Method Article

Décodage de l’épitranscriptome : Des analyses in silice sur le réseau réglementaire m6A dans le cancer du sein

DOI:

10.3791/70545

⸱

June 9th, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Life Sciences, College of Science and General Studies, Alfaisal University, 2Department of Biological and Biomedical Sciences, Aga Khan University, 3College of Medicine, Alfaisal University, 4Affiliated Hospital of Hunan University, School of Biomedical Sciences, Hunan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole propose une approche pour mener des analyses génétiques, moléculaires et pronostiques in silico des régulateurs de modification de m6A en intégrant des profils de mutations, des altérations du nombre de copies, de l’expression génique et des résultats cliniques à partir de jeux de données publiques issus du Cancer Genome Atlas (TCGA), du projet Genotype-Tissue Expression (GTEx) et des plateformes de microarrays.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La N6-méthyladénosine (m6A) est la modification interne d’ARN la plus abondante dans les transcrits eucaryotes et joue un rôle crucial dans le métabolisme de l’ARN, l’expression génique et l’homéostasie cellulaire. La dysrégulation des régulateurs m6A, y compris les « écrivains », les « gommes » et les « lecteurs », est de plus en plus impliquée dans la biologie du cancer ; cependant, leur rôle global dans le cancer du sein reste à comprendre. L’objectif principal de cet article sur les méthodes est de fournir aux débutants en bioinformatique un cadre étape par étape pour utiliser des ensembles de données cancéreuses publiques afin d’effectuer des analyses mutationnelles, évaluer les altérations de l’expression génique et examiner leurs liens avec la survie des patients. À titre d’étude de cas, les régulateurs m6A dans le cancer du sein ont été analysés à l’aide de jeux de données issus du Cancer Genome Atlas (TCGA), du projet Genotype-Tissue Expression (GTEx) et de plateformes de microarrays. Les profils transcriptomiques ont été analysés de manière systématique afin de démontrer les flux de travail permettant d’évaluer la pertinence pronostique des composants régulateurs de m6A dans le cancer du sein. Grâce à ce cadre analytique, des schémas distincts d’altérations génétiques et d’expression différentielle parmi les principaux régulateurs m6A ont été identifiés. Plusieurs régulateurs, dont METTL14, CBLL1, YTHDC1, HNRNPC, HNRNPA2B1 et RBMX, étaient associés à une meilleure survie des patients, tandis que YWHAG était associé à une faible survie globale. Cette étude offre une vue d’ensemble complète de la génomique des systèmes sur les gènes régulateurs m6A dans le cancer du sein tout en démontrant un flux de travail pratique et reproductible en bioinformatique basé sur le web. Ces résultats font progresser la compréhension de la régulation épitranscriptomique dans le cancer du sein et constituent une base pour le développement de nouvelles stratégies diagnostiques et thérapeutiques basées sur le m6A.

Introduction

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Les modifications épitranscriptomiques représentent une couche importante de régulation génétique post-transcriptionnelle et contribuent à divers processus cellulaires et états pathologiques. Parmi plus de 170 modifications d’ARN identifiées à ce jour, la N6-méthylénosine (m6A) est la plus répandue et la mieux caractérisée chez les ARNmeucaryotes 1. Installé par des complexes « écrivains » comme METTL3/METTL14, retiré par des « gommes » comme FTO et ALKBH5, et interprété par des protéines « lectrices » incluant les membres des familles YTH et IGF2BP, m6A orchestre le splicing, la stabilité, le transport et la traduction de l’ARN, influençant ainsi des processus biologiques clés tels que le développement, la différenciation et la réponse au stress 2,3.

