Un système in vitro pour appliquer une force de traction aux cellules souches squelettiques en utilisant un système de tension de stress cellulaire cyclique

Résumé

Les cellules souches squelettiques périostéales (SSC) de la souris ont été isolées par FACS et cultivées in vitro. Un système expérimental contrôlable a été mis en place pour appliquer une stimulation mécanique de traction cyclique aux SSC, entraînant une diminution de l’expression des gènes cellulaires associés à la sénescence, en particulier p16 et p21.

Résumé

L’os est un organe mécanosensible majeur qui répond en continu aux signaux physiques du corps. Bien que la stimulation mécanique joue un rôle important dans le développement squelettique, l’homéostasie et la réparation des blessures, les réponses spécifiques des cellules souches squelettiques (SSC) au stress mécanique restent inentièrement comprises. Pour répondre à cette question, nous avons mis en place un modèle in vitro pour isoler les SSC périostéaux de la souris et appliquer une stimulation mécanique. Les cellules périostéales de la souris ont d’abord été obtenues par digestion enzymatique, puis les SSC ont ensuite été isolées par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) basé sur des marqueurs de surface établis. Après l’attachement à la culture, les SSC étaient soumis à une stimulation mécanique de traction à l’aide d’un système cyclique de tension et de contrainte cellulaire. Ce système permet l’application reproductible de la force de traction aux cellules cultivées et offre une plateforme pour analyser les réponses des SSC à l’entrée mécanique. Grâce à cette approche, nous avons constaté que l’expression des gènes cellulaires associés à la sénescence p16 et p21 était nettement réduite dans les SSC après stimulation mécanique. Ces résultats suggèrent que la stimulation de traction peut influencer les modifications liées à la sénescence dans les SSC en conditions in vitro . Dans l’ensemble, ce protocole offre une plateforme utile et adaptée pour étudier le comportement des SSC sous stimulation mécanique et pour étudier comment les indices mécaniques affectent la fonction des SSC.

Introduction

En tant que plus grand et plus important organe de soutien du corps humain, le système squelettique fournit non seulement des sites d’attache et une protection pour d’autres organes, mais sert également de fondement à la fonction motrice. Ainsi, le système squelettique est constamment exposé à divers stimuli mécaniques provenant des environnements internes et externes. Les signaux de stimulation mécanique sont tout aussi cruciaux pour le développement osseux et le maintien fonctionnel. Dès 1893, il a été proposé qu’il existe une certaine corrélation positive entre la densité osseuse et la force mécanique que les os supportent, ce qui est la loi¹ de Wolff. Ces dernières années, certaines études ont démontré l’importance que le système squelettique supporte des forces mécaniques pour le développement normal des^os 2,3,4,5. La réponse du système squelettique à la force mécanique dépend en partie des composants cellulaires de^{l’os 6}. Les ostéocytes représentent 85 % à 90 % des composants cellulaires du système squelettique. En raison de leur large distribution et de leur morphologie cellulaire dendritique unique, les ostéocytes sont actuellement le type de cellule squelettique le plus étudié en termes de réponse mécanique ^7,8. Outre la capacité largement reconnue des ostéocytes à répondre à la force mécanique, les cellules précurseurs squelettiques jouent également un rôle indispensable. Il a été constaté que la réponse des cellules précurseurs périostéales aux signaux mécaniques régulait leur transformation du destin, influençant ainsi la réparation des lésions^{tissulaires 9}.

Les cellules souches squelettiques (SSC) sont un type de cellules souches spécifiques aux tissus dotées d’une capacité d’auto-renouvellement, qui peuvent se différencier en types de cellules osseuses matures nécessaires à la croissance, à l’entretien et à la réparation osseuse. En 2015, 10 gènes marqueurs de surface pour les SSC de souris ont été^identifiés. Par la suite, de nombreuses études ont également démontré que les SSC jouent un rôle très important dans divers aspects tels que le développement osseux, le maintien de l’homéostasie et la réparation des blessures^{osseuses 11,12}. En raison de la caractéristique du système squelettique qui répond aux forces mécaniques, on peut considérer les signaux de force mécaniques comme un facteur indispensable pour réguler la fonction des cellules souches squelettiques. Pour étudier les changements comportementaux des SSC sous stimulation mécanique, nous devons établir un système expérimental adapté pour appliquer la force mécanique in vitro.

