations de viabilité ou de viabilité relative. Les cellules souches primaires ont été isolées avec succès dans le tissu colorectal humain et utilisées pour générer des COs. L’exposition au CD a entraîné des diminutions dépendantes de la dose et du temps de l’activité métabolique organoïde ; L’analyse dose-réponse a donné des courbes de survie et des valeurs IC50 pour les organoïdes. Cette étude fournit des conseils méthodologiques et des perspectives pratiques pour l’utilisation des agents de combat humains dans les études de toxicologie environnementale des métaux lourds.

Introduction

Le CD est un métal lourd naturellement présent classé comme cancérogène de groupe 1 et est devenu une préoccupation environnementale^{mondiale 1}. L’exposition humaine au CD se fait principalement par inhalation et une alimentation alimentaire. Bien que l’exposition chronique à de faibles doses soit associée à une série de conséquences négatives pour la santé, réduire substantiellement son utilisation et ses rejets environnementaux reste^{un défi 2,3}. Les cultures bidimensionnelles traditionnelles poussent sur des substrats plats et manquent d’architecture tissulaire, de polarité cellulaire et de microenvironnement tumoral. Par conséquent, ils possèdent une capacité limitée à récapituler l’hétérogénéité in vivo et les réponses toxicologiques authentiques à l’exposition au^{cadmium 4}. De tels systèmes ne peuvent pas modéliser adéquatement les interactions cellule-cellule, la croissance dépendante de la matrice ou les processus biologiques sous-jacents au développement de la résistance aux^{médicaments 5}. Les systèmes organoïdes tridimensionnels dérivés des tissus des patients offrent une plateforme plus pertinente sur le plan physiologique comparée aux lignées cellulaires bidimensionnelles^{conventionnelles 6}. Les organoïdes conservent les caractéristiques génomiques, l’organisation histologique et les états fonctionnels du tissu primaire. Cela permet une modélisation plus précise de la croissance, de l’évolution et de la sensibilité à la toxicité du cadmium, offrant des avantages évidents pour la modélisation des maladies et la recherche en^{toxicologie 7}. Les CO possèdent une architecture tridimensionnelle complexe, une hétérogénéité cellulaire et des capacités intrinsèques de renouvellement et d’auto-organisation ^8,9. La transplantation de COs chez des souris receveuses peut favoriser l’auto-renouvellement des cellules souches intestinales et moduler le microenvironnement immunitaire de l’hôte, produisant des effets^{protecteurs 4}. En 2009, Sato et al. ont démontré pour la première fois qu’une seule cellule souche intestinale adulte Lgr5⁺ peut s’auto-organiser et se différencier spontanément pour former des structures crypt-villosités englobant toutes les lignées cellulaires^{intestinales 10}.

L’épithélium intestinal constitue la première ligne de défense contre la toxicité au CD après ingestion. En fait, la biodisponibilité orale du Cd est généralement inférieure à 5 %. La toxicité intestinale induite par la Cd se caractérise par la perturbation des jonctions intercellulaires, une perméabilité paracellulaire accrue et l’induction de réponses inflammatoires. De plus, le Cd perturbe la fonction immunitaire intestinale et modifie la composition ainsi que l’homéostasie du microbiote intestinal¹¹. Selon la dose et la durée d’exposition, le Cd peut provoquer une dysrégulation du cycle cellulaire, favorisant des phénotypes oncogéniques dans certains contextes tout en induisant l’apoptose dans d’autres. Le CD peut indirectement stimuler la production des ROS (espèces réactives de l’oxygène), déclenchant un stress oxydatif et un déséquilibre redox. La fonction des récepteurs, kinases, phosphatases, protéases, molécules d’adhésion et facteurs de transcription peut être modulée via la signalisation redox. Le CD perturbe également les cascades de signalisation, modifiant le statut d’activation d’ERK1/2, JNK (kinase N-terminale c-Jun) et p38 MAPK (protéine kinase activée par le mitogène p38) à travers plusieurs types^{cellulaires 12}. En activant ERK1/2 dans la cascade MAPK, Cd peut favoriser la prolifération et la survie cellulaire, supprimer la mort cellulaire programmée et contribuer à une hyperprolifération^{aberrante 13}. La CD peut réguler directement ou indirectement l’expression et l’activité des principales protéines effectrices. Par exemple, il régule à la baisse le suppresseur tumoral p53 et augmente les protéines anti-apoptotiques telles que Bcl-2 et Bcl-xL, perturbant ainsi en fin de compte l’apoptose et l’homéostasie du cycle^{cellulaire 14}.