Des modifications des composantes régulatrices de m6A ont été rapportées sur un large éventail decancers 4. Dans de nombreux cancers, une activité aberrante de m6A entraîne des phénotypes malins ; par exemple, une expression élevée de METTL3 favorise l’initiation et la progression du cancer de la prostate en modulant la voie du hérisson et la méthylation de l’ARNMYC 5,6. Initialement impliquée dans l’exercice d’effets oncogéniques dans la leucémie myéloïde aiguë, la FTO a montré qu’elle favorisait la progression tumorale dans les cancers du foie, du poumon et ducolorectal 7,8,9,10. Cependant, des rôles dépendants du contexte de FTO et d’ALKBH5 ont été identifiés, illustrant la double nature de la régulation médiée par m6A, qui peut favoriser à la fois la signalisation oncogénique et la signalisation tumoralesuppressive 11,12,13,14. Les lecteurs M6A, incluant YTHDF1/2/3, les ribonucléoprotéines nucléaires hétérogènes (hnRNP) et les protéines liant les facteurs de croissance insulino-2 (IGF2BP1-3), ont également été associés à la carcinogenèse 15,16,17.

Dans le cancer du sein, de plus en plus de preuves suggèrent que les régulateurs m6A sont fréquemment déréglés et peuvent être associés à des sous-types tumoraux, à des caractéristiques immunitaires et à des résultatscliniques 18,19. De nombreuses études mécanistes positionnent METTL3 comme un facteur pro-oncogène fréquemment surélevé dans le cancer du sein. L’installation de m6A médiée par METTL3 peut stabiliser ou améliorer la traduction des transcrits favorisant la prolifération, la transition épithéliale-mésenchymatose (EMT), la métastase et lachimiorésistance 20. Il a également été démontré que METTL3 favorise la progression du cancer du sein en ciblantBcl-22-21. ALKBH5 a été impliqué dans la régulation des programmes de stemplintabilité cancéreuse via NANOG et d’autres molécules liées à la tige, mais son influence peut varier selon le contextetumoral 22.

Alors que la liste des régulateurs m6A continue de s’élargir ces dernières années, une mise à jour sur la manière dont les nouveaux régulateurs identifiés pourraient être dérégulés dans le cancer du sein est nécessaire. Le tableau 1 présente une liste des régulateurs m6A incluant les auteurs, lecteurs et gommeuses de modifications m6A. De plus, de nouveaux régulateurs m6A, dont LRPPRC et YWHAG, ont été identifiés avec des implications dans la progression du cancer23, 24, 25. Par conséquent, une caractérisation génétique et moléculaire complète de tous les régulateurs m6A connus a été réalisée dans le cancer du sein à l’aide d’outils pouvant être utilisés par des chercheurs ayant une formation bioinformatique limitée.

L’objectif de cet article de Méthodes est de présenter un protocole bioinformatique basé sur une plateforme étape par étape pour analyser les régulateurs m6A dans le cancer du sein, en utilisant des ressources de génomique du cancer accessibles au public. En utilisant des ensembles de données du Cancer Genome Atlas (TCGA) (www.cancer.gov/tcga), du projet Genotype Tissue Expression (GTEx) 26, ainsi que des plateformes analytiques web telles que cBioPortal et UCSC Xena, ce protocole démontre des flux de travail reproductibles pour évaluer les profils mutationnels, les altérations de l’expression génique et l’association avec la survie du patient. Cette approche visualisée et accessible vise à faciliter l’adoption de l’analyse de données épitranscriptomiques par des chercheurs débutants en bioinformatique du cancer.

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Protocol

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REMARQUE : La liste des gènes codant pour les régulateurs de méthylation m6A, classés en écrivains, lecteurs et gommes, est présentée dans le tableau 1. Tous les gènes listés ont été inclus dans les analyses ultérieures des mutations, des schémas d’expression et de la survie globale. Tous les logiciels et outils utilisés dans cette étude sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Identification des altérations génétiques dans les régulateurs m6A

