Exploration du mécanisme du granule de Guben Pingchuan dans le traitement de l’asthme bronchique

Résumé

Ce protocole étudie le mécanisme d’action des granules de Guben Pingchuan dans l’asthme bronchique en utilisant la pharmacologie en réseau, le docking moléculaire et la validation in vivo.

Résumé

Cette étude étudie le mécanisme d’action des granules de Guben Pingchuan dans le traitement de l’asthme bronchique en utilisant la pharmacologie en réseau, le docking moléculaire et la validation expérimentale. Les ingrédients actifs et les cibles correspondantes ont été identifiés à l’aide des bases de données TCMSP, HERB et SymMap. Les cibles liées à l’asthme bronchique ont été collectées auprès de GeneCards, OMIM, TTD, DrugBank et PharmGKB. Des cibles qui se chevauchent ont été identifiées, et des réseaux composant-cible et d’interaction protéine-protéine (IPP) ont été construits. Les analyses d’enrichissement de l’Ontologie des Gènes (GO) et de la Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) ont été réalisées avec correction du taux de fausse découverte (FDR). Un amarrage moléculaire a été réalisé pour évaluer l’affinité de liaison, suivi d’une validation in vivo . Un total de 121 composants actifs et 234 cibles liées aux médicaments ont été identifiés, donnant 155 cibles qui se chevauchent. Les cibles principales comprenaient TP53, AKT1, TNF et IL6. L’analyse KEGG a démontré un enrichissement significatif de la voie de signalisation PI3K–Akt, qui a été sélectionnée pour validation expérimentale. L’amarrage moléculaire a révélé une forte affinité de liaison entre les composants du cœur et AKT1. Chez les rats asthmatiques induits par l’ovalbumine, le granule de Guben Pingchuan a réduit les niveaux sériques d’IL-4 et d’IL-10 , augmenté l’expression de FoxP3 dans les tissus pulmonaires et augmenté les niveaux d’ARNm de PI3K et d’AKT . Ces résultats indiquent que le granule de Guben Pingchuan soulage l’asthme bronchique en modulant la voie de signalisation PI3K–Akt ., en régulant les cytokines inflammatoires et en améliorant la fonction régulatrice des lymphocytes T.

Introduction

L’asthme bronchique est une maladie respiratoire chronique hétérogène caractérisée par une inflammation des voies respiratoires, une hyperréactivité des voies respiratoires, une hypersécrétion de mucus et un remodelage^{des voies respiratoires 1}. Sa pathogenèse implique des interactions complexes entre l’activation des cellules immunitaires, les médiateurs inflammatoires et de multiples voies de signalisation. Cliniquement, l’asthme se manifeste par des sifflements récurrents, une dyspnée, une oppression thoracique et une toux. L’inflammation des voies respiratoires est un mécanisme central sous-jacent à l’apparition et à la progression de la maladie, caractérisée par une sécrétion accrue de cytokines pro-inflammatoires telles que IL-6, IL-4, IL-17 et TNF-α., une infiltration des cellules inflammatoires incluant les éosinophiles et les neutrophiles, ainsi que des modifications structurelles telles que la prolifération des muscles lisses des voies respiratoires, l’épaississement de la membrane basale et l’hyperplasie des glandes muqueuses^2˒3. Ces processus pathologiques conduisent finalement à une obstruction des voies respiratoires et à une altération du flux d’air.

La physiopathologie de l’asthme est régulée par plusieurs voies de signalisation interagissantes plutôt que par un seul mécanisme. La voie de signalisation PI3K–Akt joue un rôle clé dans la modulation de l’équilibre immunitaire, en particulier l’axe Treg/Th17, en régulant l’expression de FoxP3. Cette voie interagit également avec les voies de signalisation IL-17 et TNF pour amplifier les réponses inflammatoires et le remodelage des voies respiratoires, contribuant à l’hétérogénéité de la maladie et à la résistance au^{traitement 3,4}. Les données épidémiologiques indiquent une augmentation continue de la prévalence mondiale de l’asthme, avec plus de 358 millions de personnes atteintes dans le monde et environ 45,7 millions de patients adultes en^{Chine 5,6}. Les stratégies de traitement actuelles reposent principalement sur des agonistes β₂ inhalés et des glucocorticoïdes ; Cependant, ces thérapies ciblent des mécanismes pathologiques limités et peuvent entraîner des effets indésirables et une résistance aux glucocorticoïdes chez certains patients. La dysrégulation de voies telles que PI3K–Akt. a été associée à une réactivité thérapeutique réduite, soulignant la nécessité d’approches thérapeutiques^{multi-cibles 7,4}.

