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Élucidation des bases matérielles de la formule de Yiqi Qingjie contre la néphropathie à IgA utilisant UHPLC-Q-Orbitrap HRMS intégrée à la pharmacologie en réseau

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DOI :

10.3791/70541

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19 mai 2026

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1Department of Nephrology, Guang'anmen Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences., 2Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences., 3Department of New Drug Research and Development, Guang'anmen Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences.

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit l’utilisation de la chromatographie liquide ultra-haute performance couplée à la spectrométrie de masse haute résolution quadrupole-Orbitrap (UHPLC-Q-Orbitrap HRMS), combinée à la pharmacologie en réseau et au docking moléculaire, afin de prédire et valider la base matérielle de la formule Yiqi Qingjie (YQQJ) pour le traitement de la néphropathie à IgA (IgAN).

Résumé

Cette étude utilise l’UHPLC-Q-Orbitrap HRMS pour caractériser les constituants extrayables par l’eau et absorbés par le sang du YQQJ. La pharmacologie en réseau et le docking moléculaire sont également appliqués pour prédire et vérifier la base matérielle sous-jacente aux effets thérapeutiques du YQQJ contre l’IgAN. L’extrait aqueux et les échantillons séromiques de YQQJ ont été analysés à l’aide de l’UHPLC-Q-Orbitrap HRMS afin de caractériser les constituants chimiques et d’identifier les composés absorbés par le sang. L’identification des composés a été réalisée à partir de bases de données de référence, de la littérature publiée, et d’une évaluation complète du temps de rétention, de la précision de la masse des ions précurseurs, des schémas de fragmentation MS/MS et de la distribution isotopique. Les cibles potentielles des prototypes de composés absorbés par le sang ont été prédites à l’aide de bases de données de prédiction de cibles, tandis que les cibles liées à l’IgAN ont été collectées à partir de plateformes bioinformatiques intégrées. Les cibles principales ont été filtrées via l’analyse du réseau PPI. Un réseau « composé–cible–voie–maladie » a été construit pour identifier les constituants clés, et un amarrage moléculaire a été réalisé pour évaluer les interactions entre les composés de base et les cibles. Un total de 185 composés ont été identifiés dans l’extrait d’eau de YQQJ. Parmi eux, 28 composés sont entrés dans la circulation sanguine sous leurs formes prototypes. L’IPP a identifié 42 cibles principales associées aux effets thérapeutiques du YQQJ dans l’IgAN. Les analyses d’enrichissement KEGG et GO ont montré une implication dans la prolifération cellulaire, l’inflammation, l’apoptose, ainsi que l’enrichissement dans plusieurs voies clés telles que PI3K-Akt, MACK et JAK-STAT. L’analyse du docking moléculaire a prédit des interactions de liaison favorables entre six cibles critiques (CASP3, IGF1R, JUN, STAT3, PRKCB et PIK3CA) et trois composés majeurs absorbés par le sang — acide déacétylasperulosidique, acide géniposidique et Dioscine — avec des énergies de liaison constamment faibles, suggérant des interactions potentielles. Cette analyse intégrée révèle que le YQQJ exerce des effets thérapeutiques contre l’IgAN via de multiples composants et plusieurs cibles. L’acide déacétylasperulosidique, l’acide géniposidique et la diocine sont suggérés comme constituants actifs clés contribuant à ces effets.

Introduction

La néphropathie IgA (IgAN) est l’une des glomérulonéphrite primaires les plus courantes dans le monde. Ses manifestations cliniques sont très hétérogènes, généralement présentées par une hématurie microscopique ou macroscopique, souvent accompagnée de degrés variables de protéinurie, d’hypertension et d’insuffisance rénale. Des études antérieures suggéraient que jusqu’à 40 % des patients progressent vers une insuffisance rénale dans les 20 ans suivant le diagnostic1 ; Cependant, des preuves plus récentes indiquent un pronostic nettement plus mauvais, la plupart des patients développant une insuffisance rénale dans les 10 à 15 ans, et seule une petite proportion conservant une fonction rénale à vie sans progression 2,3,4. Bien que les thérapies ciblées aient récemment permis des avancées cliniques dans la prise en charge de l’IgAN, leur coût élevé et leur efficacité relativement lente restent des défis majeurs, et l’équilibre bénéfice-risque clinique reste sujetà débat 5,6.

La médecine traditionnelle chinoise (MTC) présente des avantages distinctifs dans le traitement des maladies complexes. Elle se caractérise par une efficacité thérapeutique stable, une incidence relativement faible des réactions indésirables et des effets synergiquesmulti-cibles 7. Contrairement aux agents pharmacologiques à cible unique, les formules de la MTC contiennent généralement plusieurs composants bioactifs capables de moduler simultanément diverses voies biologiques. Ce mode d’action multi-composantes et multi-cibles offre un avantage thérapeutique potentiel dans le traitement de maladies complexes telles que l’IgAN8. Dans la théorie de la MTC, l’IgAN n’a pas de nom spécifique de maladie mais est généralement classée sous « hématurie », « œdème », « douleur dorsale », « vents rénaux » et « maladie consumptive ». La plupart des chercheurs considèrent que sa pathogenèse centrale implique une déficience en Qi pulmonaire et de la rate, entraînant une perte de contrôle sur le Qi défensif et, par conséquent, l’invasion du vent, de l’humidité, de la chaleur et des toxines, endommageant finalement les reins. Bien que le rein soit l’organe principal concerné, le cœur, le foie, la rate et les poumons peuvent égalementêtre affectés. Sur la base de cette idée, de nombreuses recherches se sont concentrées sur l’identification de remèdes et formules à base de plantes possédant des propriétés tonifiantes du Qi, consolidant l’extérieur, dépurant la chaleur, détoxificant et résolvant l’humidité pour le traitement clinique de l’IgAN10,11.

La formule Yiqi Qingjie (YQQJ) est une prescription empirique efficace utilisée au département de néphrologie de notre hôpital pour le traitement de l’IgAN. La formule comprend sept herbes, dont Astragalus membranaceus (Huangqi), Lonicera japonica Thunb. (Jinyinhua), Rheum palmatum L. (Dahuang), Hedyotis diffusa Willd. (Baihuasheshecao), Dioscorea nipponica Makino (Chuanshanlong), Spatholobus suberectus Dunn (Jixueteng) et Plantago asiatica L. (Cheqiancao). Le YQQJ exerce des fonctions thérapeutiques de tonifier le Qi, de consolider l’extérieur, de dissiper la chaleur, de détoxifier, d’activer la circulation sanguine et de favoriser ladiurèse 12. Des études cliniques ont démontré que la YQQJ réduit significativement la protéinurie et l’hématurie chez les patients atteints d’IgAN, améliore la fonction rénale et soulage les symptômes immunitaires liés à la muqueuse, tout en présentant un profil de sécurité favorable12,13.

Bien que cette formule ait démontré une efficacité clinique favorable, la base pharmacologiquement active reste difficile à élucider car les formules de la MTC contiennent de nombreux constituants chimiques. Le profilage chimique basé uniquement sur l’analyse chromatographique ou spectrométrique de masse peut révéler la composition chimique globale d’une formule ; cependant, elle ne peut pas déterminer quels composés sont absorbés dans la circulation systémique et contribuent directement aux effetsthérapeutiques 14. De plus, les études conventionnelles en pharmacologie en réseau reposent largement sur des prédictions basées sur des bases de données et criblent généralement les composés candidats en utilisant des paramètres tels que la biodisponibilité orale et la ressemblance du médicament. Cette approche peut négliger les composés qui exercent réellement une activité pharmacologique invivo 15.