Dans les modèles de CO utilisés pour évaluer les effets cytotoxiques du Cd, la mesure de la teneur en ATP est largement employée pour évaluer la viabilité organoïde. L’ATP, la molécule centrale du métabolisme énergétique, reflète directement l’état métabolique global et la viabilité des organoïdes. Lors de l’exposition au cadmium chez les COs, le Cd induit principalement un dysfonctionnement mitochondrial, aggrave le stress oxydatif et perturbe l’homéostasie de l’énergie organoïde. Ces événements affectent collectivement la production d’ATP et réduisent finalement la viabilité des organoïdes. Par conséquent, les variations des niveaux d’ATP servent de lecture fonctionnelle robuste de la cytotoxicité induite par le cadmium. Les tests conventionnels de cytotoxicité incluent les tests colorimétriques MTT/CCK-8, la coloration Live/Dead et les analyses basées sur la cytométrie en écoulement. Comparés à ces méthodes, les tests basés sur l’ATP offrent des avantages distincts dans les systèmes organoïdes tridimensionnels. En raison de la complexité structurelle et de l’hétérogénéité spatiale marquée des organoïdes, les approches traditionnelles de coloration et d’imagerie sont souvent limitées par une pénétration tissulaire insuffisante et une précision quantitative réduite. En revanche, les tests ATP reposent sur une réaction bioluminescente médiée par la luciférase, permettant une quantification directe sans perturber la structure organoïde. La mesure de l’ATP présente une grande sensibilité et une large plage dynamique. Cela permet de détecter des réponses biologiques continues, allant de la suppression métabolique précoce à la mort organoïde, facilitant des analyses dose-réponse précises sur différentes concentrations de cadmium. Les niveaux d’ATP reflètent de manière exhaustive l’état fonctionnel global des organoïdes, surpassant les approches dépendant de l’évaluation morphologique ou de marqueurs moléculaires uniques. Par conséquent, ce test est particulièrement adapté au criblage de toxicité à haut débit, offrant une meilleure stabilité et reproductibilité.

Le principe fondamental sous-jacent à l’utilisation de la bioluminescence de l’ATP pour évaluer la sensibilité des COs à l’exposition au CD est que la luciférase de luciole catalyse l’oxydation de la D-luciférine en présence d’ATP, Mg²⁺ et O₂ pour produire de l’oxyluciférine et émettre des photons. L’intensité de la lumière émise est proportionnelle à la teneur mesurable en ATP dans l’échantillon dans une plage linéaire définie. Par conséquent, la luminescence sert de substitut quantitatif indirect à l’activité métabolique cellulaire ou à la viabilité. Les organoïdes sont intégrés dans une matrice extracellulaire et possèdent une structure tridimensionnelle multicouche. Pour cela, les réactifs d’essai ATP disposent de compositions et procédures optimisées de tampon de lyse. Ces optimisations améliorent la perturbation des cellules organoïdes internes, favorisent la libération d’ATP et stabilisent le signal^{bioluminescent 15}. Il est important de noter que la bioluminescence de l’ATP indique l’activité métabolique plutôt qu’un nombre exact de cellules. Par exemple, les inhibiteurs mitochondriaux peuvent réduire considérablement les niveaux d’ATP cellulaires sur de courtes périodes, même lorsque les cellules restent viables. Inversement, certaines formes précoces de mort cellulaire peuvent préserver transitoirement des niveaux relativement élevés d’ATP.

Bien qu’ils démontrent une pertinence physiologique supérieure dans les évaluations de toxicité au cadmium (Cd), les modèles organoïdes colorectaux présentent plusieurs limites pratiques. Comparée aux lignées cellulaires traditionnelles bidimensionnelles (2D), la culture des organoïdes est plus chronophage et coûteuse. De plus, leur dépendance aux matrices dérivées d’animaux introduit une variabilité de lot en batch, ce qui limite leur utilité dans le criblage de toxicité à grande échelle et à haut débit. Bien que ces modèles soient très appropriés pour évaluer les effets toxicologiques directs des métaux lourds sur l’épithélium intestinal, ils ne peuvent pas encore remplacer entièrement les modèles in vivo pour évaluer la toxicité systémique ou les processus toxicocinétiques complexes.