La médecine traditionnelle chinoise (MTC) classe l’asthme comme le « syndrome de Xiao », associé à des carences pulmonaires, de la rate et des reins, combinées à des facteurs pathogènes externes. Les formulations de MTC ont été largement utilisées dans la prise en charge de l’asthme en raison de leurs caractéristiques multi-composantes et^{multi-cibles 8,9}. Contrairement aux agents pharmacologiques à cible unique, les composés de la MTC exercent des effets thérapeutiques en coordonnant la régulation de multiples voies biologiques, en accord avec la physiopathologie complexe de l’asthme¹⁰. La pharmacologie des réseaux fournit une approche au niveau des systèmes pour analyser les interactions entre les composants du médicament, les cibles et les voies pathologiques, permettant l’identification des principaux composés bioactifs et des mécanismes^{moléculaires 11}. Le docking moléculaire complète encore cette approche en évaluant l’affinité de liaison entre les petites molécules et les protéines cibles.

Le granule de Guben Pingchuan est une formulation médicinale traditionnelle chinoise composée de huit composants à base de plantes, dont Ephedra sinica (herbe Ephedra ), fruit de Psoralea corylifolia , graine de Prunus armeniaca (graine d’abricot), racine de Pseudostellaria heterophylla , fruit de Perilla frutescens , feuille d’Eriobotrya japonica (feuille de néfle), bulbe de Lilium brownii et Epimedium brevicornum. Cette formulation est traditionnellement utilisée pour renforcer l’énergie vitale, éliminer le mucus, et soulager la respiration sifflante. Des études cliniques antérieures ont démontré son efficacité thérapeutique dans l’asthme bronchique, avec des taux de réponse plus élevés que les traitements^{conventionnels 12}.

Pour élucider le mécanisme d’action sous-jacent, une approche intégrée combinant pharmacologie de réseau, docking moléculaire et validation expérimentale in vivo est appliquée. La pharmacologie en réseau est utilisée pour identifier les composants actifs et les cibles potentielles associées à l’asthme bronchique. Le docking moléculaire est utilisé pour évaluer les interactions entre les composés clés et les protéines cibles. Une validation expérimentale dans un modèle animal est ensuite réalisée afin d’évaluer les effets régulateurs sur les voies de signalisation critiques, en particulier la voie PI3K–Akt . Cette approche vise à fournir des perspectives mécanistes sur les effets thérapeutiques multi-cibles du granule de Guben Pingchuan et à soutenir son application dans le traitement de l’asthme bronchique.

Protocole

Toutes les procédures animales ont été approuvées par le Comité d’éthique animale de l’Université de médecine traditionnelle chinoise du Liaoning (Approbation n° : 21000042023058) et réalisées conformément aux directives institutionnelles. Les outils de recherche utilisés dans ce protocole sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Bases de données et logiciels

1. Accédez aux bases de données et logiciels suivants : TCMSP, HERB, SymMap, PubChem, STRING, GeneCards, OMIM, TTD, DrugBank, PharmGKB, DAVID, UniProt et Cytoscape (version 3.9.1).

2. Acquisition des cibles composantes

1. Récupérez les constituants chimiques de l’herbe Ephedra, des graines d’abricot, de la racine de Pseudostellaria, du fruit de Perilla, de la feuille de néfle, des espèces de Lilium et de l’Epimedium à partir de la base de données^{TCMSP 13}. Récupérer les composés de Psoralea à partir des bases de données HERB et SymMap.
2. Criblez les composés actifs en utilisant la biodisponibilité orale (OB ≥ 30 %) et la ressemblance du médicament (DL ≥ 0,18)^14,15.
3. Prédire les gènes cibles en utilisant TCMSP. Standardisez toutes les cibles à l’aide de la base de données UniProt en sélectionnant Homo sapiens. Supprimez les cibles dupliquées et invalides, y compris les entrées non humaines, les protéines non annotées et les identifiants obsolètes.

