Article de méthode

Isolement et application thérapeutique de vésicules extracellulaires dérivées d’agrégats de cellules souches mésenchymateuses auto-assemblées

DOI :

10.3791/70534

⸱

24 avril 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Oral & Maxillofacial Reconstruction and Regeneration, National Clinical Research Center for Oral Diseases, Shaanxi International Joint Research Center for Oral Diseases, Center for Tissue Engineering, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, 2Department of Orthodontics, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, 3Department of Stomatology, Jiuquan Satellite Launch Center Hospital, 4The second Department of Surgery, Jiuquan Satellite Launch Center Hospital, 5Military Medical Innovation Center, The Fourth Military Medical University, 6School of Basic Medicine, Shaanxi University of Chinese Medicine, 7Department of Traditional Chinese Medicine, The First Affiliated Hospital of The Fourth Military Medical University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole détaille l’isolation efficace de grandes vésicules extracellulaires (LEV) à partir d’agrégats de cellules souches auto-assemblées et leur application thérapeutique pour la régénération osseuse mandibulaire.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les vésicules extracellulaires (EV) sont des médiateurs essentiels de la communication intercellulaire et des agents libres cellulaires prometteurs pour la médecine régénérative. Parmi les sous-populations de VE, les grandes vésicules extracellulaires (LEV) sont particulièrement adaptées à la réparation tissulaire en raison de leur charge pro-régénérative enrichie. Cependant, les méthodes standardisées et reproductibles pour générer des LEV fonctionnelles dérivées des cellules souches dentaires pour une caractérisation en aval et une évaluation thérapeutique restent limitées. En utilisant le potentiel ostéogénique exceptionnel des cellules souches issues de la papille apicale (SCAP), nous avons développé un modèle de culture 3D dans des conditions de faible adhésion pour induire des agrégats SCAP auto-assemblés. Ce modèle imite la condensation mésenchymale physiologique, améliorant significativement les interactions cellule-cellule et augmentant la sécrétion de LEV. Des paramètres clés de culture et des notes de manipulation sont fournis pour améliorer la cohérence des agrégats et maximiser la production de LEV tout en maintenant la viabilité cellulaire. Ici, nous présentons un protocole standardisé pour la production efficace de LEVs fonctionnels dérivés du SCAP, englobant la génération d’agrégats 3D, l’isolement par centrifugation différentielle, l’analyse de la distribution et de la concentration des particules basées sur l’analyse de suivi des nanoparticules (NTA), ainsi que la délivrance thérapeutique à l’aide d’un hydrogel thermoréticulé pour la réparation des défauts osseux mandibulaires. Cette approche rationalise la production de LEV pour les études mécanistiques en aval et l’évaluation préclinique de la régénération craniofaciale. Ce flux de travail optimisé garantit la préparation reproductible de LEVs bioactifs avec des rendements constants et une charge pro-ostéogénique enrichie, facilitant la recherche fondamentale et accélérant la traduction clinique de la reconstruction cranio-faciale médiée par EV. Dans les applications représentatives, les LEV chargés en hydrogel fournissent un dépôt localisé aux sites de défaut et facilitent la manipulation pratique lors de l’implantation. Collectivement, cette méthode offre une plateforme évolutive pour préparer des LEVs dérivés de SCAP et met en lumière les points clés pour la standardisation des rapports et la conception d’études translationnelles. Cette approche favorise une adoption plus large dans les laboratoires de VE craniofaciaux.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les vésicules extracellulaires (EV) sont des nanoparticules membranaires libérées par les cellules qui médiatisent la communication intercellulaire via le transfert de cargaisons bioactives telles que les protéines, les miARN et les lipides 1,2,3. Parmi les sous-populations de VE, les grandes vésicules extracellulaires (LEV) se distinguent par leur libération directe de la membrane cellulaire et leur enrichissement inhérent de molécules pro-régénératives, ce qui les rend bien adaptées aux besoins de réparation et de régénérationtissulaire 4,5. En médecine régénérative, les VE dérivés de cellules souches mésenchymateuses (MSC) sont de plus en plus reconnus comme une alternative viable sans cellules à la thérapie à cellulesentières 6,7,8. Ils reprennent les effets régénérateurs paracrins des CMS parentales tout en évitant les limitations de la transplantation cellulaire directe, telles que la faible efficacité d’engrevoir, l’immunogénicité et la variabilité des lots 7,8,9,10. Parmi les sources de MSC, les cellules souches issues de la papille apicale (SCAP) présentent un potentiel de différenciation ostéogénique et odontogéniquesupérieur 11,12,13, rendant les EV dérivés du SCAP particulièrement attractifs pour la réparation orofaciale des os et des tissus dentaires 8.

