Article de méthode

Fabrication et application chirurgicale d’hydrogels enrichis photo-reticulés gélatine-riboflavine pour la réparation des plaies cornéennes chez les lapins

218 vues

⸱

DOI :

10.3791/70579

⸱

24 avril 2026

 ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Histology, School of Medicine and Nursing, University of the Basque Country UPV/EHU, 2BEGIKER Ophthalmology Research Group, IIS Biobizkaia, 3Department of Ophthalmology, University Hospital of Cruces

Dans cet article

Résumé

Un protocole reproductible est présenté pour la préparation, l’enrichissement et l’application d’un hydrogel in situ à lumière bleue-réticule gélatine-riboflavine pour la réparation de la plaie stromale cornéenne chez les lapins, incluant des étapes procédurales pour la manipulation chirurgicale, la tarsorrhafie partielle et les soins postopératoires.

Résumé

Cet article présente un protocole étape par étape pour fabriquer, compléter et appliquer chirurgicalement un hydrogel gélatine réticulable à lumière bleue et réticulant in situ pour la réparation de plaies stromales cornéennes chez les lapins. Le précurseur hydrogel comprend de la gélatine à 5 % (p/v) et du phosphate de riboflavine à 0,01 % (p/v), préparée dans des conditions stériles et protégées par la lumière, filtrée stérile et réchauffée avant utilisation pour obtenir une viscosité injectable. L’incorporation optionnelle d’extrait de membrane amniotique humaine ou de sérum autologue de lapin est détaillée. La gélification à la demande est déclenchée à la surface oculaire à l’aide de lumière bleue à λ = 420–480 nm pour un total de 2 minutes. La méthode in vivo comprend une kératotomie stromale antérieure reproductible (diamètre de tréphine 6,5 mm ; profondeur d’environ 187 μm), suivie d’un plombage à l’hydrogel, d’une activation légère et d’une tarsorrhaphie latérale partielle pour stabiliser le traitement, favoriser la cicatrisation des plaies et standardiser les soins postopératoires . Les résultats in vitro représentatifs montrent un comportement viscoélastique gélifique avec un amincissement par cisaillement et une récupération rapide, ainsi qu’une transmettance optique élevée (> 90 %) au-delà de 500 nm, indiquant une adéquation à un usage cornéen. In vivo, les traitements à base d’hydrogel favorisent une fermeture épithéliale progressive, une bonne tolérance oculaire (faibles scores de Draize à 3 et 7 jours) et une perte temporelle de l’hydrogel visible, compatible avec la biodégradation et le remplacement tissulaire. Les étapes critiques et les points de pause sont mis en évidence pour garantir la reproductibilité, notamment le contrôle de la température lors de la dissolution et de la filtration, la protection contre la lumière et le positionnement de la lampe lors de la réticulation. Le protocole permet une stabilisation hydrogel activée par la lumière sans suture, placée précisément, compatible avec l’ajout de plusieurs suppléments bioactifs. Il offre une plateforme pratique pour l’évaluation préclinique des biomatériaux ophtalmiques de nouvelle génération et facilite la traduction des thérapies hydrogel photo-réticulables pour la réparation des plaies cornéennes.

Introduction

La cornée est une structure transparente et avasculaire qui représente environ les deux tiers du pouvoir réfractif de l’œil, rendant son intégrité structurelle et fonctionnelle essentielle à la vision1. En raison de son exposition directe à l’environnement externe, la cornée est très sensible aux traumatismes, infections, blessures chimiques et complicationspost-chirurgicales 2,3. L’échec à restaurer rapidement et efficacement l’intégrité épithéliale peut entraîner des défauts épithéliaux persistants (PED) et des ulcères cornéens chroniques, entraînant finalement la fonte stromale, la perforation, les cicatrices et une perte visuelle irréversible 4,5. Les thérapies conventionnelles — y compris les lubrifiants, la prophylaxie antibiotique et les gouttes ophtalmiques sérums autologues — n’apportent souvent qu’un bénéfice partiel et ne favorisent pas adéquatement la réparation stromale dans les défauts modérés à sévères 6,7,8.