Dans cette étude, le tissu colorectal humain a été utilisé comme matériau source pour isoler les cellules souches colorectales et établir des COs in vitro. Les organoïdes ont été exposés au Cd à différentes concentrations et pendant différentes durées d’exposition. La luminescence a ensuite été mesurée à l’aide du lecteur de microplaques multimode en mode détection de luminescence. La viabilité de la cellule ou les valeurs IC50 ont été calculées et visualisées à l’aide d’un logiciel opérationnel pour un lecteur de microplaques spécifique.

Protocole

L’expérience a été approuvée par le Comité d’éthique du Suzhou Vocational Health College (Approbation n° SWYXLL202516) et a été menée conformément aux normes éthiques médicales. Tous les sujets de cette recherche ont donné leur consentement éclairé écrit.

1. Isolement du tissu colorectal humain et établissement des COs

1. Transport et conservation des échantillons de tissus
   1. Avant l’expérience, décongelez lentement la matrice de membrane basale à 4 °C, et équilibrez le milieu de culture requis à température ambiante.
   2. Placez immédiatement le tissu colorectal humain obtenu lors de procédures cliniques dans une solution de conservation tissulaire pré-refroidie (2–8 °C).
      REMARQUE : Assurez-vous que le tissu reste complètement immergé pendant le transport. Transférez les échantillons au laboratoire.
2. Sous une armoire de biosécurité, placez le tissu dans une cuvette de culture de 6 cm pour évaluation. Retirez soigneusement le tissu adipeux visible et les couches musculaires à l’aide d’un scalpel et de pinces, tout en conservant les composants épithéliaux.
3. Transférer le tissu dans une boîte de 6 cm contenant 3 mL de solution physiologice tamponnée phosphate (PBS) complétée avec 300 μL d’antibiotiques. Découpez le tissu en fragments de 2 mm × 5 mm.
4. Transférez les fragments de tissu dans un tube centrifugeuse de 50 mL.
5. Ajoutez 10 mL de PBS pré-refroidi et 200 μL de 0,5 M EDTA (concentration finale ~10 mM) au tube.
6. Placez le tube sur un shaker à température ambiante et agitez-le doucement à 0,072 g pendant 15 minutes.
7. Utilisez des pinces pour transférer le tissu dans la boîte de culture et examinez-le au microscope. Passez à l’étape suivante une fois que les structures cryptales deviennent visibles ou commencent à se détacher.
   REMARQUE : Lorsque les structures cryptiques deviennent visibles sous observation microscopique après un traitement avec EDTA, la digestion a généralement atteint un niveau suffisant pour l’isolement de la crypte, et les cryptes commencent à se détacher des fragments de tissu épithélial desserrés. Les cryptes intactes conservent généralement une morphologie glandulaire ou tubulaire bien définie avec une lumière centrale discernable, tandis qu’une digestion excessive produit un grand nombre de cellules individuelles dissociées et de débris nécrotiques.
8. Arrêtez la digestion dès que de nombreuses cryptes intactes deviennent visibles et que les fragments de tissu apparaissent lâches et translucides, permettant à un pipetage doux de libérer facilement les cryptes.
   REMARQUE : L’incubation prolongée de l’EDTA perturbe l’intégrité de la crypte, augmente l’accumulation de débris cellulaires et réduit la viabilité des cellules souches intestinales, diminuant ainsi l’efficacité ultérieure de la formation des organoïdes.
9. Ajoutez 15 mL de PBS complété en antibiotiques pour arrêter la digestion de l’EDTA. Mélangez doucement.
10. Centrifugez l’échantillon à 300 × g pendant 3 minutes à 4 °C.
11. Retirez le surnageant.
12. Ajoutez 1 mL de milieu cellulaire complet et transférez la suspension dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL.
13. Centrifugez la suspension à 300 × g pendant 3 minutes puis jetez le surnageant.
14. Ajoutez 500 μL de la matrice membranaire du socle à un tube de microcentrifuge de 1,5 mL et mélangez bien.
15. Minimisez l’exposition à la température ambiante lors du mélange et gardez la matrice de membrane du socle sur la glace pour éviter une solidification prématurée.
16. Ajouter 25 μL de mélange goutte par goutte dans chaque puits de la plaque à 24 puits pour former une goutte.
17. Inversez la plaque à 24 puits et faites-la couver à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant 20 minutes.
18. Ajoutez 600 μL de milieu de culture de CO à chaque puits.
19. Obtenir un milieu de culture organoïde colorectal et des réactifs de dissociation à partir de sources commerciales et les utiliser strictement conformément aux instructions du fabricant.
20. Pour préparer le milieu complet de culture cellulaire, compléter 500 mL de milieu basal DMEM avec 50 mL de sérum bovin fœtal (FBS) et 5 mL de pénicilline-streptomycine. Mélangez soigneusement la solution par inversion douce.