Notamment, la biogenèse et la fonctionnalité des VE sont profondément influencées par le microenvironnement cellulaire14,15. Les cultures monocouches bidimensionnelles conventionnelles (2D) s’écartent significativement du contexte tissulairenatif 16,17, produisant fréquemment des EV avec une capacité régénérativecompromise 18. En revanche, les agrégats MSC auto-assemblés en trois dimensions (3D) reproduisent des aspects clés de la condensation mésenchymale physiologique, un stade de développement caractérisé par une forte densité cellulaire, un contact intensif cellule-cellule et une matrice extracellulaire enrichie (ECM), qui fournit un soutien structurel et délivre des indices biochimiques et mécaniques régulant l’adhésion, la migration et les décisions de destincellulaires 19,20,21 . Ce microenvironnement 3D biomimétique améliore non seulement la communication intercellulaire et la signalisationparacrine 22,23, mais favorise également la sécrétion de VE avec un rendement plus élevé et des profils de cargaison bioactifsaméliorés 24,25,26. L’utilisation d’agrégats MSC auto-assemblés 3D s’avère ainsi une stratégie très prometteuse pour obtenir des VE fonctionnellement puissants pour des applicationsrégénératives 18.

Malgré les avantages évidents des VE dérivés des agrégats, les protocoles standardisés pour leur isolation et leur caractérisation à partir des systèmes 3D restent sous-développés. Les méthodologies actuelles d’isolation des VE, telles que la centrifugation différentielle, sont bien établies et offrent un cadre évolutif pour la productionde véhicules électriques 27. De même, des méthodes de production d’agrégats MSC ont été rapportées, souvent reposant sur un enroulement cellulaire induit par la vitamine C et son agrégation à partir de cellules cultivéesen 2D. Cependant, l’architecture de la MCE au sein de ces agrégats induits par la vitamine C peut encore différer du microenvironnement spatialement organisé, semblable à la condensation, des tissus mésenchymiques natifs. En revanche, l’auto-assemblage sans échafaudage dans des conditions de faible adhésion facilite la formation d’agrégats compacts sphériques qui se rapprochent des caractéristiques clés de la condensationmésenchymatouse 19,29. Actuellement, un flux de travail systématique et reproductible pour isoler et appliquer les VE à partir de tels agrégats SCAP 3D à faible adhésion fait défaut. D’un point de vue pratique, la production de LEV à partir de cultures SCAP 2D conventionnelles se situe généralement dans la fourchette de ~10 11 particules/mL selon l’analyse de suivi des nanoparticules (NTA), et l’agrégation 3D à faible adhésion devrait augmenter la production LEV de plusieurs fois tout en maintenant la reproductibilité pour les applications en aval. Pour combler cette lacune, nous détaillons ici un protocole complet qui exploite la fonctionnalité ostéogénique/odontogénique inhérente aux SCAP et optimise le microenvironnement MSC grâce à l’agrégation 3D à faible adhésion. Ce protocole permet la production fiable de LEVs de haute qualité, fournissant un outil standardisé pour faire progresser les thérapies régénératives sans cellules en médecine craniofaciale.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par le Comité de soins et d’utilisation des animaux de la Quatrième Université de médecine militaire et ont été menées conformément aux directives ARRIVE. La collecte et l’utilisation d’échantillons humains ont été approuvées par le Comité d’éthique de la Quatrième Université de médecine militaire (approbation n° IRB-REV-2022187). Un consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les donneurs avant la collecte de l’échantillon ; Pour les donneurs mineurs ou autrement incapables de donner leur consentement, un consentement éclairé écrit était obtenu de leurs tuteurs légaux. Tous les réactifs étaient filtrés par stérile, et les procédures de culture cellulaire étaient réalisées dans un cabinet de biosécurité pour maintenir la stérilité (voir Tableau des matériaux). Considérez tous les matériaux d’origine humaine (dents, tissus, cellules primaires, milieux conditionnés et préparations EV) comme potentiellement infectieux. Effectuer toutes les procédures impliquant des échantillons humains dans un cabinet de biosécurité certifié en utilisant un équipement de protection individuelle (EPI) approprié, incluant une blouse de laboratoire, des gants et une protection oculaire. Pour la biosécurité et l’élimination des déchets, suivez les directives institutionnelles BSL-2 : manipuler tous les matériaux d’origine humaine et les objets jetables contaminés comme déchets biohazard BSL-2 ; Décontaminez les surfaces/équipements avec un désinfectant approuvé par l’institution après utilisation. Collectez les déchets biologiques liquides dans des contenants marqués et inactivez-les selon des méthodes approuvées avant leur élimination. Jetez immédiatement les objets tranchants dans des contenants approuvés (sans recap). Traiter les tissus/carcasses animales et les résidus anesthésiques/chimiques comme des déchets biologiques/chimiques réglementés et les éliminer via les services institutionnels conformément à la réglementation applicable.