Pour remédier à ces limites, les thérapies à base de biomatériaux se sont révélées comme des alternatives prometteuses grâce à leur capacité à protéger la plaie, à soutenir la réparation épithéliale et à restaurer le tissu stromal 9,10,11,12,13,14. Les hydrogels sont particulièrement attrayants en raison de leur biocompatibilité, de leur transparence optique, de leur comportement mécanique ajustable et de leur capacité à incorporer des agents thérapeutiques. Les hydrogels naturels et synthétiques, dont lagélatine 15,16,17, le collagène18,19, le chitosan20,21, le polyéthylène glycol (PEG)22,23 et l’acide hyaluronique18,24 ont démontré un potentiel pour favoriser la cicatrisation des plaies cornéennes. Parmi ceux-ci, les hydrogels à base de gélatine sont particulièrement précieux en raison de leur composition dérivée du collagène et de leurs motifs d’adhésion cellulaire intrinsèques.

Les hydrogels réticulables par photo-réticulation offrent un avantage supplémentaire en permettant une solidification à la demande directement sur la surface oculaire, permettant un placement précis et une meilleure stabilité mécanique sans sutures. La réticulation médiée par la riboflavine, initialement développée pour le traitement du kératocône, a récemment été adaptée à la photopolymérisation par hydrogel en raison de son excellente biocompatibilité, de sa sécurité ophtalmique et de sa capacité à générer des espèces réactives de l’oxygène induisant la réticulation sous lumière visible ouUV 25,26. La lumière bleue (≈445 nm) est particulièrement avantageuse pour les applications cornéennes, permettant un réticulation efficace tout en évitant les risques associés aux UV 27,28,29.

Cet article présente la fabrication, l’enrichissement et l’application chirurgicale d’un hydrogel photo-réticulable composé de gélatine à 5 % (p/v) et de phosphate de riboflavine (RFP) à 0,01 % (p/v). Un protocole détaillé est prévu pour la préparation in vitro d’hydrogel, incluant l’incorporation optionnelle d’extrait de membrane amniotique humaine (HAMe) ou de sérum autologue (AS), ainsi qu’une application in vivo dans un modèle de kératectomie stromal de lapin. Le HAMe est connu pour exercer des effets anti-inflammatoires, anti-fibrotiques et pro-régénérateurs sur la surface oculaire 30,31,32,33,34,35, tandis que le sérum autologue fournit des concentrations lacrymoles de vitamine A, EGF, fibronectine et d’autres facteurs de croissance essentiels à la régénération épithéliale 36,37,38. Ensemble, ces éléments favorisent la réépithélialisation, réduisent l’inflammation et préviennent potentiellement la dégradationstromale 39,40.

Bien que l’approche décrite offre une photopolymérisation contrôlée et une bioactivité personnalisable, son applicabilité est actuellement limitée aux défauts superficiels et moyens stromales et nécessite une exposition en ligne de vue à la lumière bleue, ce qui peut restreindre l’utilisation dans des tissus opaques ou profondément infiltrés. En intégrant la préparation et l’enrichissement de l’hydrogel, la manipulation ophtalmique et les soins postopératoires, y compris la tarsorrhaphie latérale partielle, cet article propose une approche reproductible qui soutient la réparation cornéenne, facilite la traduction des technologies hydrogel activées par la lumière vers la pratique clinique et contribue au développement de plateformes standardisées pour la recherche régénérative cornéenne.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

Les placentas humains ont été prélevés auprès de donneurs avec consentement éclairé, conformément à la Déclaration d’Helsinki et avec l’approbation du Comité d’éthique de l’Hôpital universitaire de Cruces (numéro d’approbation CEIC E15/03). Toutes les expériences animales ont été approuvées par le Comité d’éthique de la recherche animale de l’Université du Pays basque (UPV/EHU) (numéro d’approbation CEEA M20/2023/038) et conformes à la Déclaration ARVO pour l’utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle. Toutes les procédures ont été réalisées à l’installation vétérinaire UPV/EHU (SGIker), en maintenant une technique stérile tout au long (armoire de biosécurité de classe II lors de la manipulation de produits biologiques).