  1. Accédez au cBioPortal pour la génomique du cancer. Rendez-vous sur le site web du cBioportal (www.cbioportal.org)27,28. Depuis la page d’accueil, sélectionnez l’onglet « Requête » pour commencer une nouvelle analyse.
  2. Sélectionnez l’étude et la cohorte appropriées sur le cancer.
  3. Dans la barre de recherche « Sélectionner des études pour visualisation et analyse », tapez « Carcinome invasif du sein » et sélectionnez « Carcinome invasif du sein (TCGA, Pan-Cancer Atlas) ».
  4. En bas, sélectionnez « Requête par gène ».
    ESSENTIEL : Assurez-vous que la cohorte sélectionnée (996 échantillons) inclut à la fois des données de mutation et d’altération du nombre de copies (CNA).
  5. Définissez la requête génétique. Dans la section « Entrer les gènes », saisissez les symboles du gène HUGO pour la liste complète des régulateurs m6A en cours d’investigation.
    REMARQUE : Les gènes peuvent être saisis sous forme de liste séparée par des espaces. Dans la section « Sélectionner les profils génomiques », assurez-vous que les deux types de données suivants sont cochés : Mutations et Altérations du numéro de copie.
  6. Sous « Sélectionner patient/ensemble de cas », choisissez l’ensemble d’échantillons par défaut correspondant à la cohorte avec tous les cas profilés.
  7. Cliquez sur le bouton bleu « Soumettre une requête ».
  8. Récupérez et interprétez les données d’altérations génétiques. À la soumission, le résultat se charge dans l’onglet « résumé ». La visualisation centrale « OncoPrint » offre un aperçu immédiat des altérations génétiques de tous les gènes interrogés dans la cohorte, qui peut être téléchargé.
  9. À côté de l’OncoPrint, localisez le graphique « Résumé du type de cancer ». Cela fournit une répartition quantitative des altérations selon les sous-types de cancer du sein.
  10. Réalisez une analyse pan-cancéreuse. Retournez à la page d’accueil du cBioPortal et sélectionnez « TCGA PanCancer Atlas Studies » sous l’onglet « Requête ».
  11. Dans la boîte d’entrée des gènes, entrez la même liste des gènes régulateurs m6A.
  12. Cliquez sur « Soumettre une requête » et, sur la page des résultats, accédez à l’onglet « Résumé des types de cancer ». Cela offre une vision pan-cancéreuse.

2. Analyse transcriptomique comparative des régulateurs m6A utilisant UCSC Xena.

  1. Accédez à la plateforme Xena de l’UCSC. Rendez-vous sur le site web de Xena de l’UCSC (https://xena.ucsc.edu)29.
  2. Depuis la page d’accueil, cliquez sur le bouton « Lancer Xena » pour accéder au navigateur principal d’analyse.
  3. Dans le navigateur Xena, cliquez sur « DATA SETS ».
  4. Parmi les ensembles de données, sélectionnez « TCGA TARGET GTEx ». Celle-ci contient des données ARN-Seq traitées uniformément provenant des tissus normaux des projets TCGA et GTEx.
  5. À la page suivante, cliquez sur « VISUALISER ».
  6. Définissez la variable phénotype (groupe d’échantillon). Dans la section « Sélectionner votre première variable », sélectionnez « Catégorie principale » dans le type de données phénotypique.
  7. Cliquez sur « VERS LA DEUXIÈME VARIABLE ». Ensuite, dans le type de données génomique, cochez « Expression génique » dans le jeu de données. Ajoutez la liste des gènes dans la case « Ajouter gène ou position ». Cliquez sur « Terminé ».
  8. Visualisez des motifs d’expression avec une carte thermique.
  9. Pour séparer les échantillons de sein (TCGA+GTEx) du TCGA TARGET GTEx, tapez « Sein » et utilisez l’option filtre pour conserver les échantillons.
  10. La carte thermique est désormais visible et peut être téléchargée en PDF.
  11. Générez des diagrammes en boîte comparatifs pour des gènes individuels. Pour quantifier et visualiser les différences d’expression d’un gène spécifique, utilisez le « Visualiser comme graphique ». Grâce à cette option, les données peuvent être consultées sous forme de diagramme de boîtes, de diagramme de points et de graphisme de violon, comparant la distribution d’expression entre les deux groupes d’échantillons.
  12. Utilisez l’option « Télécharger en PDF » pour télécharger les charts.
  13. La signification statistique (valeur p) peut être obtenue en cliquant sur « STATISTIQUES ».

3. Évaluation de la signification pronostique des régulateurs m6A à l’aide du ploteur Kaplan-Meier.