1. Isolement et culture des SCAP humains

REMARQUE : Le P/S est un mélange bioactif d’antibiotiques et peut provoquer des irritations cutanées/oculaires ou des réactions allergiques. Poignée dans un meuble de biosécurité BSL-2 lors de l’ouverture ; porter des gants et une protection oculaire ; éviter la production d’aérosols ; et d’éliminer les déchets conformément aux directives institutionnelles sur les déchets chimiques. La collagénase de type I (solution) est une enzyme bioactive qui peut provoquer des irritations de la peau ou des yeux ou des réactions allergiques. Poignée dans un armoire de biosécurité BSL-2 ; porter des gants et une protection oculaire ; éviter les éclaboussures et la génération d’aérosols lors du pipettage ; et décontaminer rapidement les déversements conformément aux procédures institutionnelles. Protéger la collagénase de type I de la lumière pendant le stockage et l’utilisation (voir le tableau des matériaux).

  1. Prélever les troisièmes molaires avec des apes immatures auprès de donneurs sains (16–21 ans) et rincer soigneusement avec du sérum physiologique tamponné phosphate (PBS) contenant 1 % de pénicilline/streptomycine (P/S) (voir le tableau des matériaux).
  2. Disséquez le tissu de la papille apicale à partir de l’apex radiculaire à l’aide d’une pince et d’une ciseaux ophtalmiques stériles, puis de le réduire en petits fragments (<1mm 3).
  3. Transférez tous les fragments de tissu dans un tube centrifugeuse de 15 mL. Digérez les fragments avec 2 mg/mL de collagénase de type I à 37 °C pendant 1 heure, en secouant doucement toutes les 15 minutes.
  4. Arrêter la digestion en ajoutant un volume égal de α-minimum complet de milieu essentiel (α-MEM) (voir Tableau des matériaux).
    REMARQUE : Le temps de digestion de la collagénase de type I n’est pas fixe et dépend du statut digestif des tissus. Surveillez de près, interrompez la digestion lorsque les tissus deviennent semi-érodés en ajoutant un substrat. Une surdigestion peut altuer la viabilité cellulaire.
  5. Centrifugez la suspension de la cellule à 100 × g pendant 5 minutes à 4 °C, jetez le surnageant et résuspendez la pastille dans 2 mL de α-EM complet.
  6. Semez la suspension tissulaire digérée dans une boîte de Petri de 10 cm et ajoutez 8 mL de α-MEM complète à un volume final de 10 mL par bol.
  7. Cultivez les SCAP à 37 °C dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO₂.
    REMARQUE : En surveillant les cultures en continu, les cellules migrent généralement hors des fragments de tissu et s’attachent à la boîte en un motif radial en 3 à 7 jours. Si la viabilité tissulaire est faible ou qu’aucune migration cellulaire n’est observée dans les 5 jours, passez à un α-MEM complet complété par un sérum à 20 %.
  8. Pour le passage cellulaire, les cellules ont été lavées avec 5 mL de PBS afin d’éliminer le milieu résiduel une fois la confluence de 80–90 %. Par la suite, ils ont été incubés avec 2 mL de trypsine-1 mM d’EDTA à 37 °C pendant 2 minutes (voir Tableau des matériaux).
    REMARQUE : La trypsine à l’EDTA est un irritant et peut endommager la peau et les yeux. Manipulez avec des gants et une protection oculaire, évitez les éclaboussures et la formation d’aérosols, et rincez immédiatement avec beaucoup d’eau en cas de contact. Éliminer les déchets liquides contenant de la trypsine conformément aux directives institutionnelles.
  9. Lorsque les cellules deviennent arrondies avec des jonctions intercellulaires perturbées au microscope, détachez doucement les cellules de la boîte sans dommages structurels excessifs. Neutralisez la trypsine en ajoutant 4 mL de α-EM complet.
  10. Collectez les cellules par pipetage doux et répété dans un tube centrifuge neuf de 15 mL. Après centrifugation à 100 × g pendant 5 minutes, jetez le surnageant et remettez la pelote en suspension complète en α-MEM. Semez les cellules en suspension dans des plats de culture frais ou des plateaux de puits. Remplacez le médium tous les deux jours.
    REMARQUE : Assurez-vous que les SCAP utilisés pour la culture des agrégats se trouvent dans le passage 5. La capacité de tige et d’agrégation diminue avec l’augmentation du nombre depassages 30,31, ce qui peut réduire l’efficacité de la formation et la performance fonctionnelle des agrégats.

2. Auto-assemblage des agrégats SCAP

  1. Récolter 3 à 5 SCAP par trypsinisation, centrifuger à 100 × g pendant 5 minutes, puis resuspendre dans α-MEM complété avec 10 % de sérum fœtal épauvri en EV (FBS) et 1 % de P/S (voir Tableau des matériaux).
    REMARQUE : Préparez un FBS épuisé en EV en centrifugant le FBS à 150 000 × g à 4 °C pendant la nuit pour éliminer les VE et autresimpuretés 32.
  2. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et semer 1 × 1010 cellules par puits dans des plaques à attachement ultra-faible à 24 puits. Ajustez le volume moyen à 500 μL par puits pour maintenir un état de suspension.
  3. Incubez les plaques à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant 72 heures, puis remplacez le milieu de culture toutes les 48 heures.
  4. Surveillez la formation des agrégats quotidiennement sous un microscope optique inversé. Collectez les VE lorsque les agrégats atteignent un diamètre de 200 à 400 μm et présentent une structure compacte aux bords lisses.
    REMARQUE : Définissez un « lot » de production comme des LEVs isolés du milieu conditionné collecté à partir d’agrégats SCAP ensemencés le même jour à partir du même passage cellulaire et maintenus sous des conditions de culture identiques dans une seule fenêtre de collecte (72 h). Traiter chaque lot indépendamment par centrifugation. Remplacez le milieu de culture à 48 h après le semis et reconstituez avec le même volume de milieu frais. Pour la production de LEV, collectez le milieu conditionné à 48 h puis à nouveau à 72 h après le semis, puis regroupez les milieux récoltés (0–48 h et 48–72 h fractions) en un seul lot. Gardez le milieu conditionné en pool à 4 °C et traitez-le pour l’isolation des LEVs.