3. Acquisition de cibles pour l’asthme bronchique

1. Recherchez GeneCards, OMIM, TTD, DrugBank et PharmGKB en utilisant le mot-clé « asthme bronchique ». Fixez le score de pertinence des GeneCards à >4. Fusionner toutes les cibles récupérées et supprimer les doublons.

4. Identification des cibles d’intersection

1. Importez des cibles médicamenteuses et des maladies dans un outil d’analyse Venn en ligne. Identifier les cibles qui se chevauchent et enregistrer le nombre total pour une analyse ultérieure.

5. Construction du réseau composante–cible

1. Importez les cibles d’intersection dans Cytoscape 3.9.1. Construisons le réseau composant–cible. Ajustez la taille et la couleur des nœuds en fonction des valeurs de degré.

6. Construction du réseau d’interactions protéine-protéine (IPP)

1. Téléverser les cibles d’intersection dans la base de données STRING. Sélectionnez Homo sapiens et fixez le score de confiance à ≥0,900. Exportez le réseau et importez-le dans Cytoscape.
2. Calculez les paramètres topologiques (centralité des degrés, centralité entre les deux et centralité de proximité). Identifier les cibles principales en utilisant des seuils médians et un degré >20.

7. Analyse d’enrichissement GO et KEGG

1. Téléverser des cibles qui se chevauchent dans la base de données DAVID ou analyser en utilisant le package R clusterProfiler.
2. Effectuer une analyse d’enrichissement par ontologie génique (GO) pour les catégories de processus biologiques, de composants cellulaires et de fonctions moléculaires.
3. Effectuer une analyse d’enrichissement des voies KEGG. Appliquez la correction du taux de fausses découvertes (FDR) et fixez le seuil de signification à FDR < 0,05.
4. Visualisez les termes enrichis en haut à l’aide de graphiques en barres ou de diagrammes à bulles.

8. Amarrage moléculaire

1. Téléchargez les structures 2D des composés de base depuis PubChem. Générez des structures 3D via ChemOffice et enregistrez comme fichiers mol2.
2. Téléchargez les structures protéiques depuis la base de données RCSB PDB. Retirez les molécules d’eau et les ligands à l’aide de PyMOL.
3. Effectuez un amarrage moléculaire en utilisant AutoDock Vina. Définir les paramètres de la grille et lancer des simulations d’amarrage.
4. Enregistrez les énergies de liaison (kcal/mol) et les résidus interagissant avec les clés. Visualisez les résultats de l’amarrage à l’aide de plateformes de modélisation moléculaire, de visualisation et de simulation.