1. Synthèse d’hydrogel

  1. Solutions précurseurs de gélatine-riboflavine (5 % et 10 % en mousse/v)
    REMARQUE : Travailler sous une faible lumière ou utiliser des bouteilles ambrées ou des bouteilles enveloppées dans du papier aluminium pour protéger la solution de l’exposition à la lumière. Effectuer toutes les étapes dans des conditions stériles dans une hotte à flux laminaire lorsque l’hydrogel est destiné à un usage biologique.
    1. Pesez les quantités requises de gélatine et de phosphate de riboflavine (RFP) : pour 10 mL de précurseur RFP à 5 % (p/v) + 0,01 % (p/v), pesez 500 mg de gélatine et 1 mg de RFP. Pour 30 mL de stock RFP à 10 % (p/v) + 0,02 % (p/v) de stock, pesez 3 g de gélatine et 6 mg de RFP.
    2. Ajoutez la gélatine et la RFP au volume correspondant d’eau déionisée (≈90 % du volume final). Remuez doucement jusqu’à ce que la poudre soit complètement dispersée.
    3. Ajustez le pH à 7,0 à l’aide de 1 M de NaOH, en ajoutant la base goutte à goutte tout en surveillant le pH. Notez le volume de NaOH utilisé et le volume final ajusté. Après l’ajustement du pH, amenez les solutions à leur volume final avec de l’eau déionisée.
    4. Dissoudre et homogénéiser la solution à 80 °C sous un bras magnétique à 200 tr/min pendant 30 minutes.
      REMARQUE : Manipulez les solutions chaudes (>70–80 °C) à l’aide de gants résistants à la chaleur.
    5. Laissez les solutions refroidir à 30–40 °C et filtrez-les à travers des filtres à membrane hydrophile de polyéthérsulfone (PES) de 0,22 μm dans des flacons ambrés stériles.
      REMARQUE : Chauffer doucement les solutions visqueuses (≈ 40–50 °C) avant la filtration si nécessaire ; éviter la surchauffe.
    6. Étiquetez les bouteilles avec la composition, la date et les initiales de l’opérateur. Conservez les solutions d’hydrogel filtrées à 4 °C jusqu’à utilisation, en veillant à ce que la période de stockage ne dépasse pas 2 semaines à partir de la préparation.
  2. Hydrogels de gélatine complétés (volume final : 10 mL)
    1. Préparez un sérum autologue (SA) ou un extrait de membrane amniotique humaine (HAMe) en suivant les procédures décrites aux sections 4 et 5. Conservez les extraits stériles et au frais jusqu’à utilisation.
    2. Pour chaque 10 mL d’hydrogel enrichi, mélangez 5 mL du stock RFP à 10 % (p/v) + 0,02 % (p/v), et 5 mL de l’extrait biologique correspondant (AS ou HAMe).
      REMARQUE : Chauffer doucement les solutions visqueuses (≈ 40–50 °C) avant la filtration si nécessaire ; éviter la surchauffe.
    3. Filtrez la solution tiède à travers un filtre membranaire hydrophile PES de 0,22 μm dans des flacons ambrés stériles.
    4. Étiquetez et conservez les hydrogels à 4 °C jusqu’à utilisation. Assurez-vous que la période de stockage ne dépasse pas 2 semaines à compter de la préparation.
      REMARQUE : Éliminer tous les déchets conformément aux réglementations institutionnelles sur la biosécurité.