2. Analyse de sensibilité des CO exposés au CD

1. Placage et culture des COs dans des plaques à 96 puits
   1. Éliminez le milieu de culture de chaque puits et ajoutez 500 μL de solution de dissociation organoïde. Pipotez doucement de haut en bas pour disperser la matrice membranaire du bazal.
   2. Placez la plaque traitée dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO₂ pour la digestion, avec un temps de digestion initial de 10 minutes.
   3. Collectez la solution de digestion de chaque puits de la plaque de 24 puits dans un tube centrifugeuse de 15 mL et ajoutez 10 mL de milieu complet de culture cellulaire.
   4. Centrifugez à 300 × g pendant 3 minutes pour collecter l’organoïde et jeter le surnageant.
   5. Ajoutez 1 mL de milieu de culture cellulaire complet, mélangez soigneusement par pipettette, puis transférez la suspension dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL.
   6. Centrifugez à 300 × g pendant 3 minutes, puis jetez le surnageant.
   7. Ajoutez 100 μL de la matrice membranaire du socle et mélangez soigneusement en pipettant.
   8. Dissociez les organoïdes et estimez le nombre de cellules individuelles au microscope avant d’ensemencer environ 3 000 à 5 000 cellules individuelles par puits.
   9. Maintenir une densité d’ensemencement relativement constante à travers tous les groupes expérimentaux afin d’assurer une croissance organoïde reproductible et des résultats expérimentaux.
   10. Ajustez la plage de semis en fonction d’une évaluation microscopique après la dissociation des organoïdes et des conditions précédemment rapportées couramment utilisées dans les études en culture organoïde.
   11. Ajoutez 6 μL du mélange au centre de chaque puits d’une plaque à 96 puits. Utilisez 30 puits au total, avec trois réplications techniques.
   12. Inversez la plaque et étouffez-la à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO₂ pendant 15 minutes.
   13. Ajoutez 100 μL de milieu de culture organoïde à chaque puits de la plaque à 96 puits.
   14. Commencez le traitement au cadmium exactement 7 jours après le semis.
       REMARQUE : Cette période de culture de 7 jours permet aux cellules individuelles de se développer pleinement en COs structurellement intacts.
2. Cd Concentration Dilution
   1. Dissoudre 3,67 mg de poudre de chlorure de cadmium dans 2 mL d’eau ultra-pure stérile pour préparer une solution de 10 mM d’un volume final de 2 mL.
   2. Stériliser les 2 mL de solution de cadmium à 10 mM en la faisant passer à travers un filtre de 0,22 μm.
   3. Aliquote la solution stérilisée de cadmium dans des tubes centrifugeuses de 1,5 mL et stockez-les à 4 °C, protégées de la lumière.
   4. Portez un équipement de protection individuelle (EPI) approprié, y compris une blouse de laboratoire, des gants de protection et des lunettes de protection, tout au long de l’expérience.
   5. Effectuez toutes les opérations associées à l’intérieur d’une hotte chimique pour minimiser les risques d’exposition.
   6. Classer et gérer tous les déchets contenant du Cd, y compris les milieux de culture enrichis en cadmium, les pointes de pipette, les tubes de centrifugeuse et les plats de culture, comme déchets chimiques dangereux.
   7. Jetez ces matériaux dans des contenants désignés pour la collecte des déchets liquides ou solides en métaux lourds.
   8. Éliminez tous les déchets strictement conformément aux directives institutionnelles et aux réglementations environnementales locales.
   9. Ne traitez jamais les déchets de CD comme des déchets de laboratoire ordinaires ni les versez dans l’évier.
   10. Étiquetez le couvercle d’une plaque à 24 puits comme 4, 3, 2, 1 et 0.
       REMARQUE : Traiter les organoïdes avec du Cd à des concentrations finales de 40 μM, 20 μM, 10 μM, 5 μM et 0 μM. La dilution de la solution de stock de cadmium a été calculée selon la formule standard :
               C₁ V₁ = C₂ V₂
3. Pour préparer 4 mL de la concentration de travail de 20 μM, ajoutez 8 μL de la solution de 10 mM à 3992 μL de milieu de culture complet. Mélangez soigneusement la solution pour assurer une répartition uniforme.
   1. Ajoutez 1,4 mL de milieu de culture au puits marqué 4 et ajoutez 700 μL de milieu de culture à chacun des puits restants.
   2. Retirez 5,6 μL de milieu de culture du 4 bien marqué et ajoutez 5,6 μL de solution de cadmium. Mélangez soigneusement.
   3. Transférez 700 μL de la solution du puits marqué « 4 » vers le puits marqué « 3 » et mélangez soigneusement.
   4. Répétez le transfert et le mélange de chaque puits vers le puits à numérotation inférieure suivant (de '3' à '2', '2' à '1', et '1' à '0'), en mélangeant soigneusement à chaque étape.
      REMARQUE : Ne réalisez aucune opération dans le puits identifié 0.
   5. Retirez la plaque de 96 puits de l’incubateur et jetez le milieu de culture existant.
   6. Étiquetez le couvercle de la plaque à 96 puits de gauche à droite comme 40 μM, 20 μM, 10 μM, 5 μM et 0 μM.
   7. Ajoutez 100 μL de milieu de culture contenant du cadmium à chaque puits étiqueté correspondant.
   8. Placez la plaque dans l’incubateur.

