Un système de contre-sélection basé sur la toxine pour la délétion génique sans marqueur et la mutagenèse des transposons Tn5 à haute densité chez Pectobacterium brasiliense

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour générer des délétions génétiques non marquées et construire des bibliothèques mutantes à insertion Tn5 à l’échelle du génome dans Pectobacterium brasiliense, un phytopathogène responsable du blackleg de la pomme de terre et de la pourriture molle. Cette approche permet une analyse génétique inverse efficace et facilite la caractérisation fonctionnelle des gènes associés à la virulence chez cet organisme.

Résumé

Pectobacterium brasiliense est une bactérie hautement pathogène responsable de la pourriture molle du tubercule de pomme de terre, de la pourriture des jambes noires et de la tige aérienne. L’élucidation de ses mécanismes pathogènes est essentielle pour le contrôle des maladies ; cependant, les outils génétiques pour cet organisme restent limités. Un système de contre-sélection basé sur la toxine a été développé pour permettre la délétion génique sans marqueur et la mutagenèse des transposons Tn5 à haute densité. La toxine vmi480 dérivée du plasmide pLP12 a été utilisée comme marqueur de contre-sélection pour construire le vecteur suicide pKV2. Grâce à ce système, le gène recA de la souche SM P. brasiliense a été supprimé avec succès. Le mutant recA résultant a servi de souche parentale pour la construction d’une bibliothèque d’insertion Tn5 comprenant plus de 12 000 mutants par conjugaison avec la souche auxiliaire RHO3 portant pKV2-LLtnp. Dans ce plasmide dérivé, la toxine vmi480 a été remplacée par une transposase Tn5 hyperactive sous le contrôle d’un promoteur de lac orienté vers l’extérieur afin de réduire les effets polaires. Des tests d’inoculation tuberculeuse à haut débit ont permis d’identifier des mutants déficients en pathogénicité, y compris des insertions dans le système de sécrétion de type II, un déterminant clé de la virulence qui médie la sécrétion des enzymes dégradant la paroi cellulaire végétale. Cette plateforme soutient la génomique fonctionnelle et facilite l’étude des mécanismes de virulence chez ce pathogène économiquement important.

Introduction

P. brasiliense est l’une des espèces les plus agressives du genre Pectobacterium et est l’agent causal de la pourriture molle de la pomme de terre, de la pourriture des jambes noires et de la pourriture aérienne^{de la tige 1}. Ces maladies entraînent une perte de rendement estimée à 30 % de pommes de terre, une culture classée comme la troisième source alimentaire la plus importante au monde et un élément clé du système de production agricole^{chinois 2}. Malgré son impact économique, les mécanismes moléculaires régissant la pathogénicité de P. brasiliense restent insuffisamment compris, principalement en raison du manque d’outils de manipulation génétique efficaces et reproductibles pour cette^{espèce 3,4,5}.

Les études génomiques fonctionnelles chez de nombreuses bactéries phytopathogènes reposent sur des systèmes robustes d’échange allélique et de mutagenèse des transposons ; cependant, des outils génétiques comparables pour P. brasiliense restent limités ou inefficaces. En particulier, les marqueurs de contre-sélection efficaces compatibles avec cette espèce sont rares. Bien que le gène sacB soit largement utilisé comme marqueur de contre-sélection pour la délétion génique chez diverses bactéries, P. brasiliense pourrait présenter une tolérance élevée jusqu’à 50 % de saccharose lors du processus^{de sélection 5}. Cette tolérance reflète probablement un manque de sensibilité aux toxines, possiblement dû à la conversion enzymatique du saccharose en polymères sucrés. De plus, des concentrations élevées de saccharose peuvent induire un choc osmotique^{délétère 6}. De plus, des méthodes efficaces de mutagenèse à grande échelle, telles que la construction de bibliothèques d’insertion de transposons Tn5, n’ont pas encore été bien établies pour cet organisme.