Pour remédier à ces limites, des études récentes adoptent de plus en plus des stratégies analytiques intégratives combinant la chromatographie liquide ultra-haute performance couplée avec la spectrométrie de masse hybride quadrupole-Orbitrap (UHPLC-Q-Orbitrap HRMS) en pharmacochimie sérique et la pharmacologie des systèmes dans la rechercheMTC 16,17. La pharmacochimie sérique identifie les composés qui entrent dans la circulation systémique après administration, fournissant ainsi des preuves pharmacokinétiquement pertinentes pour le dépistage des constituants bioactifspotentiels 18. Parallèlement, le UHPLC-Q-Orbitrap HRMS permet une détection et une caractérisation structurale très précises des constituants chimiques au sein de matrices herbalescomplexes 19.

Comparé aux approches reposant uniquement sur le profilage chimique ou la prédiction théorique des cibles, le flux de travail intégratif appliqué dans cette étude — comprenant l’identification des composants basée sur le HRMS UHPLC-Q-Orbitrap, le criblage en pharmacochimie sérique, l’analyse pharmacologique en réseau et la validation du docking moléculaire — offre plusieurs avantages méthodologiques. Le SGR UHPLC-Q-Orbitrap permet une identification complète et précise des constituants chimiques complexes. La pharmacochimie sérique restreint les composés candidats à ceux qui sont effectivement absorbés dans la circulation systémique, améliorant ainsi la plausibilité biologique des analyses ultérieures du réseau. L’analyse de pharmacologie en réseau basée sur des composés absorbés confirmés expérimentalement permet l’exploration au niveau du système de mécanismes multi-cibles et reflète mieux les caractéristiques pharmacologiques holistiques des formules de la MTC. Le docking moléculaire fournit en outre une validation computationnelle préliminaire des interactions composé-cible prédites et soutient la priorisation rationnelle des molécules candidates pour une vérification expérimentale ultérieure. Collectivement, ce flux de travail intégratif fournit une stratégie fiable, efficace et physiologiquement pertinente pour élucider la base matérielle et les mécanismes de formules herboristes complexes telles que le YQQJ.

Ce flux de travail est particulièrement adapté à l’étude des bases et mécanismes pharmacologiquement actifs des matériaux de formules herboriques complexes lorsque des données d’absorption in vivo peuvent être obtenues à partir d’études pharmacocinétiques animales ou humaines. Elle est particulièrement applicable aux formules ayant une efficacité clinique établie mais des constituants actifs peu clairs. Néanmoins, plusieurs limites doivent être reconnues. Premièrement, la précision de la prédiction des cibles dépend de la qualité et de l’exhaustivité des bases de données publiques. Deuxièmement, le flux de travail se concentre sur les composés prototypes détectés en circulation et ne prend pas en compte les métabolites bioactifs générés in vivo. Troisièmement, les prédictions issues d’analyses de pharmacologie de réseau nécessitent une validation expérimentale supplémentaire. Malgré ces limites, le flux de travail offre une approche efficace et fiable pour la génération d’hypothèses et la priorisation des cibles dans les études mécanistiques des formules MTC.

Par conséquent, cette étude utilise le UHPLC-Q-Orbitrap HRMS pour caractériser systématiquement à la fois les composants aqueux de l’extrait et les composés circulants du YQQJ, établissant ainsi une base de données relativement complète des constituants actifs potentiels. Sur la base de ce jeu de données, l’analyse pharmacologique en réseau, combinée à la validation par amarrage moléculaire, prédit les composants potentiellement actifs sur le plan pharmacologique du YQQJ pour le traitement de l’IgAN et fournit une base pour des recherches mécanistiques ultérieures.

Protocole

Toutes les procédures expérimentales impliquant des animaux ont respecté les Directives pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire émises par le Comité chinois de bien-être animal. Toutes les procédures de cette étude ont été approuvées par le Comité Institutionnel de Soins et d’Utilisation des Animaux (IACUC) du Centre Expérimental Animal de l’Hôpital Guang’anmen.

1. Administration des animaux et des médicaments

  1. Utilisez douze rats mâles Sprague–Dawley (SD) âgés de 6 semaines pesant entre 200 et 230 g.
  2. Hébergez tous les animaux au Centre Animalier Expérimental.
    REMARQUE : Maintenez la température du logement entre 20 et 26 °C et l’humidité relative entre 40 et 70 %. Utilisez un cycle clair/sombre de 12 heures sur 12 heures pour simuler les rythmes circadiens naturels.
  3. Acclimatez les animaux pendant 7 jours dans des conditions standard, avec un accès libre à la nourriture et à l’eau avant l’expérience. Divisez aléatoirement les rats en deux groupes (n = 6 par groupe) : un groupe témoin et un groupe traité par médicaments.
  4. Référez-vous à la dose équivalente convertie par surface corporelle entre humains etanimaux 20. Administrez un extrait concentré de YQQJ par gavage oral à 24,68 mL/(kg·jour) au groupe traité par médicament. Administrez simultanément un volume égal d’eau distillée au groupe témoin afin d’assurer un traitement synchrone.
  5. Poursuivez l’administration pendant 1 jour. Divisez la dose quotidienne totale en trois administrations égales (par exemple, à 08h00, 13h00 et 18h00) pour garantir la dose complète dans un délai d’un jour.
    REMARQUE : Animaux rapides pendant 12 heures avant la dernière décharge, avec accès libre à l’eau.
  6. Prélève des échantillons de sang à 2 h et 8 h après l’administration finale. Anesthésiez les rats par injection intrapéritonéale de pentobarbital sodique à 1 % (50 mg/kg). Prélève du sang de l’aorte abdominale.
  7. Laissez les échantillons de sang debout à température ambiante pendant 1 heure, puis centrifugez à 450 × g pendant 5 minutes à 4 °C. Vérifiez que le surnageant (sérum) est propre et exempt d’hémolyse. Transférer le sérum surnageant et le conserver à –80 °C pour une analyse plus approfondie.

2. Préparation des solutions

  1. Préparation des solutions de test
    1. Collectez toutes les herbes brutes de YQQJ selon la formule. Ajoutez 4 volumes d’eau purifiée dans le pot décoction et laissez tremper pendant 20 minutes.
      REMARQUE : De l’eau purifiée a été ajoutée aux herbes dans un ratio de 4:1 (v/w).
    2. Portez le mélange à ébullition, puis continuez la décoction pendant 30 minutes à feu doux. Filtrez à travers de la gaze et collectez le filtrat. Répétez la décoction des résidus avec 4 volumes d’eau pendant encore 30 minutes et filtrez à nouveau.
    3. Combine les deux filtrats. Concentrez la solution combinée à l’aide d’un évaporateur rotatif réglé à une température de bain-marie de 60 °C jusqu’à atteindre une concentration de 3 g/mL (v/p, équivalente aux matières médicinales brutes).
    4. Vérifiez que l’extrait concentré est un liquide sombre et visqueux, sans précipitations visibles. Conserver à 4 °C pour une utilisation ultérieure.
  2. Préparation de solutions de référence
    1. Pesez avec précision les composés de référence suivants : acide déacétylasperulosidique, acide géniposidique, acide loganique, morroniside, acide chlorogénique, séroside, acide plantagoguanidinique, rhein-8-O-β-D-glucopyranoside, génistine, apigénine-7-glucoside, Diosmétine-7-O-β-D-glucopyranoside, calycosine, protodioscine, génisteine, diosmétine, pseudoprotodioscine, formononétine, 3-hydroxy-9,10-diméthoxyptercarpane, aloémodine, rhin, dioscine.
    2. Dissoudre chaque composé dans le méthanol, faire passer le mélange en vortex pendant 1 minute, puis sonicer à température ambiante pendant 10 minutes pour assurer une dissolution complète.
    3. Diluez chaque solution avec du méthanol pour atteindre une concentration finale de 10 μg/mL pour chaque étalon.