2. Application in vitro d’hydrogel

  1. Préparez les formulations d’hydrogel comme décrit à la Section 1 et maintenez-les à 32 °C avant l’application afin de maintenir une viscosité adéquate.
  2. En utilisant une technique stérile, pipeter le volume requis d’hydrogel dans le puits cible, la moisissure, le plat ou le substrat (Figure 1A).
  3. Positionner la lampe de durcissement Led-C à 2 cm au-dessus de la surface de l’hydrogel. Initier la réticulation in situ en exposant l’hydrogel à la lumière bleue (λ = 420–480 nm) et à une sortie lumineuse de 850-1000 mW/cm2 pour une durée totale de 2 min. Fournir l’éclairage sous forme de six impulsions de 20 s, en insérant des pauses de 5 à 10 s entre les impulsions pour éviter le chauffage local (Figure 1B).
  4. Confirmez la gélification complète visuellement et en touchant doucement la surface avec un instrument stérile pour garantir la formation d’un hydrogel solide et manipulable (Figure 1C,D).
  5. Utilisez immédiatement l’hydrogel réticulé ou stockez-le à 4 °C dans des conditions stériles adaptées à l’application en aval.
    REMARQUE : Maintenez une technique aseptique tout au long de la procédure. Évitez l’exposition directe de la peau ou des yeux à l’irradiation à la lumière bleue.

3. Acquisition de la membrane amniotique humaine (HAM)

REMARQUE : N’utilisez que les placentas de donneurs séronégatifs ayant donné un consentement éclairé et répondant aux exigences institutionnelles et éthiques.

  1. Éligibilité et consentement du donneur
    1. Confirmez que chaque donneur a été dépisté et testé négatif aux types 1 et 2 du VIH, à l’hépatite B et C, ainsi qu’à la syphilis.
    2. Obtenez le consentement éclairé écrit de chaque donneur avant l’opération.
    3. Obtenir des placentas humains immédiatement après des césariennes électives de donneurs sains.
  2. Collecte et traitement initial
    1. Recueillez chaque placenta dans un contenant stérile en acier inoxydable immédiatement après l’accouchement.
    2. En salle d’opération, rincez le placenta abondamment avec une solution saline stérile pour éliminer les caillots sanguins. Identifiez l’amnion — la membrane la plus interne transparente qui tapisse la cavité amniotique — et séparez-le soigneusement du chorion en dépeillant doucement vers le bord placentaire à l’aide de pinces stériles.
      REMARQUE : Manipulez les membranes avec précaution pour éviter les déchirures.
    3. Après séparation complète, fixez des pièces stériles de filtre à nitrocellulose à la surface stromale du HAM pour faciliter la manipulation et standardiser sa division. Divisez le HAM en trois régions définies (Figure 2A,B) : amnion distal : section de 10 cm de large, amnion médian : section de 10 cm de large, amnion proximal : section s’étendant jusqu’au bord placentaire.
  3. Transport
    1. Placez chaque fragment de HAM dans une bouteille stérile, en l’immergeant dans le Médium Eagle Modifié (DMEM) de Dulbecco, complété avec 1,25 μg/mL d’amphotéricine B, 50 μg/mL de pénicilline-streptomycine et 50 μg/mL de néomycine.
    2. Étiquetez clairement chaque bouteille avec le code du donneur, la date et la région d’origine (distale, médiane ou proximale).
    3. Transportez immédiatement les échantillons au laboratoire dans des conditions propres et aseptiques réfrigérées (4 °C).
      REMARQUE : Transportez les membranes dans un emballage triple scellé, conforme à l’ONU 3373 (Substance biologique, catégorie B), conformément aux réglementations institutionnelles sur la biosécurité régissant les tissus humains.
  4. Traitement en laboratoire
    REMARQUE : Effectuer toutes les étapes suivantes dans une armoire de sécurité biologique de classe II dans des conditions stériles.
    1. Coupez chaque fragment distal, médial et proximal de HAM en carrés de 4,0 à 4,5 × 4,0 à 4,5 cm à l’aide de ciseaux stériles.
    2. Immergez les fragments dans du DMEM déjà mentionné avec des antibiotiques et brossez doucement avec des pinces stériles pour éliminer les résidus sanguins. Lavez dans du DMEM contenant 50 μg/mL de pénicilline-streptomycine pendant 2 x 5 minutes.
    3. Laver dans du DMEM sans antibiotiques pendant 2 x 5 minutes.
    4. Lavez ces fragments sélectionnés dans une solution stérile de phosphate tamponné (PBS).
    5. Transférez chaque fragment dans un tube stérile de 5 mL sans milieu de culture. Congelez les échantillons directement à –80 °C jusqu’à une utilisation ultérieure.