3. Isolation et caractérisation des VE à partir des agrégats SCAP

  1. Centrifugation différentielle pour l’isolement de grands LEV
    1. Collectez le milieu de culture contenant les agrégats SCAP dans des tubes centrifugeuses de 15 mL.
    2. Centrifugez à 800 × g pendant 10 minutes à 4 °C pour retirer les agrégats intacts et les gros débris de cellules.
    3. Transférer le surnageant dans de nouveaux tubes de 15 mL et centrifuger à 2 500 × g pendant 15 minutes à 4 °C pour éliminer les plaquettes résiduelles et les petits fragments cellulaires.
    4. Transférez soigneusement le surnageant dans des tubes coniques stériles de 1,5 mL et centrifugez à 16 800 × g pendant 30 minutes à 4 °C pour pelleter les LEVs.
      REMARQUE : Utilisez des tubes coniques de 1,5 mL pour augmenter le rendement des LEVs.
    5. Jetez le surnageant, resuspendez la pellete dans 1 mL de PBS stérile, puis centrifugez à nouveau à 16 800 × g pendant 30 minutes à 4 °C en utilisant un rotor à angle fixe (compatible avec une centrifugeuse standard sur établi) pour pelleter les LEV.
    6. Réglez la décélération/frein sur un réglage « lent » ou « bas » (généralement niveau 1 ou 2) pour éviter la resuspension du pellet LEV lors de la phase finale de décélération.
    7. Jetez le surnageant et resuspendez la dernière pellete LEV dans 50 μL de PBS stérile. Utilisez la suspension immédiatement (dans les 24 heures) ou stockez-la à 4 °C. Évitez la congélation pour minimiser la perte de bioactivité.
      REMARQUE : Préparez environ 80 puits d’agrégats pour obtenir suffisamment de LEVs pour des expériences typiques en aval. Les échantillons de LEVs sont recommandés pour une caractérisation immédiate ou une application thérapeutique plutôt qu’un stockage à long terme. Si un stockage plus long est nécessaire, aliquotez la suspension LEV (par exemple, 5 à 10 μL par tube) pour éviter les fluctuations répétées de température et les cycles de gel-dégel. Congelez instantanément les aliquotes sur de la glace sèche et les stockez à −80 °C pour un stockage prolongé à court terme (par exemple, jusqu’à 1 à 3 mois). Dégelez une fois sur la glace et utilisez immédiatement. Notez que la congélation peut réduire la bioactivité et modifier la récupération/la distribution de la taille des particules ; par conséquent, dans la mesure du possible, réalisez des études fonctionnelles à l’aide de LEVs fraîchement préparés. Pour le contrôle qualité après stockage, remesurez la concentration et la distribution de taille des particules à l’aide de NTA, et ne procédez que si les valeurs restent dans la plage d’acceptation prédéfinie. De plus, dans ce protocole, la concentration de particules NTA est utilisée comme méthode principale de quantification pour éviter la perte de vésicules associées aux tests protéiques comme le BCA, maximisant ainsi le rendement pour les applications en aval.
  2. NTA pour la taille et la concentration des particules
    REMARQUE : L’ATN est réalisée à l’aide d’un analyseur de suivi de nanoparticules disponible dans le commerce (voir Tableau des matériaux) pour évaluer la répartition de la taille et la concentration des particules.
    1. Diluez 1 μL de suspension LEVs (de la Section 3.1, Étape 6) dans 1 499 μL de PBS stérile dans un tube conique stérile de 1,5 mL et mélangez soigneusement.
    2. Lance le logiciel compatible et remplis la cellule d’échantillonnage avec 10 mL d’eau ultrapure. Confirmez que le nombre de particules de fond est < 10 par image pour garantir la propreté du système ( voir Tableau des matériaux).
    3. Calibrez l’instrument avec une solution standard préparée. Réglez les paramètres du logiciel à : Sensibilité 70, Obturateur 70, Zone minimale 5, et Luminosité minimale 20. Effectuez un « AutoAlignement » pour vous assurer que le laser est bien focalisé. Ajustez la dilution standard jusqu’à ce que le nombre de particules affiché dans le logiciel soit de 50 à 400 (de préférence ~200), puis exécutez le programme d’étalonnage.
      REMARQUE : Préparez la solution standard en reconstituant 1 μL de billes d’étalonnage dans 1 mL d’eau distillée pour obtenir une solution primaire. Diluez 100 μL de la solution primaire dans 25 mL d’eau distillée (dilution 1:250 000) et conservez à 4 °C pendant jusqu’à 1 semaine.
    4. Rincez la cellule échantillon avec 5 mL d’eau distillée avant l’analyse.
    5. Rincez le canal avec 1 mL d’eau distillée et confirmez que le nombre de particules sur l’interface de détection est <10.
    6. Injectez 1 mL de l’échantillon dilué de LEVs à une vitesse constante de 0,5 mL/s à l’aide d’une seringue stérile de 1 mL.
      ATTENTION : Contrôlez manuellement la seringue pour maintenir une vitesse d’injection stable.
    7. Effectuer des analyses de particules et générer des rapports. Dans le logiciel, créez une nouvelle mesure et sélectionnez le mode Taille/Concentration. Réglez l’acquisition à 3 enregistrements, 60 secondes par enregistrement, à 25 °C en utilisant les mêmes paramètres de détection que lors de l’étape 3 (Sensibilité 70, Obturateur 70, Zone minimale 5, Luminosité minimale 20).
    8. Commencez l’acquisition et vérifiez que le nombre de particules à l’écran reste dans un intervalle de 50 à 400 particules/image (de préférence ~200) ; s’il est hors de cette plage, arrêtez et ajustez la dilution de l’échantillon, puis répétez l’étape 6. Après l’acquisition, effectuez l’analyse pour obtenir la taille moyenne, la taille du mode, D10/D50/D90, et la concentration des particules (particules/mL). Ensuite, exportez les résultats et les graphiques de répartition des tailles en .csv et .pdf (ou formats de rapport équivalents) et enregistrez le fichier de mesure pour la tenue des registres.