Les principales méthodes de stimulation mécanique in vitro pour les cellules incluent la contrainte de cisaillement du fluide, la contrainte de compression, la force de traction, la pression hydrostatique, la rigidité matricielle et la topologie^{matricielle 6,13}. Sur la base des gènes marqueurs de surface des SSC de souris, nous avons obtenu les SSC périostéaux de la souris par tri par cytométrie en flux, puisque les SSC impliqués dans la réparation des fractures proviennent principalement du périoste¹⁴. Par la suite, une force de traction appropriée a été appliquée aux SSC périostéaux via un système de contrainte de la cellule cyclique. Après stimulation de la force de traction, des échantillons cellulaires peuvent être obtenus et des analyses multi-omiques peuvent être réalisées, incluant le séquençage du transcriptome, le séquençage du protéome et l’ATAC-seq. Par conséquent, l’établissement de ce protocole fournit une base solide pour étudier les réponses des SSC à la stimulation mécanique.

Protocole

Les expériences sur la souris dans ce protocole ont toutes été approuvées par le Comité de soins et d’utilisation des animaux de l’Institut de biochimie et de biologie cellulaire de Shanghai, Académie chinoise des sciences (SIBCB-S350-2312-41).

1. Isolement des cellules périostéales chez la souris

1. Placez des souris de 4 à 6 semaines dans une boîte d’euthanasie CO₂ et exposez-les au CO₂ en continu pendant 3 minutes jusqu’à ce que la respiration cesse.
2. Désinfectez la surface du corps des souris avec 75 % d’alcool. Utilisez des ciseaux ophtalmiques pour séparer les membres postérieurs. Ensuite, utilisez des pinces pointues et des ciseaux ophtalmiques pour retirer les muscles squelettiques des membres postérieurs, en veillant à ce que les régions articulaires du fémur et du tibia restent intactes.
3. Conservez les os isolés dans du PBS refroidi, puis enrobez les deux extrémités des os d’agarose à faible fusion (5-10 % dans le tampon TAE).
4. Digérez les fémurs et les tibias dans un milieu minimal essentiel alpha (α-MEM) contenant 1 mg/mL de collagénase, 2 mg/mL de dispase II, et 0,1 mg/mL de DNase I à 37°C et 0,3 × g pendant 30 minutes à deux reprises. Collectez les cellules digérées dans le milieu de culture (α-MEM + 10 % de sérum bovin fœtal (FBS)).
5. Filtrez la suspension de cellules à travers un filtre de 40 μm puis centrifugez à 500 × g pendant 5 minutes pour retirer le surnageant.
6. Résuspendez le précipité cellulaire avec un tampon de lyse des globules rouges pendant 2 minutes et terminez la réaction avec un tampon de cytométrie en flux (PBS + FBS à 2 %).
7. Centrifugez les cellules à 500 × g pendant 5 minutes et jetez le surnageant. Resuspendez les cellules avec un tampon de cytométrie en flux à 1 × 10⁷ cellules/mL pour le tri cellulaire.