Pour remédier à ces limitations techniques, un système de contre-sélection basé sur les toxines a été développé, et un flux de travail robuste de dépistage de la mutagenèse Tn5 a été mis en place pour P. brasiliense. Comparée aux méthodes traditionnelles à base de saccharose, cette approche basée sur les toxines offre des avantages distincts, notamment une rigueur de sélection accrue, une plus grande spécificité dans l’identification des événements de double croisement et l’élimination du stress osmotique confondant. Des systèmes similaires basés sur la toxine-antitoxine vmi480 ont été mis en œuvre avec succès pour surmonter les barrières de sélection chez l’espèce 7 de Vibrio. La méthodologie établie est très applicable à la caractérisation fonctionnelle à haut débit de gènes inconnus et offre une plateforme polyvalente pouvant être adaptée à d’autres Pectobacteriaceae apparentées de la pourriture molle.

Protocole

1. Génération d’un mutant à suppression recA sans marqueur chez P. brasiliense

1. Extraire l’ADN génomique du plasmide SM et pKV2 de P. brasiliense (pLP12 dérivé par modification du marqueur de sélection antibiotique et du site de clonage multiple) de la souche donneuse d’E. coli en utilisant les procédures standard de préparation de l’ADN.
2. Vérifier la qualité et la concentration de l’ADN génomique extrait et de l’ADN plasmidique par électrophorèse en gel d’agarose et spectrophotométrie NanoDrop.
3. Linéarisez le plasmide pKV2 par double digestion avec EcoRI et NheI à 37 °C pendant 5 heures. Vérifier la digestion complète par électrophorèse sur gel d’agarose et purifier le plasmide linéarisé.
4. Identifier environ 800 pb en amont et en aval du gène recA à l’aide d’un logiciel d’analyse génomique et concevoir les paires d’amorces correspondantes LBF/LBR et RBF/RBR (voir le tableau des matériaux pour tous les amorces utilisés dans cette étude).
5. Amplifier les deux bras homologues dans des conditions standard de cycle PCR et purifier les produits PCR. Une PCR de 50 μL donne généralement 2,5 μg de produit.
   REMARQUE : Les valeurs de Tm et la teneur en GC des amorces peuvent être ajustées en modifiant les frontières des régions homologues.
6. Assemblez le plasmide suicidaire recombinant pKV2-recA à l’aide d’un kit d’assemblage d’ADN en liignant les bras homologues purifiés avec la colonne vertébrale plasmidique linéarisée.
7. Transformer le mélange d’assemblage en cellules λpir E. coli S17-1 chimiquement compétentes par choc thermique, récupérer les cellules dans un milieu LB, puis plaquer sur une agar LB contenant de la kanamycine (LB + kan).
   REMARQUE : Les concentrations finales utilisées sont 50 mg/mL de kanamicine, 0,2 % (p/v) de glucose, 0,3 % (p/v) d’arabinose et 0,3 mM d’acide 2,6-diaminopimélique (DAP).
8. Validez les clones positifs par digestion de restriction ou PCR en colonie. (Voir le tableau des matériaux pour toutes les recettes de médiums utilisées dans cette étude).
9. Extraire le plasmide confirmé de pKV2-recA et le transformer en E. coli WM3064 en utilisant la transformation par choc thermique (taux de transformation attendu > 10⁶ cfu/μg).
10. Sélectionnez des transformants sur l’agar LB contenant de la kanamycine et de l’acide diaminopimélique (DAP).
11. Effectuer la conjugaison biparentale en mélangeant des cultures nocturnes de la souche du donneur (WM3064 pKV2-recA) et du receveur P. brasiliense SM dans un ratio 1:1 (v/v), ce qui donne généralement 10⁴ à^{10 6} transconjugants par millilitre de cellules donneuses et recevrices.
12. Lavez la culture mixte une fois avec de l’eau stérile, placez le mélange sur de l’agar LB complétée en kanamycine et DAP, puis incubez à 28 °C pendant 48 à 72 heures.
    REMARQUE : Si aucun transconjugant n’est observé, le ratio donneur/receveur peut être augmenté à 2:1 (v/v) pour améliorer l’efficacité de la conjugaison. Si une forte croissance de fond est observée, le DAP résiduel peut être éliminé en lavant deux fois la culture mélangée à l’eau stérile.
13. Récupérer le mélange de conjugaison et plaquer sur une agar LB contenant de la kanamycine et du glucose (sans DAP) pour une contre-sélection.
14. Choisissez 6 à 8 colonies et répliquez-les sur LB + kan et LB + kan + arabinose.
15. Sélectionnez des colonies qui poussent sur LB + kan mais ne poussent pas sur LB + kan + arabinose ; Ce sont des candidats à la première croisement.
16. Inoculer les premières souches croisées dans un milieu LB et incuber pendant la nuit. Placez les cultures sur un agar LB contenant de la L-arabinose pour induire la seconde recombinaison homologue.
17. Choisissez plusieurs colonies et répliquez-les sur LB + arabinose et LB + kan. Sélectionnez des colonies qui poussent sur LB + arabinose mais pas sur LB + kan ; ce sont des mutants supposés de suppression recA .
    REMARQUE : Si aucune colonie n’est observée après le second événement de croisement, l’essentiellité potentielle du gène cible pour la croissance bactérienne doit être évaluée. Alternativement, les régions homologues en amont et en aval peuvent être étendues à 1 200 pb pour améliorer l’efficacité de la recombinaison homologue.
18. Confirmer les mutants recA par PCR de colonie à l’aide de paires d’amorces checkF/checkR, conçue pour amplifier à travers les régions promoteur recA et terminateur afin de vérifier la délétion dans le cadre du gène cible. Séquencez le produit PCR pour confirmer la suppression précise en trame de recA.
19. La délétion réussie s’explique par une réduction de la taille du produit PCR, qui devrait correspondre à la longueur du fragment de type sauvage moins la longueur spécifique du segment du gène supprimé.