  1. Accédez à l’outil Kaplan-Meier Plotter. Rendez-vous sur le site web du Kaplan-Meier Plotter (https://kmplot.com/analysis)30.
  2. Depuis la page d’accueil, sélectionnez l’onglet « cancer du sein » pour lancer une analyse spécifique aux jeux de données sur le cancer du sein.
  3. Configurez la requête génétique pour un seul gène.
  4. Dans la section d’entrée principale, localisez la case « Symbole de gène ».
  5. Saisissez le symbole officiel du gène régulateur m6A à analyser (par exemple, METTL3).
    CRITIQUE : Juste sous la case d’entrée du gène, localisez et activez la case « Only JetSet best probe set ». Cela garantit que la sonde microarray la plus fiable et spécifique est automatiquement sélectionnée pour votre gène, optimisant ainsi la qualité et la reproductibilité des données.
  6. Définissez les paramètres d’analyse de survie. Dans la section « Survie », sélectionnez « Survie globale (OS) » comme point d’arrivée principal pour cette analyse. L’outil utilisera automatiquement les données de 1880 patientes atteintes de cancer du sein lorsque ce paramètre sera sélectionné.
  7. Assurez-vous que l’option « Séparer les patients par » soit réglée sur « médiane ». Cela stratifiera les patients en deux groupes égaux ; haute expression et faible expression, basées sur la valeur médiane d’expression du gène interrogé sur tous les échantillons.
  8. Le « seuil de suivi » peut être utilisé pour sélectionner la période de suivi. Pour cette étude, 180 mois ont été sélectionnés.
  9. Générez et interprétez le complot de Kaplan-Meier.
  10. Cliquez sur le bouton « Dessiner le graphique Kaplan-Meier ».
  11. Une nouvelle fenêtre se chargera, affichant la courbe de survie.
  12. Interpréter les éléments clés de l’intrigue ; L’axe X indique le temps en mois, l’axe Y indique la probabilité de survie globale, les deux lignes colorées représentent les courbes de survie pour les groupes de patients à haute expression (rouge) et à faible expression (noir). La valeur P de rang logarithmique est affichée, indiquant la signification statistique de la différence entre les deux courbes de survie.

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Results

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Paysage mutationnel des régulateurs de méthylation de m6a dans le cancer du sein

Dans une étude antérieure sur l’analyse génomique des ensembles de données TCGA, des mutations récurrentes dans plusieurs gènes codant pour régulateurs de la méthylation de l’ADN ont étérapportées 31. Dans la présente étude, cBioPortal a été utilisé pour analyser le jeu de données « Breast Invasive Carcinoma (TCGA, PanCancer Atlas) » afin d’examiner les profils mutationnels...

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Discussion

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L’article de cette méthode propose un flux de travail complet, accessible et intégré pour le profilage multi-omique systématique et la traduction clinique de toute signature génique dans la recherche sur le cancer, démontré ici par l’analyse des régulateurs de méthylation de l’ARN m6A dans le cancer du sein. En combinant ces principales plateformes publiques de bioinformatique, cette approche permet aux chercheurs de progresser efficacement de la découverte génomique à des hypothèses cli...

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Disclosures

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Des parties de ce manuscrit ont été révisées à l’aide d’outils linguistiques basés sur l’IA pour améliorer la clarté et la lisibilité. Tout contenu substantiel, interprétation, analyse et conclusion sont la propriété des auteurs. Nous déclarons qu’il n’y a pas de conflit d’intérêts.

Acknowledgements

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Une subvention de l’Université Alfaisal (IRG 25450) à RM est heureusement reconnue.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
cBioPortalMemorial Sloan-Kettering Cancer Centerhttps://www.cbioportal.org
Genotype-Tissue Expression (GTEx)GTEx Consortiumhttps://gtexportal.org
Kaplan-Meier PlotterGyorffy lab/A5 Genetics Ltdhttps://kmplot.com
The Cancer Genome Atlas (TCGA)National Cancer Institute (NCI)https://www.cancer.gov/tcga
UCSC Xena BrowserUniversity of California Santa Cruzhttps://xenabrowser.net

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m6A ModificationEpitranscriptomic RegulationBreast CancerRNA Methylationm6A RegulatorsBioinformatics WorkflowGene Expression AnalysisCancer GenomicsPrognostic BiomarkersTCGA Datasets

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