4. Préparation de l’extrait de membrane amniotique humaine (HAMe)

REMARQUE : Effectuez toutes les étapes dans des conditions aseptiques et froides afin de minimiser la dégradation et la contamination des protéines.

  1. Récupérez les tubes contenant des fragments de membrane amniotique humaine (HAM) stockés à −80 °C. Immergez les tubes dans de l’azote liquide pendant 5 minutes pour durcir le tissu.
  2. Transférez chaque fragment congelé dans un mortier pré-refroidi (−80 °C) et écrasez-le minutieusement à l’aide d’un pilon jusqu’à obtenir une poudre molle et homogène.
  3. Pèser immédiatement l’échantillon en poudre sur une platine pour minimiser le dégel. Transférer la poudre pesée dans un tube de 5 mL et la resuspendre dans 3 mL de PBS complété par un cocktail inhibiteur de protéase à 5 μL/mg.
    REMARQUE : Gardez tous les tubes sur la glace pendant le traitement pour préserver l’intégrité des protéines.
  4. Soniser chaque échantillon pendant 20 minutes à 90 % d’amplitude à l’aide du sonicateur et de la sonde de 1,5 mm de diamètre, en appliquant des cycles de 15 s allumé / 15 s éteints pour éviter la surchauffe.
  5. Centrifugez les lysats à 3 000 × g pendant 10 minutes à 4 °C. Collectez soigneusement le surnageant sans déranger la pellete.
  6. Filtrez le surnageant à travers un filtre membranaire hydrophile PES de 0,22 μm en utilisant des conditions stériles. Aliquote le HAMe filtré dans des microtubes de 0,2 mL. Stockez les aliquotes à −80 °C jusqu’à une utilisation ultérieure.
    REMARQUE : Veillez à ce que la période de stockage ne dépasse pas 6 mois à compter de la préparation.

5. Extraction du sérum autologue issu du sang sur des lapins

REMARQUE : Effectuer toutes les procédures pour les tests in vivo chez les lapins blancs de Nouvelle-Zélande (≈2 kg) sous l’approbation du Comité d’éthique de la recherche animale de l’institution correspondante et conformément aux directives institutionnelles.

  1. Anesthésiez localement le lapin avec de la lidocaïne (topique ou sous-cutanée) au site de la ponction venaise.
  2. Prélever le sang de l’artère centrale de l’oreille dans des tubes de collecte sanguine de 4,5 mL contenant un séparateur de gel polymère (Figure 3A,B). Laisser le sang coaguler pendant 2 heures au RT sans agitation (Figure 3C).
  3. Centrifugez les échantillons à 1 000 × g pendant 15 minutes à RT. Collectez le surnageant (sérum), qui constitue le sérum autologue (AS) du lapin (Figure 3D).
  4. Filtrez le sérum à travers un filtre à membrane hydrophile PES de 0,22 μm. Ajoutez des aliquotes dans des tubes stériles de 0,2 mL et conservez à −80 °C jusqu’à utilisation.
    REMARQUE : Veillez à ce que la période de stockage ne dépasse pas 6 mois à compter de la préparation.

6. Intervention chirurgicale in vivo

REMARQUE : Effectuer toutes les procédures expérimentales conformément au Comité d’éthique de la recherche animale de l’institution correspondante et respecter les principes de la Déclaration d’Helsinki et la Déclaration ARVO sur l’utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle.