4. Application thérapeutique des LEV dans la régénération osseuse mandibulaire

  1. Préparation de l’hydrogel chargé en LEV
    1. Préparez le stock du Pluronic F-127 (20 % en vaisseau). Ajoutez la poudre pluronique F-127 à un PBS stérile jusqu’à une concentration finale de 20 % (p/v) et remuez à 4 °C toute la nuit jusqu’à ce qu’elle soit complètement dissoute et homogène (voir Tableau des matériaux). Gardez la solution à 4 °C pendant la préparation pour éviter une gélification prématurée.
      REMARQUE : 20 % (v/p) du F-127 pluronique est liquide à 4 °C et subit une thermogélation à ~20–25 °C (dépendant du tube/pièce) ; il devient un gel stable à 37 °C.
    2. Chargez les LEVs par temps froid. Pré-refroidissez les tubes, les pointes de pipette et l’hydrogel à 4 °C. Mélangez des LEVs de 50 μg (équivalents aux LEVs de deux plaques de 24 puits d’agrégats) avec 1 mL de F 127 pluronique à 20 % par pipetage doux et un brève vortex à basse vitesse pour assurer une distribution uniforme. Maintenez le mélange sur la glace ou à 4 °C jusqu’à l’implantation.
    3. Conseils de manipulation/utilisation (pour la reproductibilité). Effectuez le chargement et le chargement par seringue/embout rapidement sur la glace. Si le mélange se réchauffe au-dessus de ~20–25 °C, la viscosité augmente et la gélification peut commencer ; dans ce cas, revenir à 4 °C jusqu’à ce que le matériau devienne à nouveau pleinement fluide avant utilisation. Après la pose dans le défaut, laissez la gélification sur place à température corporelle (37 °C).
  2. Établissement du modèle de défaut de l’os mandibulaire murin
    1. Anesthésez des souris C57Bl/6 (mâles ou femelles) de 8 semaines par injection intrapéritonéale de pentobarbital sodique (50 mg/kg) (voir Tableau des matériaux).
      ATTENTION : Le pentobarbital sodique est un puissant sédatif/anesthésique et est toxique pour l’humain s’il est injecté, ingéré ou inhalé accidentellement. Préparez et administrez selon des pratiques sûres pour les objets tranchants (ne pas recapsuler les aiguilles ; jeter immédiatement dans un contenant pour objets tranchants), porter des gants et une protection oculaire, éviter le contact cutané et conserver/enregistrer l’utilisation conformément aux politiques institutionnelles de contrôle des drogues. Confirmez une anesthésie correcte chez les souris en vérifiant l’absence du réflexe cornéen et l’absence de retrait des membres lors d’une pincée des coussinets du pied. Appliquez une pommade protectrice pour éviter le dessèchement cornéen.
    2. Raser le poil sur la région mandibulaire gauche et désinfecter alternativement avec 10 % de povidone-iode et 75 % d’éthanol.
      ATTENTION : L’éthanol à 75 % est hautement inflammable ; Utilisez-le loin des sources d’allumage et assurez-vous d’assurer une bonne ventilation. L’iode de povidone peut provoquer des irritations cutanées ou oculaires ou des réactions allergiques ; Portez des gants, évitez le contact avec les yeux ou la muqueuse, et nettoyez rapidement les déversements.
    3. Réaliser une incision longitudinale de 1 cm le long du bord mandibulaire et disséquer les tissus mous de façon franche pour exposer l’angle mandibulaire.
    4. Créez un défaut osseux circulaire (de 2 mm de diamètre) à l’aide d’une perceuse dentaire avec irrigation saline continue afin d’éviter les dommages thermiques ( voir Tableau des matériaux).
      ATTENTION : Surveillez de près les saignements intraopératoires, contrôlez les hémorragies avec de petites boules de coton pour maintenir un champ chirurgical dégagé et réduisez le risque d’infection. Évitez de toucher les tissus mous environnants avec la perceuse pour éviter l’emmêlement.
  3. Implantation d’hydrogel chargé en LEV
    1. Chargez le mélange LEV-hydrogel dans une seringue stérile et injectez-le dans le défaut osseux, assurant ainsi un remplissage complet.
      REMARQUE : Administrez ~10 μg de LEVs par souris. Deux plaques de 24 puits d’agrégats SCAP sont nécessaires pour fournir suffisamment de LEVs pour une expérience avec n = 5 souris.
    2. Pour le groupe témoin, injecter un volume égal d’hydrogel pluronique F-127 sans LEV.
    3. Suturez l’incision avec des sutures absorbables 4-0 et administrez des analgésiques sous-cutanées (Carprofène, 5 mg/kg) pour soulager la douleur postopératoire (voir Tableau des matériaux).