2. Construction de pKV2-LLtnp pour la mutagenèse de Tn5 chez P. brasiliense

1. Amplifiez la cassette transposase Tnp de pMCS2-LLtnp⁸ en utilisant la paire d’amorces Tnp-F/Tnp-R, et amplifiez la dorsale oriγR6K Tn5 à partir de pKV2 en utilisant la paire d’amorces ori-F/ori-R. Purifiez tous les produits PCR à l’aide d’un kit de purification de l’ADN.
2. Assemblez la cassette Tnp purifiée et la dorsale oriγR6K Tn5 à l’aide d’un kit d’assemblage ADN. Transformer le mélange d’assemblage en cellules λpir E. coli S17-1 chimiquement compétentes par choc thermique, récupérer dans un milieu LB, puis plaquer sur l’agar LB complétée de kanamycine (LB + kan).
3. Validez les clones positifs par PCR de colonie en utilisant les paires d’amorces ori-F/ori-R et Tnp-F/Tnp-R.
4. Préparez les cellules compétentes d’E. coli RHO3 en inoculant une seule colonie dans un milieu LB et en incubant pendant la nuit. Diluez la culture à 1:100 dans un milieu LB frais et faites pousser jusqu’à un OD₆₀₀ de 0,6.
5. Refroidissez la culture sur de la glace et lavez les cellules trois fois avec un CaCl₂ pré-refroidi de 0,1 M. Resuspendez le dernier pellet dans 500 μL de glycérol pré-refroidi à 20 % et conservez à −80 °C.
6. Transformer 10 μL du plasmide recombinant validé (pKV2-LLtnp) en 100 μL de cellules compétentes RHO3 par choc thermique (taux de transformation attendu > 10⁶ cfu/μg). Incubez sur la glace pendant 30 minutes, faites un choc thermique à 42 °C pendant 45 secondes, puis refroidissez sur la glace pendant 2 minutes.
7. Ajoutez 500 μL de médium et incubez à 37 °C pendant 1 heure avec agitation. Placez sur de l’agar LB contenant de la kanamycine et du DAP (LB + kan + DAP) et incubez à 37 °C pendant la nuit.
8. Validez les transformants RHO3 positifs par PCR en colonie à l’aide de Tnp-F/Tnp-R.