  1. Préparation préopératoire
    REMARQUE : Utilisez des lapins blancs de Nouvelle-Zélande (≈2 kg) comme modèle animal.
    1. Avant l’opération, administrez une anesthésie générale par injection intramusculaire dans la cuisse des animaux en utilisant : Kétamine à 1 mL/kg (50 mg/mL) et Xylazine à 0,3 mL/kg (20 mg/mL). Confirmez l’absence du réflexe cornéen et du pied avant de procéder.
    2. Placez l’animal en position décubitus latérale sur une plateforme chirurgicale stérile et désinfectez la région périoculaire avec une solution de povidone-iode. Placez un spéculum de paupière sur l’œil opérateur pour maintenir une exposition continue de la surface oculaire pendant la procédure.
  2. Kératectomie stromale antérieure
    1. Centrer une tréphine sous vide de 6,5 mm de diamètre sur la cornée du lapin (Figure 4A). Appliquez une aspiration pour stabiliser l’appareil et faites pivoter la tréphine de trois quarts de tour, atteignant une profondeur stromale approximative de 187 μm.
    2. Effectuer une kératectomie stromale antérieure dans la zone tréphinée à l’aide d’une lame en croissant, en retirant les couches épithéliale et stromale antérieure jusqu’à obtenir un lit lisse de la plaie (Figure 4B).
  3. Application in vivo de l’hydrogel
    1. Remplir le défaut cornéen avec 50 μL de la formulation hydrogel correspondante, préchauffée à 32 °C pour garantir une viscosité optimale (Figure 4C).
    2. Initiez la réticulation in situ en illuminant la surface cornéenne avec une lumière bleue (λ= 420–480 nm) pendant 2 minutes. Livrez six impulsions de 20 s avec des pauses de 5 à 10 s entre les impulsions afin de limiter le chauffage local (Figure 4D).
  4. Tarsorrhaphie partielle latérale
    1. Identifier le tiers nasal des marges supérieur et inférieur de la paupière afin de permettre une exposition médiale pour observation et traitement.
    2. Placez la première suture (utilisez 1 à 2 points selon la longueur et la stabilité de la paupière nécessaire) (Figure 4E).
      1. Saisissez le bord latéral supérieur de la paupière avec une pince. Faites passer l’aiguille à travers la ligne grise / le bord de la paupière du côté cutané au côté conjonctival, en prenant une morsure d’épaisseur complète mais en évitant une pénétration profonde dans la plaque tarsale si possible.
      2. Faites passer l’aiguille à travers le point correspondant de la marge inférieure de la paupière, du côté conjonctivale au côté cutané pour créer une apposition des marges de la paupier.
      3. Attachez la suture avec un nœud de chirurgien sécurisé et deux nœuds carrés, en laissant le nœud sur la surface cutanée légèrement positionné sur le bord extérieur de la paupière plutôt que directement au-dessus.
      4. Placez une seconde suture environ 3 à 4 mm médiale de la première si une stabilité supplémentaire est requise, en utilisant la même suture en forme de U pleine épaisseur ou un point simplement interrompu.
      5. Taillez les queues de suture à 3–4 mm pour réduire l’irritation, en laissant suffisamment de longueur pour un retrait ultérieur.
      6. Confirmez que l’apposition de la paupière protège la cornée traitée tout en permettant l’accès à la conjonctive/cornée médiale et temporale pour inspection et traitement par gouttes ophtalmiques. Assurez-vous que la tarsorrhaphie n’est pas trop tendue et que les paupières de l’animal ne sont pas ischémiques (Figure 4F).
  5. Surveillance et soins postopératoires
    1. Administrez de la buprénorphine à 0,05 mg/kg par injection sous-cutanée avant la kératectomie et toutes les 12 heures pendant 72 heures pour administrer une analgésie.
    2. Injectez 3 mg/mL de gouttes oculaires de Tobramycine deux fois par jour jusqu’à la fermeture complète de la plaie pour prévenir l’infection.