      ATTENTION : Le carprofène est un AINS pharmacologiquement actif et peut être nocif s’il est injecté accidentellement ou en contact avec la peau ou les yeux. Portez des gants, évitez les blessures par objets tranchants, jetez les aiguilles/seringues dans un contenant à objets tranchants, et jetez les médicaments inutilisés et les matériaux contaminés selon les procédures institutionnelles de gestion des déchets pharmaceutiques.
    4. Placez les souris sur une couverture de réchauffement jusqu’à leur convalescence après l’anesthésie, puis transférez-les dans des cages individuelles avec libre accès à nourriture et eau.
      REMARQUE : Ne laissez pas les souris sans surveillance tant qu’elles n’ont pas retrouvé suffisamment de conscience pour maintenir la couchée sternale. Ne ramener les souris en logement collectif qu’après une récupération complète.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Selon le flux de travail expérimental, des étapes clés, notamment l’isolement du SCAP, la formation des agrégats, l’extraction des LEVs et l’implantation thérapeutique, ont été exécutées avec succès (Figure 1). Les troisième molaires incluses cliniques de donneurs présentaient des apes immatures avec du tissu papillaire apicale intact attaché autour des orifices de canal radiculaire ouverts, confirmant la source appropriée du SCAP (Figur...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’intérêt croissant pour les thérapies régénératives sans cellules a positionné les LEVs dérivés des cellules souches mésenchymateuses comme des alternatives prometteuses à la transplantation de cellules entières, grâce à leur capacité à délivrer des molécules bioactives sans les risques associés aux approches cellulaires. Cependant, la traduction clinique des thérapies basées sur le LEV a été entravée par l’absence de systèmes de culture physiologiquement pertinents capables de préserve...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs déclarent ne pas exister de conflit d’intérêts.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par des subventions du Programme national clé de recherche et développement de Chine (2021YFA1100600), de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82471011, 82401201), du projet du Laboratoire clé d’État de reconstruction orale et maxillo-faciale et de régénération (2024MS04), de la Fondation scientifique postdoctorale chinoise (BX20230485) et du projet de coopération et d’échange de laboratoires partenaires de la Quatrième Université de médecine militaire (2024HB014).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1 mL de seringue avec aiguilleBD300841Anesthésiation
Plat de culture cellulaire de 10 cmCorning353003Culture cellulaire
Tube centrifugeuse en polystyrène de 15 mLCorning352095Culture cellulaire
Désinfectant à 75 % d’éthanolHai Shi Hai NuoHS-750Fonctionnement
Suture Absorbable 4-0Jinhuan MedicalR413Fonctionnement
Centrifugeuse de laboratoireWIGGENSCE187Isolation des véhicules électriques
Incubateur CO2, 150 L, type universelThermoFisher51032874Culture cellulaire
Collagénase de type IThermoFisher17100017Culture cellulaire
Boules de cotonDeroyal30-033Fonctionnement
Ciseaux courbes d’opérationInstrument chirurgical JZJ21040Fonctionnement
Unité de turbine mobile dentaireKaVoS609CFonctionnement
Balancière électroniqueZhi KeZK-DSTCulture cellulaire
Tube d’EppendorfEppendorf3810XIsolation des véhicules électriques
Pince, très bienInstrument chirurgical JZJD1020Fonctionnement
Crème dépilatoireVeet1.00097E+11Fonctionnement
Boule à grande vitesseDentsply SironaE0123Fonctionnement
Pièce à main à grande vitesseKaVoKV-1-008-1644Fonctionnement
Microscope inverséMshotMF53-NCulture cellulaire
MEM & alpha ; (Moyen Essentiel Minimum &alpha ;)ThermoFisher12561056Culture cellulaire
Microscope vidéo de suivi de nanoparticules PMX-120Particle MetrixZetaView PMX120Analyse du suivi des nanoparticules
Pénicilline-Streptomycine (P/S)ThermoFisher15140122Culture cellulaire
Pentobarbital sodiumSigma-Aldrich57-33-0Anesthésiation
Solution physiologique tamponnée au phosphate (PBS)ThermoFisher10010023Culture cellulaire
Pluronic F-127Sigma-AldrichP2443Implantation des EV
Solution d’iode de povidoneBaxter  ;PROSL500Fonctionnement
Sérum fœtal bovin spécialisé (FBS)ThermoFisher12664025Culture cellulaire
Bloc de gaze stérileVictoire10-000-681Fonctionnement
Microcentrifugeuse à grande vitesse sur tableHitachiCT15EIsolation des véhicules électriques
Trephine DrillBiomet Microfixation01-9182Fonctionnement
Trypsine-EDTAThermoFisher25200072Culture cellulaire
Plaque à attachement ultra-bas à 24 puitsCorning3473Culture cellulaire
Génie à mélangeur vortexIndustries scientifiquesSI0425Implantation des EV