3. Construction de la bibliothèque de mutants transposons Tn5 dans P. brasiliense

1. Cultivez P. brasiliense ΔrecA dans un milieu LB à 28 °C et cultivez RHO3/pKV2-LLtnp dans un milieu LB complété en kanamycine et DAP (LB + kan + DAP) à 37 °C. Laissez les deux souches atteindre un OD₆₀₀ de 1.
2. Mélangez 100 μL de P. brasiliense ΔrecA avec 100 μL de RHO3/pKV2-LLtnp, centrifugez le mélange, jetez le surnageant, puis remettez la pellete lavée dans 10 μL de milieu LB.
3. Placez le mélange en suspension sur une plaque d’agar LB complétée de DAP et incubez à 28 °C pendant 8 heures pour permettre la conjugaison.
4. Récupérez le mélange de conjugaison en rinçant la surface de la plaque avec 1 mL de médium LB stérile. Centrifugez brièvement, jetez le surnageant, puis lavez la pastille deux fois avec du médium LB pour retirer le DAP.
5. Resuspendez la pellete lavée dans un milieu LB de 300 μL et placez 10 dilutions en série sur de l’agar LB complétée en kanamycine et glucose (LB + kan + glucose ; sans DAP) pour sélectionner les transconjugants.
6. Incubez les plaques à 28 °C pendant 48 heures. Choisissez cinq colonies et validez chacune par PCR de colonie à l’aide de paires d’amorces ori-F/ori-R et Tnp-F/Tnp-R pour confirmer l’introduction réussie du transposon Tn5. Séquencez les cinq colonies pour vérifier l’insertion de Tn5 dans le génome.
   REMARQUE : Avant la construction formelle de la bibliothèque mutante, six colonies individuelles étaient sélectionnées au hasard sur la plaque de conjugaison. Des tests de sauvetage plasmidique ont été réalisés pour déterminer les sites d’insertion, en utilisant deux enzymes de restriction différentes séparément comme deux groupes témoins parallèles. Un total de 36 lectures de séquençage ont été obtenues. Un seul événement d’insertion Tn5 n’était validé que lorsque les six sites d’insertion de chaque colonie individuelle étaient identiques.
7. Estimez la capacité de la bibliothèque mutante en répétant l’étape de conjugaison et en comptant les nombres de colonies. Assurez-vous que la taille totale de la bibliothèque dépasse 12 000 colonies afin d’obtenir une couverture génomique suffisante pour le dépistage en aval.
   REMARQUE : Si une faible fréquence de mutagenèse est observée, l’utilisation d’une variante hyperactive de la transposase Tn5, telle que le mutant E54K/M56A/L372P, doit être envisagée pour améliorer l’efficacité de la transposition.
8. Transférer les colonies mutantes individuelles obtenues à l’étape 6 dans des plaques à 96 puits contenant 200 μL LB + kan par puits. Incubez les plaques toute la nuit à 28 °C en secouant à 200 tr/min.
9. Ajoutez 133 μL de glycérol stérile à 50 % à chaque puits pour atteindre une concentration finale d’environ 20 %. Scellez et stockez les plaques à 96 puits à −80 °C pour une préservation à long terme.