3. Ajout du réactif de viabilité luminescente

1. Retirez le réactif luminescent de viabilité du congélateur à −20 °C et laissez-le dégeler à température ambiante. Ajoutez le réactif de viabilité luminescent dans un rapport de volume de 1:1.
2. Ajoutez 2,5 mL de réactif luminescent à un réservoir de réactif jetable.
3. Ajoutez 2,5 mL de substrat organoïde colorectal et mélangez soigneusement en pipettant.
4. Utilisez un système d’aspiration des déchets pour retirer le milieu de culture organoïde de chaque puits de la plaque à 96 puits. Évitez d’aspirer la matrice membranaire du socle depuis les puits.
5. Transférez 200 μL de la solution du réservoir de réactif jetable dans chaque puits de la plaque de 96 puits contenant des COs, et mélangez soigneusement par pipetage vigoureux. Évitez d’introduire des bulles d’air lors de la pipetage.
6. Faites couver la plaque à température ambiante pendant 25 minutes. Incubez à température ambiante, protégés de la lumière.

4. Mesure du réactif de viabilité luminescente

1. Ouvrez le logiciel opérationnel du lecteur de microplaques spécifique (Figure supplémentaire 1A).
2. Cliquez sur Lire maintenant (Figure supplémentaire 1B).
3. Cliquez sur Nouveau (Figure supplémentaire 1B).
4. Cliquez sur Lire (Figure supplémentaire 1C).
5. Sélectionnez la luminescence (Figure supplémentaire 1D).
6. Sélectionnez la fibre de luminescence (Figure supplémentaire 1D).
7. Cliquez sur OK (Figure supplémentaire 1D).
8. Sélectionnez la plaque complète (Figure supplémentaire 1E).
9. Cliquez sur effacer tout (Figure supplémentaire 1F).
10. Sélectionnez les positions correspondantes sur la plaque cible à 96 puits, pour un total de 15 puits (Figure supplémentaire 1G).
11. Cliquez sur OK (Figure supplémentaire 1G).
12. Placez la plaque à 96 puits dans l’instrument (Figure supplémentaire 1H).
13. Sélectionner Utiliser le couvercle (Figure supplémentaire 1I).
14. Cliquez sur OK pour commencer la mesure (Figure supplémentaire 1I).
15. Après avoir terminé la mesure, cliquez sur Exporter pour exporter les données vers Excel (Figure supplémentaire 1J).

5. Traitement et analyse des données

1. Logiciel ouvert d’analyse statistique des données capable de régression non linéaire. (Figure supplémentaire 2A).
2. Sélectionnez une table de données XY (Figure supplémentaire 2A).
3. Réglez X sur des nombres (Figure supplémentaire 2A).
4. Réglez Y pour entrer les valeurs de réplication dans des sous-colonnes côte à côte et entrez 3 réplications (Figure supplémentaire 2A).
5. Voici les données (Figure supplémentaire 2B).
6. Analyses de clics (Figure supplémentaire 2C).
7. Cliquez sur les analyses XY (Figure supplémentaire 2D).
8. Cliquez sur régression non linéaire (ajustement de courbe) (Figure supplémentaire 2D).
9. Cliquez sur OK. (Figure supplémentaire 2D).
10. Sélectionnez dose–réponse – inhibition (Figure 2E supplémentaire).
11. Sélectionnez la réponse logaritaire (inhibiteur) vs. normalisée – pente variable (Figure supplémentaire 2E).
12. Cliquez sur OK pour lancer l’analyse (Figure supplémentaire 2E).
13. Cliquez sur fichier (Figure supplémentaire 2F).
14. Cliquez sur Exporter (Figure supplémentaire 2F).
15. Cliquez sur OK (Figure supplémentaire 2G).