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Qiu, G., et al. Functional proteins of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles. Stem Cell Res. Ther. 10, 359-372 (2019).
  2. Keshtkar, S., Azarpira, N., Ghahremani, M. H. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: novel frontiers in regenerative medicine. Stem Cell Res. Ther. 9, 50-63 (2019).
  3. van Niel, G., D’Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 19, 213-228 (2018).
  4. Rai, A., et al. Proteomic dissection of large extracellular vesicle surfaceome unravels interactive surface platform. J. Extracell. Vesicles. 10, 1-20 (2021).
  5. Ye, T., et al. Large extracellular vesicles secreted by human iPSC-derived MSCs ameliorate tendinopathy via regulating macrophage heterogeneity. Bioact. Mater. 21, 194-208 (2023).
  6. Liang, Z., Luo, Y., Lv, Y. Mesenchymal stem cell-derived microvesicles mediate BMP2 gene delivery and enhance bone regeneration. J Mater Chem B. 8, 6378-6389 (2020).
  7. Olaechea, A., et al. Preclinical Evidence for the use of oral mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in bone regenerative therapy: a systematic review. Stem Cells Transl Med. 12, 791-800 (2023).
  8. Zhang, T., et al. Extracellular vesicles derived from human dental mesenchymal stem cells stimulated with low-intensity pulsed ultrasound alleviate inflammation-induced bone loss in a mouse model of periodontitis. Genes Dis. 10, 161-1625 (2023).
  9. Cai, X. Y., et al. Inflammation-triggered Gli1(+) stem cells engage with extracellular vesicles to prime aberrant neutrophils to exacerbate periodontal immunopathology. Cell Mol Immunol. 22, 371-389 (2025).
  10. Wang, Y., et al. Reciprocal regulation of mesenchymal stem cells and immune responses. Cell Stem Cell. 29, 1515-1530 (2025).
  11. Chalisserry, E. P., Nam, S. Y., Park, S. H., Anil, S. Therapeutic potential of dental stem cells. J Tissue Eng. 29, 1-17 (2017).
  12. Yang, H., et al. Secreted frizzled-related protein 2 promotes the osteo/odontogenic differentiation and paracrine potentials of stem cells from apical papilla under inflammation and hypoxia conditions. Cell Prolif. 53, 1-11 (2020).
  13. Huang, M., Dissanayaka, W. L., Yiu, C. K. Exploring the potential of stem cells from the apical papilla (SCAPs) in regenerative medicine: advantages, applications, challenges, and opportunities. Stem Cell Res Ther. 16, 1-20 (2025).
  14. Jaukovic, A., et al. Specificity of 3D MSC Spheroids Microenvironment: Impact on MSC Behavior and Properties. Stem Cell Rev Rep. 16, 853-875 (2020).
  15. Wang, X., et al. Hypoxia promotes EV secretion by impairing lysosomal homeostasis in HNSCC through negative regulation of ATP6V1A by HIF-1 alpha. J Extracell Vesicles. 12, 1-20 (2023).
  16. Yuste, I., et al. Mimicking bone microenvironment: 2D and 3D in vitro models of human osteoblasts. Pharmacol Res. 169, 1-57 (2021).
  17. Fontana, F., et al. In Vitro 3D cultures to model the tumor microenvironment. Cancers (Basel). 13, 1-16 (2021).
  18. Cook, K., Li, H. Advancing extracellular vesicle production: improving physiological relevance and yield with 3D cell culture. Nanoscale. 17, 15110-15131 (2025).
  19. Sui, B. D., et al. Mesenchymal condensation in tooth development and regeneration: a focus on translational aspects of organogenesis. Physiol Rev. 103, 1899-1964 (2023).
  20. Kobayashi, T., Kronenberg, H. M. Overview of skeletal development. Methods Mol Biol. 2230, 3-16 (2021).
  21. Naba, A. Mechanisms of assembly and remodelling of the extracellular matrix. Nat Rev Mol Cell Biol. 25, 865-885 (2024).
  22. Guo, H., et al. Odontogenesis-related developmental microenvironment facilitates deciduous dental pulp stem cell aggregates to revitalize an avulsed tooth. Biomaterials. 279, 1-16 (2021).
  23. Zhang, J., et al. Functional tissue-engineered microtissue formed by self-aggregation of cells for peripheral nerve regeneration. Stem Cell Res Ther. 13, 1-20 (2022).