4. Essais de pathogénicité à haut débit via inoculation avec tubercules de pomme de terre et pot

1. Préparez les tubercules de pomme de terre (cv. Favorita) en rinçant à l’eau stérile, en les immergeant brièvement dans 75 % d’éthanol, puis en les séchant à l’air libre sur un établi propre. Coupez les tubercules en sections de ~8 mm d’épaisseur et placez les tranches dans des boîtes de Petri stériles de 90 mm. Préparez au moins trois tranches pour des réplications biologiques.
2. Inocular 1 μL de chaque souche mutante sur des tranches de pomme de terre à l’aide d’une pipette multi-canaux, suivant la disposition des plaques de la bibliothèque mutante à 96 puits. Inclure P. brasiliense ΔrecA comme témoin positif et LB + kan comme témoin négatif.
3. Incubez les tranches de pomme de terre inoculées à 28 °C pendant 7 à 8 heures. Des mutants notés présentant une macération visiblement réduite ou des zones de lésion plus petites par rapport au groupe témoin ΔrecA . Quantifiez la surface de la lésion en mesurant sa longueur et sa largeur. Désignez-les comme candidats principaux de sélection.
   REMARQUE : Assurez-vous que les valeurs OD₆₀₀ des cultures et témoins mutantes sont normalisées à 0,8 avant l’inoculation.
4. Pour le dépistage secondaire, inoculez 5 μL de chaque souche candidate sur des tranches de pomme de terre fraîches (6 souches par tranche, espacement égal). Préparez trois réplications biologiques pour chaque souche. Incuber à 28 °C pendant 7 à 8 heures et noter la taille des lésions pour confirmer l’atténuation.
5. Isoler les souches présentant une réduction constante de la virulence en les striant sur des plaques LB + Kan. Incubez les plaques à 28 °C toute la nuit et conservez les mutants validés à virulence réduite à 4 °C pour une analyse ultérieure.
6. Pour une validation à l’échelle de la plante entière, inoculez les tiges de pomme de terre avec 150 μL de suspensions bactériennes normalisées à 1 x 10⁸ UFC/mL. Injectez les suspensions dans la région de la tige basale à l’aide d’une seringue stérile. Observez l’évolution de la maladie après 48 heures. Effectuez des réplications biologiques sur trois plantes individuelles.
7. Évaluez la gravité de la maladie à l’aide de l’échelle de classification de la maladie du blackleg (« une échelle ordinale à 6 points : 0, 1, 3, 5, 7, 9 ») et calculez l’indice de maladie comme suit :
   1. Grade 0 : Aucun symptôme de maladie sur toute la plante.
   2. Grade 1 : Les lésions de la tige ne couvrent pas plus d’un tiers de la circonférence de la tige et/ou les feuilles individuelles sont fanées.
   3. Grade 3 : Les lésions de la tige ne couvrent pas plus la moitié de la circonférence de la tige, et/ou moins de la moitié des feuilles présentent un léger flétrissement et/ou quelques feuilles inférieures présentent des lésions.
   4. Grade 5 : Les lésions de la tige couvrent plus de la moitié de la circonférence de la tige, et/ou plus de la moitié des feuilles présentent un léger flétriment.
   5. Grade 7 : Les lésions de la tige entourent toute la circonférence de la tige et/ou plus des deux tiers des feuilles sont fanées.
   6. Grade 9 : Toutes les feuilles de la plante sont fanées ou mortes.
      
8. Préparer des stocks de stockage à long terme de mutants atténués confirmés en mélangeant des cultures avec un volume égal de glycérol stérile à 50 % jusqu’à une concentration finale de 25 %, et conserver à -80 °C.