3. Préparation de l’échantillon

  1. Préparation des échantillons d’extrait de YQQJ
    1. Pipeter 100 μL de l’extrait aqueux YQQJ dans un tube centrifuge de 1,5 mL. Ajoutez 300 μL de méthanol et le vortex pendant 1 minute. Centrifugeuse à 1800 × g, 4 °C pendant 10 minutes. Assurez-vous que le surnageant résultant est clair et exempt de particules en suspension.
    2. Prenez 100 μL de surnageant et mélangez-les avec 100 μL d’eau ultrapure pour obtenir une dilution 1:1. Vortex doucement et transférer dans un flacon autoéchantillonneur pour analyse.
  2. Préparation d’échantillons sérumiques contenant des médicaments
    1. Pipeter 100 μL de sérum dans un tube centrifuge de 1,5 mL. Ajoutez 300 μL de méthanol et faites passer un vortex pendant 10 minutes pour assurer la précipitation des protéines. Centrifugeuse à 1800 × g ., 4 °C pendant 10 minutes.
    2. Collectez 270 μL de surnageant et transférez dans un tube propre. Évaporez le surnageant jusqu’à la sécheresse à l’aide d’un concentrateur centrifuge sous vide réglé à 120 × g., 37 °C pendant 4 h jusqu’à ce qu’un résidu solide visible se forme.
    3. Reconstituer le résidu avec 90 μL de solution aqueuse à 50 % de méthanol. Faites tourner le vortex pendant 1 minute pour dissoudre complètement le résidu, puis centrifugez à nouveau à 1800 × g., 4 °C pendant 10 minutes.
    4. Collectez 80 μL du surnageant clair final et transférez-le dans un flacon autoéchantillonneur pour analyse.

4. Conditions analytiques

  1. Conditions chromatographiques
    1. Effectuer la séparation chromatographique à l’aide d’un système UHPLC équipé d’une colonne chromatographique.
    2. Utilisez une phase mobile binaire (Phase A : eau avec 0,1 % d’acide formique ; Phase B : acétonitrile). Appliquez un programme d’élution en gradient comme montré dans le tableau 1, à un débit de 0,3 mL/min. Réglez la température de la colonne à 40 °C et le volume d’injection à 6,0 μL.
      REMARQUE : Les spécifications de la colonne sont de 2,1 mm × 100 mm, dimension de particule de 1,8 μm.
  2. Conditions de SEP
    1. Analysez les échantillons à l’aide d’un spectromètre de masse quadrupôle orbitrap équipé d’une sonde par pulvérisation à ionisation par électropulvérisation chauffée (HESI).
    2. Régler les paramètres comme suit : tension d’ionisation : 3,7 kV (mode positif) / 3,5 kV (mode négatif) ; Température capillaire : 320 °C ; Pression de gaz dans la gaine : 30 psi ; pression de gaz auxiliaire : 10 psi ; température de désolvation : 300 °C ; gaz de gaine et gaz auxiliaire : azote ; gaz de collision : azote, 1,5 mTorr.
    3. Acquérir les données en mode balayage complet/dd-MS 2 . Réglez les paramètres de balayage complet comme suit : résolution 70000, objectif de contrôle automatique du gain 1×106, temps d’isolation maximal 50 ms, et plage de balayage m/z 100 – 1500.
    4. Collecter les données dd-MS2 avec les paramètres de résolution 17500, cible de contrôle automatique du gain 1×105, temps d’isolation maximal 50 ms, sélectionner les n (n≤10) ions parents les plus intenses pour la fragmentation couplés à un mécanisme d’exclusion dynamique, fenêtre d’isolation de m/z 2, énergie de collision 10 V, 30 V, 60 V, et seuil d’intensité 1×105.

5. Traitement des données MS

  1. Traiter les données MS acquises à l’aide d’un logiciel spécialisé de traitement des données. Naviguez dans le module Importation de données et téléchargez les fichiers de données brutes.
  2. Exécutez le module Peak Picking et effectuez la déconvolution de pic pour regrouper les ions adducts et générer des caractéristiques composées.
  3. Recherchez dans les bases de données de référence des composés, les bases de données de prédiction de cibles et la littérature publiée pertinente pour identifier les candidats.
  4. Identifier les composés en utilisant deux stratégies d’identification complémentaires basées sur des données de SEP à haute résolution.
    1. Identification basée sur la correspondance des standards de référence. Confirmez les composés par comparaison avec des normes de référence authentiques. N’accepter les identifications que lorsque tous les critères suivants sont remplis :
      1. Précision de masse : L’erreur de masse des ions précurseurs et des ions fragments doit être inférieure à ±5 ppm.
      2. Similarité spectrale : Le score de similarité cosinus entre le spectre MS/MS expérimental et le spectre MS/MS de la norme de référence doit être ≥ 0,85.
      3. Distribution isotopique : Le score de correspondance de motifs isotopique doit être ≥ 90 %.
      4. Comportement chromatographique : L’écart de temps de rétention entre le composé détecté et l’étalon de référence doit être < 0,2 min.
        REMARQUE : Les composés répondant à tous les critères ci-dessus sont annotés comme MSI Niveau 1, représentant une identification structurelle confirmée.
    2. Identification basée sur des données MS à haute résolution et sur la prédiction spectrale in silico. Pour les composés sans normes de référence disponibles, effectuer une identification présumée basée sur des mesures de masse précises et une prédiction spectrale computationnelle. N’accepter les annotations que lorsque les critères suivants sont remplis :
      1. Précision de masse : L’erreur de masse des ions précurseurs doit être de ±5 ppm, et l’erreur de masse des ions fragments doit être de ±10 ppm.
      2. Similarité spectrale : Comparez le spectre MS/MS expérimental avec le spectre MS/MS théorique généré à partir de la structure composée SMILES à l’aide de l’algorithme QI Progenesis. Acceptez les correspondances avec un score de similarité cosinus ≥ 0,60.
      3. Distribution isotopique : Le score de correspondance de motifs isotopique doit être ≥ 90 %.
      4. Prédiction du comportement chromatographique : La différence entre le temps de rétention expérimental et le temps de rétention prévu par apprentissage automatique doit être < 1,0 min.
        REMARQUE : Le modèle de prédiction du temps de rétention a été entraîné à partir de données chromatographiques expérimentales provenant de plus de 2000 composés de référence analysés dans les mêmes conditions chromatographiques. Les composés répondant à ces critères sont annotés comme MSI Niveau 2, représentant des composés supposés identifiés avec une forte confiance structurelle.