Résultats

Création de commandants humains
Nous avons réussi à isoler des structures cryptiques colorectales à partir d’échantillons de tissus, et la morphologie typique des cryptes a été clairement observée à la fois par microscopie à faible et haute grossiment. Lors de la culture in vitro, les cryptes isolées se sont progressivement étendues et ont montré un processus ordonné de maturation morphologique (Figure 1A,B). Au troisième et au sixième jour de culture, des organoïdes colorectaux structurellement intacts s’étaient formés, présentant principalement des structures sphériques ou des structures précoces semblables à des bourgeonnages (Figure 1C,D).

Sensibilité des COs à l’exposition au CD
Les COs ont été ensemencés en plaques de 96 puits et cultivés pendant 5 jours supplémentaires, suivis d’un traitement au cadmium à des concentrations de 0, 5, 10, 20 et 40 μM. Après 72 heures d’exposition, un test de luminescence basé sur l’ATP a été réalisé pour mesurer les unités relatives de luminescence (RLU), et les données ont été analysées et visualisées. Les résultats ont démontré une baisse significative de la viabilité organoïde dépendante de la dose avec l’augmentation des concentrations de cadmium (Figure 2A). Les COs exposés à 10 μM, 20 μM et 40 μM cadmium ont montré des valeurs RLU nettement réduites (Figure 2B). Nous n’avons observé aucune toxicité significative chez les organoïdes colorectaux exposés à 5 μM Cd. Conformément aux données de viabilité, l’analyse morphologique a révélé des altérations structurelles marquées chez les organoïdes colorrectaux traités au cadmium, notamment une réduction de la taille des organoïdes, une perturbation sévère de l’architecture épithéliale et une fragmentation structurelle progressive (Figure 2C). Ces résultats indiquent que les organoïdes colorectaux sont très sensibles à la cytotoxicité induite par le cadmium.

Figure 1 : Isolement des cryptes colorectales humaines et établissement de cultures organoïdes colorectales. (A) Image représentative de cryptes colorectales humaines isolées. (10×). (B) Vue à fort grossissement d’une seule crypte (20×). (C) Image représentative des CO après 3 jours en culture (4×). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 2 : Altérations cytotoxiques et morphologiques induites par le CD chez les COs. (A) Courbe dose-réponse relative des COs exposés à différentes concentrations de Cd. L’axe x représente les concentrations de D, et l’axe y indique la viabilité relative des organoïdes. (B) Valeurs relatives de RLU des COs après traitement avec des concentrations variables de Cd. L’axe X représente les concentrations de Cd, et l’axe Y indique les valeurs relatives de RLU. ANOVA unidirectionnelle *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. (C) Images représentatives en champ clair de COs non traités (0 μM) et traités en Cd à 5 μM, 10 μM, 20μM, 40 μM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire 1 : Un flux de travail détaillé en 16 étapes pour la détection des RLU utilisant le logiciel opérationnel d’un lecteur de microplaques spécifique. (A) Icône logicielle. (B) Interface de lancement logicielle. (C) Menu des paramètres. (D) Interface de sélection du test. (E) Menu de configuration de la disposition des plaques. (F) Disposition par défaut des plaques. (G) Configurer les positions des puits selon la disposition expérimentale des plaques. (H) Chargement de la microplaque. (I) L’instrument lance la mesure de l’UU. (J) Exportation de données. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure complémentaire 2 : Après l’exportation des données, le traitement des données et l’analyse statistique sont effectués dans un logiciel d’analyse statistique des données. (A) Écran d’accueil. (B) Tableau de saisie de données. (C) Dialogue d’analyse. (D) Menu paramètres d’analyse. (E) Menu de configuration pour la régression non linéaire. (F) Menu des options de fichier. (G) Dialogue d’exportation de données. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Cette étude établit un protocole standardisé pour les tests d’exposition au cadmium et de viabilité de l’ATP utilisant des COs pour évaluer l’impact du cadmium sur la viabilité des organoïdes. Ce protocole optimise spécifiquement les étapes de dissociation des organoïdes et de placage à 96 puits afin d’améliorer la reproductibilité expérimentale et la stabilité des lectures ultérieures des tests ATP. Bien que le protocole expérimental actuel se concentre principalement sur l’établissement d’un modèle organoïde 3D du cancer colorectal pour l’évaluation de la toxicité au CD, des recherches approfondies ont démontré que les cultures cellulaires 2D traditionnelles et les modèles organoïdes 3D diffèrent significativement en termes de réponses médicamenteuses, d’interactions cellulaire-cellule, d’architecture tissulaire et de profils toxicologiques. Comparés aux monocouches 2D, les organoïdes reproduisent plus fidèlement l’architecture spatiale, l’hétérogénéité cellulaire et le microenvironnement in vivo des tumeurs, offrant une pertinence physiologique supérieure. En raison de l’absence d’interactions complexes cellule-cellule et matrice extracellulaire (ECM), la réponse des cultures 2D à l’exposition aux métaux lourds peut ne pas capturer avec précision les processus toxicologiques in vivo^{authentiques 16}. Inversement, le modèle CO établi dans cette étude simule efficacement la dynamique de croissance tridimensionnelle des tissus tumoraux, fournissant une plateforme hautement pertinente sur le plan physiologique pour évaluer la toxicité induite par le Cd.