2. Tri cellulaire activé par fluorescence

1. Teindre la suspension cellulaire avec les anticorps suivants comme suit : Anti-souris conjugué PerCP/Cy5.5 CD45, Anti-souris conjugué PerCP/Cy5.5 CD31, Anti-souris conjugué PerCP/Cy5.5 Ter119, anti-souris conjugué FITC 6C3/Ly-51, Anti-souris conjugué Brilliant Violet 605 CD90.2, Anti-souris conjugué PE/Cy7 CD105, Anti-souris conjugué APC CD200.
2. Diluez les anticorps ci-dessus à un ratio de 1:500 et faites-les couver sur la glace pendant 30 minutes, à l’abri de la lumière.
3. Lavez les cellules avec un tampon de cytométrie en flux, puis effectuez le tri cellulaire avec un trieur cellulaire activé par fluorescence pour obtenir les SSC CD45 ^- CD31 ^- Ter119 ^- CD90.2 ^- 6C3^- CD105 ^- CD200⁺ . Collectez les SSC triés avec le milieu de culture. Analysez les données acquises avec le logiciel FlowJo v10.8.1.
4. Élargissez les SSC triés dans des cuves de culture avec un milieu d’expansion dans un incubateur à 5 % de cellules_CO2 . Un passage pouvait être effectué avant la stimulation mécanique.
   REMARQUE : Environ 1 ×^{10 5} SSC périostéaux peuvent être obtenus sur chaque paire de souris âgées de 6 semaines.

3. Stimulation mécanique des CSS

1. Diluez le collagène de type I de la queue de rat dans de l’acide acétique stérilisé 0,02 M jusqu’à une concentration finale de 0,15 mg/mL. Cette solution peut être réutilisée 3 fois et doit être conservée à 4 °C.
2. Ajoutez 1,5 mL de collagène dilué de type I de queue de rat à chaque poignée de la plaque de culture à fond flexible à 6 puits. Après avoir enrobé les plaques pendant 1 h à température ambiante, aspirez l’excès de collagène et lavez les plaques une fois avec du PBS pour une utilisation ultérieure.
3. REMARQUE : Pour une utilisation immédiate, il faut rincer l’assiette avec du PBS pour éliminer tout acide résiduel. Avant le stockage à 4 °C, la plaque doit être complètement sèche sans le couvercle.
4. Digérez les SSC périostéaux de la souris en culture, centrifugez à 500 × g pendant 5 minutes, remettez le précipité cellulaire dans le milieu de culture pour atteindre une densité cellulaire de 1 × 10⁵ cellules/mL, ajoutez 2 mL de suspension cellulaire à chaque puits de la plaque de culture à fond flexible à 6 puits, puis placez le tout dans l’incubateur cellulaire.
5. 24 h après l’ensemencement des cellules, placez la plaque de culture à fond flexible dans la plaque de base étirée, et conservez une autre plaque de culture à fond flexible comme groupe témoin sans stimulation mécanique.
6. Réglez les paramètres dans le logiciel FX-6000 Version 1.0 comme suit : force d’étirement 8 %, fréquence 0,1 Hz, forme d’onde en onde carrée, cycle de fonctionnement de la forme d’onde 80 %, et durée d’étirement de 12 h.
   REMARQUE : Il y a quatre positions sur la plaque de base allongée pour placer une plaque de culture à fond flexible à 6 puits. Si les cellules nécessaires à l’expérience sont inférieures à 4, les positions vides doivent être remplies par de nouvelles plaques de culture à fond flexible à 6 puits. Après application d’une stimulation mécanique appropriée, les SSC peuvent subir des tests fonctionnels, tels que la différenciation ou la prolifération cellulaire, ou des échantillons peuvent être extraits pour un séquençage multi-omique.

4. PCR quantitative en temps réel (RT-qPCR)

1. Après la stimulation mécanique des cellules, il faut écarter le milieu de culture, laver les cellules une fois avec du PBS, extraire l’ARN total avec le réactif TRIzol, et effectuer la transcription inverse de l’ARN.
   REMARQUE : Après l’extraction de l’ARN, il peut être stocké à -80 °C. L’ADNc obtenu par transcription inverse peut également être stocké à -20 °C pour des tests ultérieurs.
2. Effectuez la RT-qPCR avec un système de PCR en temps réel. Les ensembles d’amorces utilisés étaient les suivants :
   Hélice : avant 5'-GTTAAGCAGTACAGCCCCAAA-3',
   Hprt : revers 5'-AGGGCATATCCAACAAACTT-3',
   p16 : avant 5'-GGTCACACGACTGGGCGATT-3',
   p16 : revers 5'-GCACCGTTTGAGCAGAAG-3',
   p21 : avant 5'-GCCTGGTTCCTTCCCTTCTT-3',
   p21 : Revers 5'-ATTACGGTTGAGTCCTAACTGCCATC-3'.