6. Pharmacologie des réseaux

  1. Identification des composants absorbés par le sang et des cibles liées à l’IgAN
    1. Importez les constituants de YQQJ absorbés par le sang prototype identifiés dans les bases de données de prédiction des cibles. Sélectionnez « Homo sapiens » comme espèce cible et obtenez ses cibles potentielles. Notez ces composés comme l’ensemble cible des composés absorbés par le sang dans le YQQJ.
    2. Utilisez le mot-clé « IgA Nephropathy » pour récupérer des cibles de maladies liées à l’IgAN à partir des plateformes bioinformatiques intégrées. Consolidez les résultats provenant de plusieurs sources pour minimiser les biais.
      REMARQUE : Utilisez une base de données protéique pour convertir toutes les cibles récupérées au format Symbole Génétique pour plus de cohérence.
  2. Construction du réseau d’interactions protéine-protéine (IPP) et identification des cibles principales
    1. Fusionner l’ensemble cible des composés absorbés par le sang YQQJ avec l’ensemble cible de la maladie IgAN et extraire leur intersection.
    2. Téléchargez les cibles qui se croisent sur la plateformePPI 21. Configurez les paramètres : réglez l’organisme comme Homo sapiens, le score de confiance à 0,90, et écartez tous les nœuds déconnectés.
    3. Importez les données PPI dans le logiciel de visualisation22. Lance le plugin d’analyse topologique. Calculer la centralité des degrés (DC)23, la centralité d’intermédiaire (BC)24, et la centralité de proximité (CC)25.
    4. Criblez les cibles thérapeutiques principales du YQQJ face à l’IgAN en filtrant les nœuds dont les valeurs des paramètres topologiques (DC, BC et CC) dépassent la médiane.
  3. Construction et analyse du réseau intégré « YQQJ – composants absorbés par le sang–cibles–voies–maladie »
    1. Préparez le fichier d’attributs du nœud : Créez un tableau de calcul contenant deux colonnes. Étiquetez la première colonne Nom du nœud et le second type de nœud. Attribuez l’une des cinq catégories (Formule, Composante absorbée par le sang, Cible d’intersection, Voie ou Maladie) à chaque nœud.
    2. Préparez le fichier d’interaction réseau (edge) : Créez un tableau Excel définissant les connexions entre les nœuds (par exemple, composant absorbé par le sang vers cible d’intersection). Assurez-vous que tous les noms de nœuds correspondent à ceux du fichier d’attributs du nœud afin d’éviter les erreurs de mappage.
    3. Importez et construisez le réseau : lancez le logiciel de visualisation du réseau. Naviguez dans Fichier > Importer > Réseau pour charger le fichier de périphérie. Dans la fenêtre d’aperçu, mappez les colonnes comme Nœud Source et Nœud Cible et cliquez sur OK pour générer le graphique initial.
    4. Mapper les attributs du nœud et définir les styles visuels : Importez le fichier d’attributs du nœud via le fichier > importez > Table. Ouvrez le panneau Style et associez la colonne Type de nœud à des propriétés visuelles spécifiques, notamment la forme du nœud, la couleur de remplissage et la taille.
    5. Exécutez une analyse topologique : naviguez vers les outils > analyser le réseau pour effectuer des calculs topologiques. Filtrer et identifier les composés actifs principaux et les cibles thérapeutiques clés en fonction des valeurs de degré.
      REMARQUE : Utilisez les mêmes paramètres topologiques que décrits à l’étape 6.2 pour assurer la cohérence dans l’identification des nœuds principaux.
    6. Exportez l’image réseau : finalisez la configuration réseau. Naviguez dans Fichier > Exportez > Réseau vers Image pour sauvegarder la visualisation optimisée.
  4. Enrichissement GO et analyses des voies KEGG
    1. Soumettre la liste des gènes : Ouvrez la plateforme d’annotation fonctionnelle en ligne. Naviguez jusqu’à l’étape 1 : Soumettre la liste de gènes et téléchargez la liste de gènes cibles de basefiltrée précédemment 26.
    2. Sélectionnez les espèces : Dans les menus déroulants pour l’étape 2 : Saisie en tant qu’espèce et 3 : Analyse en tant qu’espèce, sélectionnez H. sapiens. (humain) pour vous assurer que l’analyse est réalisée dans le bon contexte biologique.
    3. Configurez l’analyse personnalisée : Sélectionnez le mode Analyse personnalisée . Dans la catégorie Enrichissement , consultez les bases de données suivantes : Ontologie Génique (GO), Fonction Moléculaire (MF), Processus Biologique GO (BP), Composant Cellulaire GO (CC) et Voie de l’Encyclopédie des Gènes et Génomes de Kyoto (KEGG).
    4. Fixez des seuils de signification : fixez le seuil de la valeur P à < 0,01, l’enrichissement minimum à ≥ 1,5, et le chevauchement minimal à ≥ 3. Gardez tous les autres paramètres dans leurs paramètres par défaut.
    5. Exécutez l’analyse : Cliquez sur le bouton Analyse d’enrichissement pour soumettre la tâche et attendez la fin du calcul.
    6. Récupérer et exporter les résultats : accédez à la page de rapport d’analyse générée. Cliquez sur le bouton de téléchargement pour exporter les données détaillées d’enrichissement sous forme de tableur, ainsi que les graphiques à barres et les cartes thermiques correspondantes.

7. Vérification de l’amarrage moléculaire

  1. Téléchargez les structures protéiques 3D haute résolution (< 2,50 Å) des cibles centrales et les structures chimiques 2D des constituants absorbés par le sang du cœur depuis les bases de données de biologiestructurale 27.
  2. Lancez le logiciel d’amarrage moléculaire et importez les structures téléchargées.
  3. Exécutez les étapes de prétraitement suivantes séquentiellement : naviguer vers Modifier > Retirer l’eau pour éliminer les molécules d’eau ; sélectionnez Modifier > Supprimer les hétératomes pour éliminer les résidus non standards.
  4. Va dans Modifier > Hydrogènes > Ajoute > Polaire uniquement pour ajouter les atomes d’hydrogène polaire. Sauvegarder les structures traitées au format PDBQT via fichier > sauvegarder > écrire PDBQT.
  5. Définissez le site d’amarrage en utilisant l’outil Grid > Grid Box . Les dimensions des boîtes de grille étaient ajustées de manière adaptative (20–100 Å) pour assurer une couverture complète des régions de liaison prédites.
  6. Initialiser les paramètres d’amarrage : Sélectionnez le récepteur via Docking > Macromolecule > définissez le nom de fichier rigide et ouvrez le ligand via Docking > Ligand > Open. Les paramètres d’amarrage étaient définis comme suit : exhaustivité = 32, plage d’énergie = 3 kcal/mol, et jusqu’à 10 modes de liaison étaient conservés. Pour les protéines avec des ligands co-cristallisés, la boîte de la grille d’amarrage était centrée sur le centroïde du ligand avec une extension de 8,0 Å, tandis que pour les protéines sans ligands co-cristallisés, des poches de liaison ont été prédites à l’aide de DoGSiteScorer avec une couverture d’environ 90 %.
  7. Choisissez l’algorithme génétique lamarckien (LGA) comme stratégie de recherche. Exécutez la simulation via l’amarrage > lancez l’AutoDock.
  8. Évaluer l’affinité de liaison en fonction de l’énergie de liaison calculée (score d’amarrage)28.
    REMARQUE : Une énergie de liaison plus faible indique une bioactivité prédite plus forte et une stabilité structurelle plus élevée du complexe protéine-ligand. Un seuil de ≤ -5,0 kcal/mol est généralement utilisé pour identifier une stabilité de liaison favorable.

Résultats

Analyse des constituants dans l’extrait aqueux YQQJ
L’analyse des composants de l’extrait aqueux YQQJ a été réalisée dans les conditions établies dans le PROTOCOLE 4. Le UHPLC-Q-Orbitrap HRMS a été utilisé en modes de balayage complet à ions positifs et négatifs pour profiler l’extrait aqueux de YQQJ, et le chromatogramme d’ion de pointe de base (BPI) obtenu est illustré à la Figure 1. Sur cette base, une base de données auto-établie des constituants chimiques, combinée à la caractérisation spectrale MS/MS, a permis l’identification réussie de 185 composés à partir de l’extrait aqueux, avec des informations détaillées résumées dans le Tableau Supplémentaire 1. Les schémas représentatifs d’appariement spectral MS/MS et de fragmentation utilisés pour l’identification des composés sont illustrés dans la Figure Supplémentaire 1. L’analyse statistique des catégories de composés a révélé que les flavonoïdes et terpénoïdes étaient les constituants prédominants dans le YQQJ, représentant 94 composés, la proportion la plus abondante.