9. Validation expérimentale

1. Animaux
   1. Obtenir 48 rats mâles de Sprague–Dawley (9 semaines, 220–240 g). Animaux domestiques à 20–25 °C avec une humidité de 55 % à 60 % dans des conditions standard.
2. Médicaments et réactifs
   1. Préparez des granulés de Guben Pingchuan composés d’herbe Ephedra, Psoralea, graine d’abricot, racine de Pseudostellaria, fruit de Perilla, feuille de néfle, Lilium et Epimedium.
   2. Préparez la dexaméthasone, l’ovalbumine (OVA), l’hydroxyde d’aluminium, les kits ELISA, les kits d’extraction d’ARN et les anticorps listés dans le tableau des matériaux.
3. Instruments
   1. Préparez l’équipement standard de laboratoire, incluant un lecteur de microplaques, un système d’électrophorèse, un microtome de paraffine et un système d’imagerie.
4. Regroupement et traitement des animaux
   1. Répartissez aléatoirement les rats en six groupes (n = 8) : groupe témoin vide, groupe modèle, groupe dexaméthasone (0,3 mg/kg), groupe de la médecine chinoise à faible dose, groupe de médecine chinoise à dose moyenne et groupe de médecine chinoise à haute dose.
   2. Les jours 1, 7 et 14, administrez 1 mL d’injection intraperitonéale de 10 % OVA + 10 % d’Al(OH)₃ aux rats du groupe modèle, du groupe médecine chinoise à faible dose, du groupe médecine chinoise à dose moyenne, du groupe médecine chinoise à forte dose et du groupe dexaméthasone pour la sensibilisation.
   3. Administrez 1 mL d’injection intrapéritonéale de solution physiologique à 0,9 % aux rats du groupe témoin blanc aux jours 1, 7 et 14.
   4. Du 15e au 21e jour, effectuez une stimulation inhalée nébuleuse une fois par jour pendant 20 minutes. Administrez une inhalation nébuleuse à 5 % d’OVA aux rats du groupe modèle, du groupe de la médecine chinoise à faible dose, du groupe médecine chinoise à dose moyenne, du groupe médecine chinoise à haute dose et du groupe dexaméthasone.
   5. Administrez une inhalation physiologique séline nébuleuse à 0,9 % aux rats du groupe témoin blanc des jours 15 à 21.
   6. Administrez les traitements par gavage orale une fois par jour des jours 22 à 36 selon le groupe de traitement assigné.
   7. Surveillez quotidiennement le poids corporel et l’état général tout au long de l’expérience. La chronologie expérimentale est résumée dans le tableau 1.
5. Histopathologie
   1. Collectez le tissu pulmonaire. Corrigez, intégrez et sectionnez les échantillons. Effectuer une coloration à l’hématoxyline–éosine.
   2. Effectuer une coloration de Masson pour évaluer le dépôt de collagène.
6. Analyse RT-PCR
   1. Extraire l’ARN total du tissu pulmonaire.
   2. Homogénéisez les tissus pulmonaires gelés dans des conditions de température ultra-basse. Après avoir pesé l’échantillon, transférez-le rapidement dans un mortier pré-refroidi contenant de l’azote liquide et moyez-le en poudre.
   3. Transférez l’échantillon en poudre dans un tube centrifugeuse. Ajoutez 1 mL de TransZol UP et 0,2 mL de réactif d’extraction ARN à chaque 50–100 mg de tissu. Secouez le tube à température ambiante pendant 5 minutes.
   4. Centrifugez l’échantillon à 1000 × g et 2–8 °C pendant 15 minutes. Transférez la phase aqueuse incolore dans un nouveau tube centrifugeuse.
   5. Ajoutez 1 mL de TransZol jusqu’à 0,5 mL d’isopropanol. Faites couver le mélange à température ambiante pendant 10 minutes.
   6. Centrifugez l’échantillon à 1000 × g pendant 10 minutes. Ajoutez 1 mL d’éthanol à 75 % et centrifugez à nouveau pendant 5 minutes.
   7. Jetez le surnageant et laissez sécher le précipité à température ambiante à l’air pendant 5 minutes. Dissoudre le précipité dans 50 à 100 μL de solution d’ARN, puis incuber pendant 10 minutes.
   8. Conservez l’échantillon à −70 °C pour une conservation à long terme.
   9. Synthétiser de l’ADNcC et effectuer une PCR quantitative pour mesurer l’expression PI3K et AKT.
7. ELISA
   1. Échantillons de sérum de dégel à 4 °C. Mesurez les niveaux d’IL-4 et IL-10. à l’aide de kits ELISA selon les instructions du fabricant.
8. Immunohistochimie
   1. Tissu pulmonaire fixé avec 4 % de paraformodéhyde, incorporé dans la paraffine, tranché, déciré et hydraté.
   2. Effectuer la récupération d’antigènes, le blocage et l’incubation des anticorps. Selon le kit d’immunohistochimie FoxP3, la solution de coloration DAB et l’expression positive apparaît sous forme de coloration jaune brunâtre ou brun foncé.
   3. Observez et photographiez au microscope, et utilisez le logiciel Image J pour l’analyse statistique quantitative de l’expression FoxP3.
9. Analyse statistique
   1. La normalité des données de test utilisant le test de Shapiro–Wilk et l’homogénéité de variance selon le test de Levene.
   2. Analyser les données à l’aide de tests ANOVA unidirectionnels ou non paramétriques selon les besoins. Exprimez les données en moyenne ± écart-type.
   3. Définissons p < 0,05 comme statistiquement significatif. ★★p < 0,01 et ★p < 0,05 vs. groupe témoin ; ◆◆p < 0,01 et ◆p < 0,05 vs groupe de modèles ; ##p < 0,01 et #p < 0,05 contre le groupe dexaméthasone.

Tableau 1 : Chronologie expérimentale. Calendrier de sensibilisation, de mise en question et de procédures de traitement. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Résultats

Dépistage des ingrédients actifs
Un total de 121 composants actifs ont été identifiés à partir de la base de données TCMSP après filtrage pour l’activité cible. Celles-ci comprenaient 23 composantes de l’herbe Ephedra , 7 de Psoralea, 19 de graines d’abricot, 8 de racines de Pseudostellaria , 16 de fruits de Perilla, 18 de feuilles de nèfle, 7 de Lilium et 23 d’Epimedium. (Tableau 2). Seize composants coura...