    3. Appliquez une goutte de larmes artificielles à 0,2 % d’acide hyaluronique (HA) sur tous les yeux, y compris les témoins de témoins, quatre fois par jour pour maintenir l’hydratation cornéenne.
    4. Inspectez la tarsorrhaphie au moins deux fois par jour pour détecter des signes de relâchement des sutures, d’infection, de nécrose tissulaire locale ou de tension excessive. Gardez l’animal sous observation pour un comportement normal, une alimentation et des signes d’inconfort oculaire.
    5. À 72 heures après la procédure, coupez le nœud de suture et retirez doucement chaque suture avec une pince, en veillant à ne pas traîner les contaminants sur la surface conjonctivale.
    6. Inspectez les bords de la paupière pour une cicatrisation correcte et la surface cornéenne pour l’intégrité épithéliale. Poursuivez le traitement oculaire selon les besoins jusqu’à ce qu’une fermeture épithéliale complète soit observée.
    7. Surveiller et enregistrer la cicatrisation oculaire et les signes cliniques du jour 3 au 7, en évaluant la fermeture épithéliale, l’opacité et la néovascularisation à l’aide de microscopie à lampe à fente et de coloration à la fluorescéine.
      REMARQUE : Si un signe d’ischémie, de déhiscence de plaie ou d’irritation sévère apparaît, retirez immédiatement le(s) suture(s) et gérez-la en conséquence.
  6. Évaluation de l’irritation oculaire aiguë de Draize
    1. Attachez doucement le lapin avec une serviette ou une couverture enveloppée. Examinez d’abord l’iris et la conjonctive sous une lumière blanche.
    2. Notez la rougeur conjonctivale, la chimiose (œdème) et les écoulements selon l’échelle de Draize ( voir Tableau 1 et Tableau 2).
    3. Notez les six paramètres Draize sur la fiche technique. Calculez l’indice d’irritation oculaire (OII) comme la somme des scores des composants ; OII varie de 0 à 110, où des valeurs plus élevées indiquent une irritation plus forte.
    4. Classez chaque œil selon les catégories de Kay–Calandra selon l’OII ; enregistrez la catégorie dans le jeu de données.
  7. Documentation photographique de la cicatrisation des plaies
    1. Injectez une solution de fluorescéine (5 μL) dans le sac conjonctival inférieur.
    2. Éclairez l’œil avec une lumière bleue et évaluez l’opacité cornéenne (densité et surface) ainsi que l’étendue de la coloration à la fluorescéine.
    3. Réglez l’appareil avec un équilibre manuel des blancs, le zoom optique désactivé, et positionnez-vous à environ 3 cm de l’œil pour capturer toutes les images en utilisant des paramètres identiques sur les séances. Capturez les images après une installation de fluorescéine avec ou sans éclairage en lumière bleue pour délimiter les défauts épithéliaux. Capturez les images au jour 0 (avant la tarsorrhaphie) et quotidiennement à partir du jour 3 (après le retrait de la tarsorrhaphie) jusqu’à la fermeture complète de l’épithélium.
    4. Analysez les images avec le logiciel ImageJ et quantifiez la surface des régions colorées à la fluorescéine.
      REMARQUE : La documentation photographique des jours 1 et 2 n’est généralement pas réalisable en raison de la tarsorrhafie partielle. Indiquez que les images des jours 1 et 2 manquent dans l’ensemble de données et signalez tout événement indésirable (par exemple, abrasion cornéenne incidente).
  8. Euthanasie et collecte de tissus
    1. Au jour 21 (après la période d’évaluation des deux yeux), on anesthésie profondément les animaux à l’aide de kétamine (2 mL/kg) et de xylazine (0,6 mL/kg) administrées par voie intramusculaire.
    2. Euthanasiez par injection intraveineuse de 10 mL de chlorure de potassium saturé (KCl) dans la veine marginale de l’oreille.
    3. Confirmer la mort par début de rigidité cadavérique et absence de réflexes vitaux avant de procéder à la prélèvement des tissus.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