5. Identification des sites d’insertion de Tn5 par sauvetage plasmidique

1. Faites pousser le mutant Tn5 d’intérêt et extrayez l’ADN génomique à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN génomique bactérien. Quantifier la concentration d’ADN pour garantir une quantité suffisante d’apports pour la digestion en aval.
2. Digérez 1 à 2 μg d’ADN génomique avec EcoRI dans une réaction de 100 μL contenant 10 × tampon de réaction et 5 μL d’enzyme, puis incubez le mélange à 37 °C pendant un minimum de 3 heures. Vérifiez la terminaison de la digestion à l’aide d’un gel d’agarose.
3. Précipiter l’ADN digéré en ajoutant 1/10 de volume de 3 M d’acétate de sodium et 3 volumes d’éthanol absolu. Mélangez soigneusement et éclovez à -20 °C pendant 1 heure.
4. Centrifugez à 13 500 x g pendant 5 minutes et lavez les granulés séquentiellement avec 75 % d’éthanol et d’éthanol absolu. Faites sécher le pellet à l’air et resuspendez-le dans 17 μL d’eau stérile.
5. Auto-ligater les fragments d’ADN digérés en ajoutant 2 μL de tampon de ligase T4 à 10× et 1 μL de ligase T4. Inclure un contrôle négatif (sans ligase) pour vérifier la transformation du fond. Incubez la réaction de ligature à 4 °C pendant la nuit pour favoriser la circularisation des fragments de restriction.
6. Transformer 10 μL du mélange de ligature en E. coli S17-1 λpir chimiquement compétent en utilisant la transformation par choc thermique comme décrit précédemment. Récupérer les cellules dans LB pendant 1 h et plaquer sur l’agar LB contenant de la kanamycine (LB + kan) pour sélectionner les plasmides transportant la cassette Tn5.
7. Choisissez cinq colonies résistantes à la kanamycine au hasard et extrayez l’ADN plasmidique à l’aide d’un kit mini-prep plasmidique standard. Validez la structure des plasmides en digérant 500 ng de chaque plasmide avec HindIII et en incubant à 37 °C pendant 5 heures. Analysez les schémas digestifs par électrophorèse sur gel d’agarose.
8. Si la taille des bandes plasmidiques correspond aux motifs de fragments attendus, effectuer le séquençage Sanger en utilisant l’amorce ME de 5' situé à l’intérieur des extrémités Tn5.
9. Identifier le site d’insertion précis du Tn5 en alignant la séquence flanquée de 50-100 pb en aval de la région 5'-ME du Tn5 contre le génome SM de P. brasiliense à l’aide d’un logiciel BLAST ou d’analyse génomique.
10. Confirmez que les cinq réactions de séquençage indépendantes pour chaque mutant correspondent à la même coordonnée génomique (> 98 % d’identité de séquence).
11. Si l’une des cinq réactions de séquençage correspond à une coordonnée génomique différente, cela indique la présence de plusieurs sites d’insertion de Tn5 chez ce mutant. Dans de tels cas, analysez des colonies supplémentaires pour déterminer toutes les positions d’insertion. Sinon, effectuer un séquençage du Southern blotting ou un séquençage du génome entier pour obtenir une cartographie plus définitive des sites d’insertion.
12. Désigner les mutants ayant un site d’insertion unique et cohérent à travers toutes les réactions de séquençage comme de véritables mutants Tn5 à insertion simple, adaptés à des analyses phénotypiques ou génétiques en aval.

Résultats

Pour surmonter l’instabilité causée par la mutation sucB chez P. brasiliense, la toxine vmi480 du plasmide pLP12 a été utilisée comme marqueur de contre-sélection, et le vecteur suicide modifié pKV2 (Figure 1A) a été construit en remplaçant la cassette de résistance aux antibiotiques et en ajustant la configuration du site de clonage. Pour générer un mutant de délétion recA sans marqueur, des bras homologues gauche et droit du gène recA à ~800 pb ont été c...