Lors du passage organoïde, le temps de dissociation était strictement maintenu à environ 10 minutes. Cette optimisation empêche la dissociation incomplète, qui conduit à des agrégats cellulaires trop volumineux, tout en évitant la surdissociation, qui produit un nombre excessif de cellules uniques. En contrôlant précisément l’étendue de la dissociation, nous avons obtenu des structures organoïdes relativement uniformes, améliorant la cohérence des traitements pharmacologiques ultérieurs et des tests de viabilité de l’ATP.

Nous avons utilisé un système de culture à haut débit de 96 puits et standardisé le volume de placage de la membrane du socle à 6 μL par puits. Cette standardisation minimise la variabilité entre puits en assurant une densité organoïde cohérente et des caractéristiques de croissance dans tous les puits, améliorant ainsi la reproductibilité expérimentale et la comparabilité des données. En associant les analyses de luminescence ATP à des analyses de la courbe dose-réponse à l’aide d’un logiciel d’analyse statistique des données, nous avons obtenu une évaluation quantitative robuste des variations de viabilité organoïde après exposition au CD. Collectivement, cette étude établit un protocole expérimental hautement reproductible pour l’application de modèles organoïdes en toxicologie environnementale et exposition aux métaux lourds.

Lors de la culture des CO, un mélange approfondi du pellet crypt avec la matrice membranaire du socle est une étape cruciale pour assurer une formation adéquate des COs et une croissance stable. La proportion de la matrice membranaire basale doit être maintenue au-dessus de 70 % (le volume de la matrice de la membrane basale > 70 %). Les volumes recommandés pour la matrice membranaire du socle sont de 6 μL par puits pour les plaques à 96 puits, 20 μL par puits pour les plaques à 48 puits, et 25 μL par puits pour les plaques à 24 puits. Après polymérisation matricielle, ajoutez les volumes suivants aux puits : 100 μL par puits pour les plaques à 96 puits, 300 μL par puits pour les plaques à 48 puits, et 500 μL par puits pour les plaques à 24 puits. Il convient de veiller à éviter la pipetation directe du milieu sur les dômes de matrice membranaires du socle, car cela pourrait perturber l’architecture tridimensionnelle. Pour préserver la stabilité phénotypique et génétique, cette étude a limité l’utilisation des organoïdes colorectaux à un maximum de 4 passages.

Lorsque les cryptes ou les COs atteignent un diamètre d’environ 600 μm ou présentent un assombrissement et un arrêt de croissance, le passage doit être effectué rapidement afin de permettre des analyses de sensibilité ultérieures. Lors de la dissociation enzymatique des CO, la digestion doit être surveillée au microscope. Si les COs ne sont pas suffisamment dissociés en petits groupes cellulaires ou en cellules uniques, le temps de digestion peut être progressivement prolongé en fonction de la taille organoïde et du statut de dissociation. Il faut éviter une digestion prolongée en une seule étape afin de minimiser le risque de surdigestion et de perte de viabilité cellulaire.

Calculez la viabilité relative pour chaque puits à l’aide de l’équation suivante, et utilisez le pourcentage moyen des puits réplicés comme valeur de réponse pour chaque concentration

 

Le test de bioluminescence ATP est basé sur l’oxydation catalysée de luciférase luciférase de D-luciférine, ce qui entraîne l’émission de photons. En raison de sa grande sensibilité, de sa compatibilité avec les formats à haut débit à base de plaques, et de la disponibilité de kits commerciaux standardisés, cette méthode a été largement appliquée pour le dépistage préliminaire de toxicité dans les modèles^{organoïdes 17}.