  24. Yu, W., et al. Higher yield and enhanced therapeutic effects of exosomes derived from MSCs in hydrogel-assisted 3D culture system for bone regeneration. Biomater Adv. 133, 1-17 (2022).
  25. Kim, M., et al. Three-dimensional spheroid culture increases exosome secretion from mesenchymal stem cells. Tissue Eng Regen Med. 15, 427-436 (2018).
  26. Millan, C., et al. Extracellular vesicles from 3d engineered microtissues harbor disease-related cargo absent in EVs from 2D cultures. Adv Healthc Mater. 11, 1-17 (2022).
  27. Petit, I., Levy, A., Aberdam, D. Purification of extracellular microvesicles secreted by dermal fibroblasts. Methods Mol Biol. 2154, 63-72 (2020).
  28. Li, S., et al. Construction, characterization, and regenerative application of self-assembled human mesenchymal stem cell aggregates. J Vis Exp. (15), e64697(2023).
  29. Sui, B. D., et al. Reconstruction of regenerative stem cell niche by cell aggregate engineering. Methods Mol Biol. 2002, 87-99 (2019).
  30. Mobasseri, R., et al. Peptide-modified nanofibrous scaffold promotes human mesenchymal stem cell proliferation and long-term passaging. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 84, 80-91 (2018).
  31. McMurray, R. J., et al. Nanoscale surfaces for the long-term maintenance of mesenchymal stem cell phenotype and multipotency. Nat Mater. 10, 637-644 (2011).
  32. Cao, Y., et al. Isolation and analysis of traceable and functionalized extracellular vesicles from the plasma and solid tissues. J Vis Exp. 20, e63990(2022).
  33. Baraniak, P. R., McDevitt, T. C. Scaffold-free culture of mesenchymal stem cell spheroids in suspension preserves multilineage potential. Cell Tissue Res. 347, 701-711 (2012).
  34. Li, Y., et al. Lysosome-Featured Cell Aggregate-Released Extracellular Vesicles Regulate Iron Homeostasis and Alleviate Post-Irradiation Endothelial Ferroptosis for Mandibular Regeneration. Adv Sci (Weinh). 12, 1-22 (2025).
  35. Longjohn, M. N., Christian, S. L. Characterizing Extracellular Vesicles Using Nanoparticle-Tracking Analysis. Methods Mol Biol. 2508, 353373(2022).
  36. Cantore, S., et al. Characterization of human apical papilla-derived stem cells. J Biol Regul Homeost Agents. 31, 901-910 (2017).
  37. Wang, Z., et al. Fibroblast growth factor 2 promotes osteo/odontogenic differentiation in stem cells from the apical papilla by inhibiting PI3K/AKT pathway. Sci Rep. 14, 19-35 (2024).
  38. Li, J., et al. TGF-beta2 and TGF-beta1 differentially regulate the odontogenic and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Arch Oral Biol. 135, 1-15 (2022).
  39. Zhang, W., et al. Foxc2 and BMP2 Induce Osteogenic/Odontogenic Differentiation and Mineralization of Human Stem Cells from Apical Papilla. Stem Cells Int. 18, 23-36 (2018).
  40. Man, K., et al. An ECM-mimetic hydrogel to promote the therapeutic efficacy of osteoblast-derived extracellular vesicles for bone regeneration. Front Bioeng Biotechnol. 10, 82-99 (2022).
  41. Ming, L., et al. Small extracellular vesicles laden oxygen-releasing thermosensitive hydrogel for enhanced antibacterial therapy against anaerobe-induced periodontitis alveolar bone defect. ACS Biomater Sci Eng. 10, 932-945 (2024).
  42. Clayton, D. A., Shadel, G. S. Purification of mitochondria by sucrose step density gradient centrifugation. Cold Spring Harb Protoc. 14, 8-28 (2014).
  43. Dos Santos, R. F., Barria, C., Arraiano, C. M., Andrade, J. M. Isolation and analysis of bacterial ribosomes through sucrose gradient ultracentrifugation. Methods Mol Biol. 2016, 299-310 (2016).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Mesenchymal Stem CellsLarge Extracellular VesiclesSCAP Derived LEVs3D Cell CultureDifferential CentrifugationNanoparticle Tracking AnalysisHydrogel DeliveryCraniofacial Regeneration

Articles connexes