Discussion

La stratégie de manipulation génétique développée dans cette étude offre une option pour la génomique fonctionnelle chez P. brasiliense, un pathogène principal de la pourriture molle de la pomme^{de terre 9,10}. En intégrant un système de contre-sélection basé sur la toxine dans une colonne vertébrale plasmidique suicidaire, un mutant ΔrecA sans marqueur a été généré. Cette approche offre des avantages significatif...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Kit d'extraction d'ADN génomique bactérien	Extraction d'ADN génomique bactérien	Tiangen	DP302-02
Acide diaminopimélique	0,3 mM dans 1 L de milieu	Macklin	D836611-5g
Kit d'assemblage d'ADN	Assemblage d'ADN	Vazyme	C116-02
Kit de purification d'ADN	Purification d'ADN	Tiangen	DP214-02
Kanamycine	50 mg/mL	Aladdin	K103025-25g
Glucose	0,2% (p/v)	Aladdin	G116305-250mg
Tryptone	10% dans 1 L de milieu	OXOID	LP0042B
Extrait de levure	5% dans 1 L de milieu	OXOID	LP0021B
NaCl	10% dans 1 L de milieu	Biofroxx	1249KG001
Agar	15% dans 1 L de milieu	Biofroxx	8211GR500
L-arabinose	0,3% (p/v)	Aladdin	A106196-25g
Kit Miniprep de plasmide	Extraction de plasmide	Tiangen	DP103-02
EcoRI	Endonucléase de restriction	Yugong Biotech	EG15536
NheI	Endonucléase de restriction	Yugong Biotech	EG15552
HindIII	Endonucléase de restriction	Yugong Biotech	EG15539
Ligase d'ADN T4	Auto-circularisation linéaire de l'ADN	Yugong Biotech	EG15205
Centrifugeuse	RWD	M1324R
Cycleur thermique PCR	BIO-GENER	GET3XG
Appareil photo numérique	SONY	ILCE-7M4
Système d'électrophorèse	LY	DYY-6C
Bain-marie	JOANLAB	WB100-1F
Système de documentation de gel	Thermo Fisher Scientific	iBright CL750
Autoclave	Yamato	SQ510C
Incubateur à agitateur	ZHICHU	ZQZY-AR8
Incubateur à température constante	ZQ	DHP-9272
NanoDrop	Thermo Fisher Scientific	Lite Plus
Spectrophotomètre UV-Vis	HITACHI	U-3900
Électroporateur	BIO-RAD	MicroPulser
Souches et plasmides
P. brasiliense SM	Bactéries pathogènes de la pomme de terre	Collection de souches de laboratoire
E. coli S17-1 λpir	Cellules d'E. coli compétentes	WEIDI	DL2010S
E. coli WM3064	Cellules d'E. coli compétentes	BIO SCI BIO	C1039
E. coli RHO3	Cellules d'E. coli compétentes	Collection de souches de laboratoire
pKV2	Le plasmide suicide modifié	Construit dans cette étude
pLP12	plasmide suicide	Collection de souches de laboratoire
pMCS2-LLtnp	Fournir le fragment portant Tn5	Collection de souches de laboratoire
pKV2-LLtnp	Le plasmide modifié portant le fragment Tn5.	Construit dans cette étude
Pimers
LBF (ctgaaagcttctgcaggagctcgctgacccaacaatccttgattaagatgaggc)		Personnalisé
LBR (gttcagccaccattctgctcctgtcatgcggcgt)		Personnalisé
RBF (caggagcagaatggtggctgaacgggttgtgac)		Personnalisé
RBR (gatcctgcagcggagcggccgcgcagatcgcgggcaaggttagtc)		Personnalisé
checkF (ctatgcgcttcgcataccgtgc)		Personnalisé
checkR (gctcttgctcataattgtcctgg)		Personnalisé
TnpF (ggaatctagaccttgagtcgatatcactctcgtttaatgctg)		Personnalisé
TnpR (acaaacaaaaccaaattctgtacggcgaag)		Personnalisé
ori-F (taatcgccttgcagcacatc)		Personnalisé
ori-R (ggtatgagtcagcaacacct)		Personnalisé
5’ME (attcattaatgcagctggcacg)		Personnalisé