Plusieurs facteurs de confusion doivent être pris en compte. Certains produits chimiques peuvent inhiber directement la réaction enzymatique de la luciférase par interférence chimique ou suppression enzymatique, conduisant à un refroidissement du signal. La luminescence de fond issue de la matrice extracellulaire tridimensionnelle, l’hétérogénéité de la taille et de la densité organoïdales, ainsi que la lyse incomplète peuvent introduire une variabilité importante entre puits et entre lots. La luminescence basée sur l’ATP seule ne peut pas distinguer avec précision les modalités de mort cellulaire ni élucider les mécanismes toxicologiques^{sous-jacents 18}.

Pour renforcer la fiabilité méthodologique, des mesures systématiques de contrôle qualité sont recommandées. l’utilisation de tampons de lyse recommandés par le fabricant ou validés précédemment, ainsi que des cycles de lyse prolongés, de dissociation mécanique ou de gel-dégel lorsque nécessaire pour améliorer l’efficacité de la lyse cellulaire au sein de la matrice. Deuxièmement, réaliser des expériences de récupération par spik-in d’ATP lors de l’optimisation par test afin d’évaluer l’inhibition directe potentielle de la réaction luminescente par les composés testés ou l’environnement de lyse. Troisièmement, confirmez la plage de détection linéaire à l’aide d’une courbe standard ATP et contrôlez strictement le timing entre l’ajout des réactifs, l’incubation et la lecture des plaques afin de minimiser la variabilité technique. Enfin, inclure des contrôles blancs, véhicules et négatifs dans chaque dossage et intégrer suffisamment de réplications techniques pour évaluer et corriger les effets de contour et les variations liées au lot. Récemment, plusieurs tests de viabilité optimisés pour les organoïdes ont été développés avec une chimie de lyse améliorée et une stabilité du signal accrue, et ces formulations ont généralement démontré une performance supérieure dans les tests de toxicité^{tridimensionnelle 19}. En résumé, cette étude a utilisé des COs humains comme modèle in vitro de toxicologie environnementale des métaux lourds et a mis en place un test à haut débit et sensible basé sur la bioluminescence de l’ATP pour évaluer la susceptibilité aux organoïdes à l’exposition au CD. Ce travail fournit une référence expérimentale pratique et une orientation méthodologique pour l’évaluation de la toxicité dans les systèmes de recherche à base d’organoïdes.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
100 μm cell strainer	BIOLOGIX	15-1100
15 mL centrifuge tubes	BIOFIL	CFT011150
1mL pipette tips	Zhejiang Baidi Biotechnology Co., LTD	H808633
200 μL pipette tips	Zhejiang Baidi Biotechnology Co., LTD	H808214
24-well plates	Corning Incorporated	3524
50 mL centrifuge tubes	CLUXCELL	321050
96-well plates	Corning Incorporated	220400
BioTek Cytation 5	BioTek Co., LTD	16280004	Le logiciel opérationnel pour un lecteur de microplaques spécifique.
Cadmium chloride,10g	Sigma	202908-10G
Cell Counting-Lite 3D Luminescent Cell Viability Assay	Vazyme	DD1102-01/02/03	Réactif de viabilité luminescent dans un rapport volumétrique de 1:1.
Human Colonic organoid Kit Plus(Expansion)	Mogenel Biotechnology	MA-0817HOO1HLP
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	thermo fisher	6125552
Forceps	Beyotime	FS019
Ice box	Beyotime	FBX078
Low-temperature high-speed centrifuge	Anhui Zhongke Zhongjia Scientific Instrument Co., LTD	KDC-40
Matrigel	Mogenel Biotechnology	82755	La matrice de membrane basale
Organoid Dissociation Solution	Mogenel Biotechnology	MB-0818L01L	Solution de dissociation d'organoïde
Penicillin-Streptomycin	Beyotime	C0222
Phosphate-buffered saline (1XPBS)	Fdbio Science Biotech Co.,Ltd	FD7032
Pipettes	RUINING	Pipet-Lite XLS
GraphPad Prism 8.0	GraphPad Software		Le logiciel opérationnel pour un lecteur de microplaques spécifique.
Scissors	Beyotime	FS001
Tissue Digestion Solution	Mogenel Biotechnology	MB-0818L06L/MB-0818L06S