5. Les effets du traitement à court terme des contraintes mécaniques

1. Réglez les paramètres dans le logiciel FX-6000 Version 1.0 comme suit : résistance à l’étirement 8 %, fréquence 0,1 Hz, forme d’onde en onde carrée, cycle de travail de la forme d’onde 80 %. Les cellules sont lysées avec le tampon de lyse RIPA I (avec cocktail inhibiteur de phosphatase et cocktail inhibiteur de protéase) à 10 minutes et 60 minutes après stimulation mécanique à tension.
2. Effectuez le Western blot avec Erk et anticorps p-Erk.

Résultats

Après la mise en œuvre de ce protocole, la force de traction a été appliquée avec succès aux SSC périostéaux des souris. Premièrement, les SSC ont été obtenus à partir du périoste de la souris par cytométrie en flux. Les résultats de la cytométrie en flux ont montré que la proportion de CSS au périoste représentait près de 30 % du Lin^- (CD45^-, ^CD31-, Ter119^-) CD90,2^{- 6C3-} (Figure 1), ce qui était bien plus élevé que...

Discussion

Ces dernières années, des gènes marqueurs des cellules souches squelettiques provenant de différentes parties des os ont été découverts^{en continu} 11,12,17. Cependant, la recherche sur la régulation directe du fonctionnement des SSC doit encore être approfondie, notamment dans l’aspect de la régulation de la stimulation mécanique des forces. Jusqu’à présent, la recherche sur les effets régulateur...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
α-MEM	Corning	10-022-CV	Isolation de cellules périostéales
APC anti-mouse CD200	BioLegend	123809	Tri des SSC
BioFlex 6-Well Culture Plate	Flexcell	BF-3001A	Culture cellulaire
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD90.2	BioLegend	140317	Tri des SSC
Collagenase	Sigma	C0130	Isolation de cellules périostéales
Dispase II	Sigma	D4693	Isolation de cellules périostéales
DNase I	Sigma	DN25	Isolation de cellules périostéales
Sérum bovin foetal	Gibco	A5356701	Tri des SSC
FITC anti-mouse 6C3/Ly-51	BioLegend	108305	Tri des SSC
Flexcell Tension System	Flexcell	Flexercell FX-6000	Tension cellulaire
Flow Cytometry Sorter	BD	BD FACSAria Fusion	Tri des SSC
MesenCult Expansion Kit (Mouse)	Stem cell	05513	Culture cellulaire
PE/Cy7 anti-mouse CD105	BioLegend	120409	Tri des SSC
PerCP/Cy5.5 anti-CD31	BioLegend	102522	Tri des SSC
PerCP/Cy5.5 anti-CD45	BioLegend	103132	Tri des SSC
PerCP/Cy5.5 anti-mouse TER-119	BioLegend	116228	Tri des SSC
PrimeScript RT Reagent Kit	TaKaRa	RR037A	RT-qPCR
Collagène de queue de rat de type I	Corning	354236	Culture cellulaire
système de PCR en temps réel	Thermo Fisher Scientific	QuantStudio 1 Plus	RT-qPCR
red blood cell lysis buffer	Beyotime	C3702	Isolation de cellules périostéales
TRIzol	Sigma	T9424	RT-qPCR
Phosphatase Inhibitor Cocktail II	MCE	HY-K0022	WesternBlot
RIPA Lysis Buffer I	Sangon Biotech	NO. C500005	WesternBlot
Protease Inhibitor Cocktail	MCE	HY-K0010	WesternBlot
p44/42 MAPK (Erk1/2) Antibody	Cell Signaling Technology	9102	WesternBlot
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) Rabbit Monoclonal Antibody	Cell Signaling Technology	4370	WesternBlot