Composants absorbés par le sang du YQQJ
Pour clarifier les substances bioactives directes in vivo, des échantillons de sérum prélevés après administration de YQQJ ont été analysés. Le chromatogramme BPI du sérum à blanc (Figure 2) a été inclus pour comparaison afin de distinguer les composés dérivés du médicament des composants sériques endogènes. Sur la base de l’IPP du sérum contenant un médicament (Figure 3), un total de 28 composants prototypes absorbés dans la circulation sanguine ont été identifiés, principalement des flavonoïdes, terpénoïdes et stéroïdes. Les chromatogrammes ioniques (EIC) extraits de composés représentatifs dans l’extrait de YQQJ, le sérum blanc et le sérum contenant des médicaments ont également confirmé la présence de composants dérivés du médicament dans la circulation (Figure supplémentaire 2). Parmi eux, 10 composés proviennent de Spatholobus suberectus Dunn, 7 de Dioscorea nipponica Makino, 7 d’Astragalus membranaceus, 6 d’Hedyotis diffusa Willd., 6 de Lonicera japonica Thunb., 4 de Plantago asiatica L. et 4 de Rheum palmatum.L., tel que résumé dans le tableau supplémentaire 1.

Prédiction de la cible des composants absorbés par le sang de YQQJ liés à l’IgAN
Un total de 28 constituants prototypes identifiés entrant dans la circulation sanguine ont été intégrés dans des bases de données de prédiction de cibles, fournissant 459 cibles potentielles. Par ailleurs, 2779 cibles liées à IgAN ont été récupérées sur des plateformes intégrées de bioinformatique. L’analyse d’intersection a identifié 247 cibles chevauchantes entre YQQJ et IgAN (Figure 4).

Construction et analyse du réseau PPI
Les 247 cibles qui s’entrecroisent ont été téléchargées dans la plateforme PPI, et le logiciel de visualisation a été utilisé pour filtrer les cibles principales selon trois paramètres topologiques : DC, BC et CC. Un total de 42 cibles ont finalement été identifiées comme nœuds centraux. Le flux de travail utilisé pour filtrer ces cibles principales est résumé dans la Figure 3 supplémentaire. Dans le réseau PPI, la taille et la couleur des nœuds variaient selon les valeurs des paramètres (Figure 5), parmi lesquelles TP53, SRC, AKT1, ESR1 et STAT3 figuraient parmi les cinq cibles principales principales.

Réseau « Formule – composants absorbés par le sang – cibles centrales – voies et maladie » du YQQJ
Pour révéler systématiquement les mécanismes multi-composantes et multi-cibles de la YQQJ face à l’IgAN, un réseau d’interactions « Formule–Composants absorbés par le sang–cibles centrales–Voies–Maladie » a été construit à l’aide d’un logiciel de visualisation. Le réseau se composait de 96 nœuds et 459 arêtes, chaque arête représentant une relation ou une interaction entre deux nœuds (Figure 6).

Analyses d’enrichissement GO et KEGG
L’analyse d’enrichissement GO des 42 cibles principales a révélé 1162 termes BP, 52 termes CC et 92 termes MF. La Figure 7 présente les 10 termes GO les plus significativement enrichis dans les catégories BP, CC et MF. L’analyse d’enrichissement KEGG a également identifié 182 voies associées à ces cibles principales. La figure 8 illustre les 20 voies les plus significativement enrichies étroitement liées à la pathogenèse de l’IgAN. Dans ces graphiques, des couleurs rouges plus profondes indiquent une signification statistique plus forte, tandis que des bulles plus grandes ou des longueurs de barres plus longues représentent un plus grand nombre de cibles enrichies dans chaque voie.

Évaluation du docking moléculaire
Dans cette étude, sur la base de l’analyse précédente des cibles clés et des voies associées de YQQJ dans le traitement de l’IgAN 29,30,31,32, six cibles principales, dont CASP3 (PDB ID : 6X8I), IGF1R (PDB ID : 1JQH), JUN (PDB ID : 8RPP), STAT3 (PDB ID : 6NJS), PRKCB (PDB ID : 8SE3) et PIK3CA (PDB ID : 5FI4), ont été sélectionnées comme protéines réceptrices pour le dockage moléculaire. Correspondant à la pathogénie centrale de la MTC de l’IgAN, définie comme « vent pathogène, chaleur humide et toxines envahissant le rein », des composants actifs représentatifs ayant des propriétés de dégagement de chaleur, d’élimination de l’humidité et de détoxifiance ont été sélectionnés comme des ligands, à savoir l’acide déacétylasperulosidique et l’acide géniposidique de Hedyotis diffusa Willd., et la Dioscine de Dioscorea nipponica. Makino. Les résultats de l’amarrage sont présentés à la Figure 9. Parmi toutes les combinaisons ligand-récepteur, la Dioscine a montré des énergies de liaison nettement plus faibles avec toutes les cibles sélectionnées, suggérant une affinité de liaison prédite plus élevée. À l’exception des interactions entre JUN et l’acide déacétylasperulosidique/acide géniposidique, les autres paires d’amarrage ont également démontré des activités de liaison favorables. Les conformations représentatives du docking 3D sont visualisées dans la Figure 10.

figure-results-1
Figure 1 : Chromatogrammes à ions de pic de base de l’extrait aqueux YQQJ. (A) Chromatogramme BPI en mode ion positif. (B) Chromatogramme BPI en mode ion négatif. Les chromatogrammes montrent le profil chimique global de l’extrait aqueux YQQJ selon les conditions établies de l’UHPLC-Q-Orbitrap HRMS. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

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Figure 2 : Chromatogrammes ioniques de pic de base du sérum vierge. (A) Chromatogramme BPI en mode ion positif. (B) Chromatogramme BPI en mode ion négatif. Les chromatogrammes représentent le profil de fond sérique endogène utilisé comme témoin pour la comparaison avec le sérum contenant un médicament afin de distinguer les composants dérivés du médicament des constituants endogènes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

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Figure 3 : Chromatogrammes à ions de pic de base du sérum contenant YQQJ. (A) Chromatogramme BPI en mode ion positif. (B) Chromatogramme BPI en mode ion négatif. Les chromatogrammes représentent le profil des composants absorbés par le sang détectés dans le sérum après l’administration de la QQJ. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

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Figure 4 : Diagramme de Venn des cibles chevauchantes entre YQQJ et IgAN. Le diagramme montre le nombre de cibles YQQJ prédites, de cibles liées à l’IgAN, et leur intersection, mettant en évidence les cibles partagées potentiellement impliquées dans les effets thérapeutiques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

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Figure 5 : Réseau d’interactions protéine-protéine (IPP) de cibles centrales. Les nœuds représentent des cibles protéiques, et les arêtes représentent les interactions entre cibles. La taille des nœuds et l’intensité de couleur correspondent à des valeurs de degré, les nœuds plus grands et les plus sombres indiquant une connectivité plus élevée au sein du réseau. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

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Figure 6 : Réseau intégré de composants, cibles, voies et maladies du YQQJ. Le réseau illustre les relations entre la formule, les composants absorbés par le sang, les cibles centrales, les voies et l’IgAN. Le triangle représente la maladie ; le cercle représente les voies ; Le nœud en forme de V représente la formule YQQJ ; le diamant représente les herbes ; hexagone représente les composants ; Octagon représente des composants prototypes absorbés par le sang ; Le rectangle représente les cibles. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

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Figure 7 : Analyse d’enrichissement GO des cibles principales. Le graphique en barres montre les 10 termes les plus enrichis en ontologie génique dans les catégories BP, CC et MF. L’axe des x représente les termes GO, et l’axe des y indique −log10(valeur p), indiquant l’importance de l’enrichissement. Abréviations : BP = Processus biologique ; CC = composante cellulaire ; MF = Fonction moléculaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