Discussion

L’asthme bronchique est une maladie courante dans le département^{respiratoire 16}. Il s’agit d’un trouble obstructif des voies respiratoires causé par des allergènes et une hyperréactivité^{des voies respiratoires 17}. Elle présente une forte incidence clinique, est sujette à la récidive et est difficile à guérir, ce qui affecte significativement la santé et la qualité de vie des patients. L’Initiative mondiale pour l’asthme (GINA) 2025 rapporte...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
qPCR Kit	Novogene	NQ-001, 2×1mL	Détection de l'expression relative de l'ARNm des gènes cibles
aluminum hydroxide Al(OH)3	Shanghai Yubo Biotechnology Co., LTD	YB-AL001, 500g	Adjuvant immunologique pour améliorer la réponse immunitaire antigénique
BCA protein Concentration Test Kit	Fode Biotechnology Co., LTD	FD2001, 100 pièces par boîte	Quantification des protéines totales pour standardiser le chargement des échantillons
Chemiluminescence imaging system	Tanon	5200Multi	Imagerie des bandes WB, collecte et analyse des images de gel et de blot
Color Pre-stained Protein Marker	Biolaibo Technology Co., LTD	BL005, 10-180kDa, 500μL	Référence de poids moléculaire des protéines pour les expériences d'électrophorèse
Enhanced RNA Extraction Kit	Whole Golden Branch	ET111-01v2, 50 pièces par boîte	Extraction et purification de l'ARN total à partir de tissus et de cellules
Enzyme-linked immunosorbent assay reader	U.S. Biotek Company	Epoch/BioTek	Détection quantitative des cytokines et des contenus protéiques dans les échantillons
FOXP3 primary antibody	Biyun Tian Biotechnology Co., LTD	AG5002, 50ul/pièce	Liaison ciblée à la protéine FOXP3 pour l'immunodosage
Gel Rapid Preparation Kit	Shanghai Yamei	PG212, 30 ensembles	Préparation rapide du gel de séparation et du gel de tassement pour l'électrophorèse
masson Staining Kit	Solabao Biotechnology Co., LTD	G1340, 100 comprimés	Coloration spécifique des fibres de collagène tissulaire et observation de la fibrose
OVA	Beijing Boaotoda Technology Co., LTD.	OVA-10g, ≥98%	Allergène classique pour établir des modèles d'animaux allergiques
primary Antibody Dilution solution	Biyun Tian Biotechnology Co., LTD	P0256-100ml	Dilution de l'anticorps primaire, maintien de l'activité et réduction des liaisons non spécifiques
Rat IL-10ELISA Kit	Andy Bio	E-30649, 96T	Détection quantitative du facteur anti-inflammatoire IL-10 du rat
Rat IL-4ELISA Kit	Andy Bio	E-30623, 96T	Détection quantitative du facteur inflammatoire IL-4 du rat Th2
Reverse Transcription Kit	Baori Medical Technology Co., LTD	E047-01A	Transcription inverse de l'ARN en ADNc pour l'analyse ultérieure des gènes
Saturated Oil Red O Kit	Solabao Biotechnology Co., LTD	G1261, 50mL×2 flacon	Coloration et détection spécifiques des gouttelettes lipidiques tissulaires
Shangyang Anti-Rabbit Secondary Antibody	Proteintech Biological Co., LTD	SA00001-2, 1mL	Liaison à l'anticorps primaire de lapin pour la réaction colorée WB
TBST Buffer	Wuhan Sewell Biotechnology Co., LTD	G2150, 1L / flacon	Tampon pour le lavage de la membrane et la dilution des anticorps en Western blot
Transfer Electrophoresis System	Shanghai Jingcanshi Precision Machinery Co., Ltd.	PowerPac Basic	Utilisé pour l'électrophorèse des protéines et le transfert de membrane en Western blot
Ultra-low temperature refrigerator	Zhongke Meiling	MDF-382	Cryoconservation à basse température des réactifs, des échantillons de protéines et des tissus
Vertical electrophoresis tank	BIO-RAD	JY-ZY5	Séparation électrophorétique verticale des échantillons de protéines et d'acides nucléiques