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Figure 8 : Analyse d’enrichissement des voies KEGG des cibles principales. Le graphique des bulles affiche les 20 principales voies enrichies de KEGG. La taille du point indique le nombre de gènes enrichis, et le gradient de couleur indique −log10 (valeur p), les couleurs plus rouges indiquant une signification statistique plus élevée. L’axe des x indique le ratio des gènes, et l’axe des y indique les termes des voies. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

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Figure 9 : Carte thermique de l’énergie de liaison moléculaire. La carte thermique présente les énergies de liaison (kcal/mol) entre les cibles centrales et les composés clés absorbés par le sang. Des valeurs plus faibles d’énergie de liaison indiquent une affinité de liaison prédite plus forte. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

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Figure 10 : Conformations représentatives d’amarrage moléculaire. (A) Conformation de liaison de l’acide déacétylasperulosidique avec CASP3. (B) Conformation de liaison de Dioscine avec STAT3. (C) Conformation de liaison de l’acide géniposidique avec PIK3CA. Les images montrent les interactions et orientations de liaison ligand-protéine prédites. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure supplémentaire 1 : Identification structurelle des composés représentatifs par MS/MS à haute résolution. (A) Comparaison spectrale tête à queue de l’acide déacétylasperulosidique, entre le spectre expérimental (haut, rouge) et celui de la base de données de référence (bas, bleu). (B) Spectre de fragmentation MS/MS à haute résolution de l’acide déacétylasperulosidique. (C) Comparaison spectrale tête à queue de l’acide géniposidique avec la base de données de référence. (D) Spectre de fragmentation MS/MS expérimental de l’acide géniposidique. (E) Comparaison spectrale tête à queue de Dioscine avec la base de données de référence. (F) Spectre de fragmentation MS/MS à haute résolution de Dioscine. Ces panneaux illustrent l’appariement spectrale utilisé pour l’identification des composés. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : Chromatogrammes ioniques (EIC) extraits de composés représentatifs à travers des échantillons. (A) EIC de l’acide déacétylasperulosidique. (B) EIC de l’acide géniposidique. (C) Maison de Dieu de Dieucin. Pour chaque bilan, la trace supérieure représente l’extrait aqueux YQQJ (ZY), la trace centrale représente le sérum témoin à vide (KBX), et la trace inférieure représente des échantillons séricaux contenant des composants absorbés par le sang après administration YQQJ (GYX). La comparaison met en lumière la présence de composés dérivés de médicaments dans le sérum. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure complémentaire 3 : Flux de travail pour le dépistage des cibles principales. Le diagramme illustre le processus d’identification des cibles par étapes, incluant la prédiction des cibles composées, la collecte de cibles liées à l’IgAN, l’analyse d’intersection, la construction de réseaux PPI et le dépistage des cibles principales sur la base de paramètres topologiques. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Temps (min)Phase mobile
A (v %)B (v %)
0982
1.0982
14.07030
25.00100
28.00100
28.1982
30.0982

Tableau 1 : Programme d’élution par gradient UHPLC. Le tableau présente la composition de phase mobile et les conditions de gradient utilisées pour la séparation chromatographique, incluant les points temporels et les proportions correspondantes de solvants aqueux (phase A) et organiques (phase B).

Tableau complémentaire 1 : Constituants chimiques identifiés de l’extrait aqueux YQQJ. Le tableau liste les composés identifiés par le SGR UHPLC-Q-Orbitrap, y compris les composants prototypes absorbés par le sang (A1–A28), ainsi que leur classification et leur origine à base de plantes. Abréviations : BHSSC = Hedyotis diffusa Willd. ; CSL = Dioscorea nipponica Makino ; DH = Rhumatum palmatum L. ; JXT = Spatholobus suberectus Dunn ; HQ = Astragalus membranaceus. ; CQC = Plantago asiatica L. ; JYH = Lonicera japonica. Thunb. Les classes composées incluent A = alcaloïdes ; Ald = Aldéhydes ; F = Flavonoïdes ; N = Nucléosides ; O = Autres ; OA = acides organiques ; P = Phénols ; PA = Acides phénoliques ; Phe = Phénylpropanoïdes ; Q = Quinones ; S = Saccharides ; STE = Stéroïdes ; T = Terpénoïdes ; Tan = Tanins. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Dans la présente étude, une stratégie intégrée combinant « identification UHPLC-Q-Orbitrap HRMS – analyse pharmacochimique sérique – prédiction de pharmacologie de réseau – validation du docking moléculaire » a été employée pour élucider systématiquement la base matérielle potentielle et les mécanismes du YQQJ dans le traitement de l’IgAN. Contrairement aux recherches précédentes qui s’appuyaient principalement sur la SEP pour analyser les constituants chimiques des formules à base de plantes et prédisaient ensuite les mécanismes à l’aide de la pharmacologie en réseauseule 16, la pharmacochimie sérique suit un flux de travail composé de « constituants complexes à base de plantes – composants absorbés par le sang – substances actives directes in vivo – base de matériaux pharmacodynamiques ». En identifiant les composants entrant dans la circulation systémique après administration, cette approche est largement considérée comme une stratégie efficace pour identifier la base pharmacodynamique des formules de MTC.

Dans cette étude, l’analyse UHPLC-Q-Orbitrap HRMS a initialement identifié 185 constituants dans YQQJ, dont 28 ont été confirmés comme prototypes de composés absorbés par le sang, fournissant ainsi une base chimique fiable pour des études mécanistiques ultérieures. La précision de cette identification dépendait de la correspondance complète du temps de rétention, de la masse exacte et des informations de fragmentation MS/MS 14. Sur la base de la stratégie de pharmacochimie sérique, ces composés absorbés par le sang prototypes ont servi de point de départ pour la construction de réseaux, ce qui a renforcé la pertinence entre les composants à base de plantes et l’efficacité réelle invivo 33. En intégrant des cibles composé-maladie croisant avec un criblage des nodes centraux basé sur des IPP, suivi d’analyses d’enrichissement GO et KEGG, des voies de signalisation clés associées à l’IgAN ontété identifiées 15. Les résultats du docking moléculaire ont suggéré que les principaux composants absorbés par le sang provenaient de Hedyotis diffusa Willd. et Dioscorea nipponica Makino.peuvent interagir avec des cibles principales en fonction des affinités de liaison prédites plutôt que d’une activité fonctionnelle confirmée expérimentalement. Ces résultats soutiennent l’hypothèse selon laquelle l’acide déacétylasperulosidique, l’acide géniposidique et la diocine pourraient constituer les constituants pharmacodynamiques clés potentiels du YQQJ, en attendant une validation expérimentale supplémentaire.

D’un point de vue technique, le prétraitement par échantillon était crucial. En raison de la complexité du sérum et de la présence de protéines endogènes (par exemple, hormones et enzymes), toute interférence dans la détection des composants absorbés par le sang est inévitable. Dans cette étude, la précipitation du méthanol a été appliquée pour enrichir les analytes et réduire les interférences de fond, garantissant à la fois la sensibilité et la précision de l’analyse MS34. Concernant les moments d’analyse du sang, différents constituants des formules à base de plantes peuvent présenter des schémas d’absorption et de transformation in vivo distincts, ce qui peut influencer leur détectabilité dans le sérum. Ainsi, sur la base des essais préliminaires, des échantillons séromiques ont été prélevés 2 h et 8 h après l’administration finale afin de maximiser la couverture des constituants circulants.

Plusieurs étapes procédurales se sont révélées particulièrement cruciales pour la réussite de la mise en œuvre de ce flux de travail. L’identification précise des composés repose fortement sur l’évaluation combinée du temps de rétention, de la précision masse à haute résolution et des ions fragments MS/MS diagnostiques. De plus, des moments appropriés pour le prélèvement sérique sont essentiels pour capturer les constituants absorbés par le sang qui peuvent apparaître dans la circulation à différents stades après l’administration. Une optimisation soigneuse du prétraitement de l’échantillon et des conditions de séparation chromatographique est donc nécessaire pour garantir une détection fiable des composés prototypes dans des matrices biologiques complexes.

Des défis analytiques potentiels peuvent survenir lors de la préparation de l’échantillon et de l’analyse de la SEP. Par exemple, une précipitation incomplète des protéines peut entraîner des effets matriciels qui suppriment l’efficacité d’ionisation, tandis qu’un bruit de fond excessif peut réduire la sensibilité à la détection. Ces problèmes peuvent être atténués en optimisant les rapports de solvants lors de la précipitation des protéines, en améliorant les conditions de séparation chromatographique et en ajustant les paramètres d’acquisition de la SEP. Lors du traitement des données, des annotations de composés faux positifs peuvent survenir lorsqu’on se base uniquement sur la correspondance de la base de données ; par conséquent, une vérification manuelle des schémas de fragmentation MS/MS et du comportement de rétention est recommandée afin d’améliorer la fiabilité de l’identification.

Plusieurs considérations méthodologiques ont été intégrées dans ce travail. Premièrement, au lieu d’appliquer des critères conventionnels tels que la biodisponibilité orale et la ressemblance du médicament, seuls des composants absorbés sanguins vérifiés expérimentalement ont été utilisés pour la prédiction des cibles. Cette approche évitait l’omission potentielle de composés actifs en raison de seuils de filtration prédéfinis et éliminait les constituants non pertinents qui ne sont pas biodisponibles in vivo, renforçant ainsi la pertinence physiologique de la prédiction du réseau16. Deuxièmement, la sélection des ligands actifs pour l’amarrage s’est spécifiquement concentrée sur les composants majeurs provenant d’herbes ayant pour fonction de « dissiper l’humidité du vent et de dissiper la toxine thermique » (Hedyotis diffusa Willd. et Dioscorea nipponica Makino.), établissant un pont mécaniste entre le concept pathologique de la MTC de « toxine évent-humidité-chaleur envahissant le rein » et les caractéristiques pathologiques modernes de l’IgAN. Cela fournit des preuves préliminaires soutenant la théorie MTC de la corrélation formule–motif. Troisièmement, en tenant compte des différences potentielles de taille et de qualité des données selon les bases de données, plusieurs plateformes ont été intégrées pour élargir la couverture cible et réduire les biais introduits par une seule basede données 35.

Comparé aux stratégies conventionnelles qui appliquent directement la pharmacologie en réseau à tous les constituants chimiques détectés, le flux de travail actuel met l’accent sur la priorisation guidée par des preuves sur les composés à partir des composants absorbés par le sang détectés expérimentalement. Ce processus de filtrage par étapes réduit le nombre de composés candidats entrant dans l’analyse computationnelle et améliore l’interprétabilité des réseaux d’interaction composé-cible. De plus, contrairement aux études orientées métabolomique qui capturent principalement les perturbations métaboliques endogènes, la stratégie actuelle se concentre sur des composés prototypes exogènes dérivés de médicaments à base de plantes, permettant ainsi une attribution plus directe de l’activité pharmacologique à des constituants spécifiques de plantes médicinales.

D’un point de vue méthodologique pratique, ce flux de travail offre plusieurs avantages pour étudier des formulations complexes de plantes à base de plantes. L’intégration du SGFC avec la pharmacochimie sérique permet l’identification fiable des constituants biodisponibles, tandis que la combinaison ultérieure de la pharmacologie en réseau et du docking moléculaire établit un cadre analytique hiérarchique reliant les preuves chimiques à la prédiction mécanistique. De plus, restreindre la construction du réseau aux composés vérifiés expérimentalement réduit la complexité du réseau et facilite une identification plus claire des interactions composé–cible principales.

Cette étude présente également des limites. Tout d’abord, la pharmacologie des réseaux et l’amarrage moléculaire sont des approches computationnelles prédictives. Une forte affinité de liaison ne se traduit pas nécessairement par une régulation biologique in vivo, car le docking moléculaire ne prend pas en compte la dynamique des protéines, le contexte cellulaire ou la signalisation en aval. De plus, le protocole d’amarrage actuel n’incluait pas la validation du re-amarrage utilisant des ligands co-cristallisés ni le benchmarking avec des inhibiteurs connus, ce qui pourrait limiter l’évaluation de la précision de l’amarrage. De futures études intégrant la validation basée sur le RMSD, des simulations de dynamique moléculaire et des tests expérimentaux renforceront encore la fiabilité de ces prédictions. Actuellement, notre groupe a terminé une validation mécanistique démontrant que Dioscine agit via la voie JAK2/STAT3, ce qui renforce dans une certaine mesure la crédibilité de la prédiction et fournit un soutien expérimental partiel pour les cibles clés identifiées dans cette étude, bien que d’autres interactions composante-cible nécessitent encore une confirmation36. Deuxièmement, les influences de la compatibilité proportionnelle et des relations de dosage entre les plantes n’ont pas été prises en compte dans l’analyse actuelle. Des travaux futurs pourraient introduire des modèles de réseau pondérés dose-effet pour mieux refléter les pratiques cliniquesde prescription 37.

En conclusion, le flux de travail actuel — identification à haute résolution par SEP des constituants absorbés par le sang, analyse ciblée et voie en réseau basée sur la pharmacologie, et validation du docking moléculaire — permet un rétrécissement efficace de la base de matière active et des cibles d’action à partir d’une formule herborique complexe. Cela fournit une orientation expérimentale claire pour la vérification biologique de suivi et accélère les investigations mécanistiques des formules de la MTC. À l’avenir, l’intégration de la métabolomique spatiale, des modèles organoïdes et des technologies multi-omiques pourrait permettre une validation dynamique et tridimensionnelle ainsi que l’extension des résultats présents dans des systèmes qui reproduisent plus fidèlement les conditions physiologiques et pathologiques, fournissant ainsi des preuves plus solides pour élucider la base scientifique des formules de MTC.

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent ne pas exister de conflit d’intérêts.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (Grant No.81973675), le Projet de Promotion des Hôpitaux Médicaux Chinois de Haut Niveau (Grant No. HLCMHPP2023039), et la Fondation des sciences naturelles de Pékin (Subvention n° 7252259).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
AutoDock 4.2.6L’Institut de Recherche sur les Scripts-
Colonne chromatographiqueWaters Corp.ACQUITY UPLC HSS T3
Centrifugeuse réfrigérée à grande vitesseTechnologie du laboratoire HettichMikro 220R
Plateformes intégrées de bioinformatiqueWeizmann & nbsp ; Institute  ; of & nbsp ; Science-Base de données GeneCards (https://www.genecards.org/)
Plateformes intégrées de bioinformatiqueLe  ; Johns & nbsp ; Hopkins & nbsp ; Université  ; École  ; of & nbsp ; Médecine-Base de données OMIM (https://omim.org/).
LC-MS/4 L AcétonitrileThermo Fisher ScientificA955-4
LC-MS/4 L méthanolThermo Fisher ScientificA456-4
LC-MS/4 L EauThermo Fisher ScientificW6-4
LC-MS/50 mL acide formiqueThermo Fisher ScientificA117-50
Logiciel de traitement de données en spectrométrie de masseWaters Corp.-Logiciel Progenesis QI 3.0
Logiciel d’amarrage moléculaireLaboratoire OlsonAutoDock 4.2.6
Plateforme PPISociété de bases de données STRING-La plateforme en ligne STRING (https://string-db.org)
Base de données des protéinesInstitut européen de bioinformatique ; l’Institut suisse de bioinformatique ; Ressource d’information sur les protéines-Plateforme UniProt (https://www.uniprot.org/)
Spectromètre de masse quadrupôle orbitrapThermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFALGMAZR
Bases de données de référence sur les composésTCM Pro 2.0, Beijing Hexin Technology Co., Ltd.-
Évaporateur rotatifShanghai Titan Scientific Co., LtdTR-3L
Bases de données de biologie structurale.Laboratoire national de Brookhaven-La base de données PDB du RCSB (https://www.rcsb.org/)
Bases de données de biologie structurale.Centre national d’information biotechnologique-La base de données PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)
Bases de données de prédiction de ciblesInstitut suisse de bioinformatique SIB-Base de données SwissTargetPrediction (https://www.swisstargetprediction.ch)
Bases de données de prédiction de ciblesShanghai & nbsp ; Institute  ; of & nbsp ; Matéria  ; Medica-Base de données TCMSP (https://www.tcmsp-e.com/tcmsp.php)
Plugin d’analyse topologique--plugin Centiscape 2.2 ; Analyseur de réseau
Système UHPLCVanquish Flex-
Chromatographe liquide ultra-haute performanceThermo Fisher ScientificVanquish Flex UHPLC
Extracteur ultrasoniqueKunshan Ultrasonic Instruments Co., Ltd.KQ3200D
Concentrateur centrifuge sous videNingBo Scientz Biotechnology Co., Ltd.SCIENTZ-1LS
Logiciels de visualisation--Cytoscape 3.10.4
Plateforme d’annotation fonctionnelle basée sur le web.Broad  ; Institut-La plateforme en ligne Metascape (https://metascape.org)

Références

  1. Pattrapornpisut, P., Avila-Casado, C., Reich, H. N. IgA nephropathy: Core curriculum 2021. Am J Kidney Dis. 78 (3), 429-441 (2021).
  2. Pitcher, D., et al. Long-term outcomes in IgA nephropathy. Clin J Am Soc Nephrol. 18 (6), 727-738 (2023).
  3. Shen, X., et al. Long-term outcomes of IgA nephropathy in China. Nephrol Dial Transplant. 40 (6), 1137-1146 (2025).
  4. Roberts, I. S. D. Pathology of IgA nephropathy: A global perspective. Nephrology (Carlton). 29 (Suppl 2), 71-74 (2024).
  5. Floege, J., Bernier-Jean, A., Barratt, J., Rovin, B. Treatment of patients with IgA nephropathy: A call for a new paradigm. Kidney Int. 107 (4), 640-651 (2025).
  6. Zhang, Y., Zhang, H. Current understanding and new insights in the treatment of IgA nephropathy. Nephrology (Carlton). 29 (Suppl 2), 75-79 (2024).
  7. Kang, S. Comparative analysis of western medicine and traditional Chinese medicine. 4th Int. Conf. Social Sciences and Humanities and Arts (SSHA 2025), 2025, , 350-355 (2025).
  8. Wang, X. H., et al. Traditional Chinese medicine in treating IgA nephropathy. J Transl Intern Med. 9 (3), 161-167 (2021).
  9. Zeng, Q., Xu, J. L., Liang, Y., Yu, R. H. Etiology and treatment progress of IgA nephropathy. Med Recapitulate. 28 (1), 163-167 (2022).
  10. Guo, T., et al. Regulation of immune dysfunction in IgA nephropathy. Chin J Basic Med Tradit Chin Med. 30 (3), 552-555 (2024).
  11. Deng, Q. H., Zou, D., Zhang, S. L., Zhou, X. Regulation of mucosal immunity in IgA nephropathy. Acta Chin Med. 40 (5), 1026-1031 (2025).
  12. Zhang, S. Q., Rao, X. R., Dai, X. W. Clinical observation of Yiqi Qingjie Fang. Guangming J Chin Med. (12), 44-45 (2006).
  13. Dong, M. Y., et al. Efficacy of Yiqi Qingjie Fang combined with immunosuppressants. Chin J Integr Tradit West Med. 39 (7), 791-797 (2019).
  14. Yu, Y., Yao, C., Guo, D. A. Chemical basis of traditional Chinese medicine. Acta Pharm Sin B. 11 (6), 1469-1492 (2021).
  15. Zhou, W. X., Cheng, X. R., Zhang, Y. X. Network pharmacology: A new concept. Chin J Pharmacol Toxicol. 26 (1), 4-9 (2012).
  16. Huang, Q., et al. Active components of Eucommia ulmoides. Chin J New Drugs Clin Rem. 40 (6), 460-469 (2021).
  17. Zhang, A. H., et al. Chinmedomics approach. Engineering. 5 (1), 60-68 (2019).
  18. Wang, X., Zhang, A., Sun, H., Yan, G. Serum pharmacochemistry of TCM. Phytother Res. 31, 7-14 (2017).
  19. Liu, R., Zhao, Z., Dai, S., Che, X., Liu, W. Bioactive compound identification. J Agric Food Chem. 67 (13), 3811-3825 (2019).
  20. Xu, S. Y., Bian, R. L., Chen, X. Pharmacological experimental methodology. Chin Pharmacol Bull. (1), 19(1992).
  21. Szklarczyk, D., et al. STRING v11 database. Nucleic Acids Res. 47 (D1), D607-D613 (2019).
  22. Shannon, P., et al. Cytoscape software. Genome Res. 13 (11), 2498-2504 (2003).
  23. Jeong, H., Mason, S. P., Barabási, A. L., Oltvai, Z. N. Protein network centrality. Nature. 411 (6833), 41-42 (2001).
  24. Joy, M. P., Brock, A., Ingber, D. E., Huang, S. High-betweenness proteins. J Biomed Biotechnol. (2), 96-103 (2005).
  25. Wuchty, S., Stadler, P. F. Centers of complex networks. J Theor Biol. 223 (1), 45-53 (2003).
  26. Zhou, Y., et al. Metascape resource. Nat Commun. 10 (1), 1523(2019).
  27. Burley, S. K., et al. RCSB PDB resources. Nucleic Acids Res. 53 (D1), D564-D574 (2025).
  28. Laskowski, R. A., Swindells, M. B. LigPlot+. J Chem Inf Model. 51 (10), 2778-2786 (2011).
  29. Cheung, C. K., et al. Pathogenesis of IgA nephropathy. Nat Rev Nephrol. 21 (1), 9-23 (2025).
  30. Zhao, L., et al. Triptolide and IgA nephropathy. Cell Prolif. 55 (9), e13278(2022).
  31. Tao, J., et al. JAK-STAT activity in IgA nephropathy. Clin J Am Soc Nephrol. 15 (7), 973-982 (2020).
  32. Cox, S. N., et al. Wnt/β-catenin and PI3K/AKT pathways. Kidney Int. 78 (4), 396-407 (2010).
  33. Nie, X., et al. Huagan Jian analysis. Chin Tradit Herb Drugs. 53 (2), 382-394 (2022).
  34. Wu, X. W., et al. Serum pharmacochemistry methodology. Chin J Exp Tradit Med Formulae. 25 (3), 173-179 (2019).
  35. Abbasi, K., et al. Deep learning in drug target prediction. Curr Med Chem. 28 (11), 2100-2113 (2021).
  36. Zhou, L., et al. Dioscorea nipponica mechanisms. J Ethnopharmacol. 353 (Pt A), 120272(2025).
  37. Zhang, K. Y., et al. Dose–effect network pharmacology. Chin J Hosp Pharm. 43 (7), 738-747 (2023).

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