Synthèse et caractérisation de l’hydrogel
L’hydrogel a été synthétisé et évalué in vitro pour déterminer ses propriétés rhéologiques et optiques avant et après la réticulation photo. La rhéologie de cisaillement a été utilisée pour caractériser la viscoélasticité, le rendement et le comportement d’écoulement. Les balayages de fréquence ont montré que G′ restait supérieur à G » sur toutes les fréquences testées, indiquant un comportement semblable à un solide ...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

Le protocole actuel prévoit un flux de travail reproductible pour la préparation, le chargement et l’application d’un hydrogel gélatine-riboflavine photo-réticulable pour la cicatrisation des plaies cornéennes. Plusieurs étapes in vitro sont cruciales pour obtenir une qualité de gel constante et méritent une mise en avant car elles sont les sources de variabilité les plus fréquentes. Premièrement, maintenir la solution précurseur à 80 °C lors du brassage garantit la dissolution ...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

Cette étude de recherche a été soutenue par des subventions du Département de la Santé du Gouvernement basque (2023111027 et IT524-22). C.R.-V. a été soutenue par une bourse de l’Université du Pays basque UPV/EHU. Le soutien technique aux soins aux animaux et au service de microscopie analytique et haute résolution fourni par SGIker (UPV/EHU) est chaleureusement reconnu.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Amphotericin BGibco (Thermo Fisher Scientific)15290018Concentration finale : 1,25 μg/mL
Sérum autologue, lapin (AS)Prêt en interne-Prêt à partir de sang total; filtré par un filtre de 0,22 μm PES
Lampe de durcissement LED bleueWoodpecker Medical Instrument CoModèle LED.CLongueur d'onde: λ=420–480 nm; Distance: 1–2 cm; Puissance lumineuse: 850-1000 mW/cm2
Buprénorphine (Buprecare)Ecuphar578950Dose: 0,05 mg/kg, injection sous-cutanée toutes les 12 h pendant 72 h
CaméraPanasonicLUMIX TZ35Caméra équipée d'optique Leica
Plateau de chauffage à agitation numérique CimarecThermo Fisher ScientificSP131320-33220-240 V, Température max: 540 °C
Lame microchirurgicale en croissantBVI Medical373807-
DMEM (milieu de Dulbecco modifié par Eagle)Gibco (Thermo Fisher Scientific)11966025-
Tubes Eppendorf (0,2 mL)Merck KGaA30124707Conservés au froid pour la préparation du HAMe; aliquotage
Tubes Eppendorf (5 mL)Merck KGaA30119606Conservés au froid pour la préparation du HAMe; aliquotage
Solution de fluorescéine NovartisColorcusi FluotestSolution de Fluorescein à 2 %, gouttes pour les yeux de 5 µl
Gibco NéomycineMerck KGaAN1142Concentration finale: 50 μg/mL
Poudre de gélatineSigma AldrichG1890Dissoute à 80 °C; pH ajusté à 7,0
Larmes artificielles à l'acide hyaluronique (0,2 %)Chem.-pharm. Fabrik GmbHHylo-Tear-
Logiciel de traitement d'image ImageJInstitut national de la santé mentale-Développé par Wayne Rasband à la Direction des services de recherche
Kétamines (Ketolar)Pfizer631028.1
LidocaïneVet OneNDC 13985-222-04Injection topique ou sous-cutanée
Pénicilline-streptomycineGibco (Thermo Fisher Scientific)15140-122Concentration finale: 50 μg/mL
Filtres de seringue PES, 0,22 μm0,22μm (Millex)Merck KGaASLGP033RS-
Tampon de phosphate de sodium (PBS)Sigma AldrichP4417-100TAB-
Cocktail d'inhibiteurs de protéaseSigma AldrichP8340Ajouté à la quantité de 5 μL par mg de tissu
Solution de bétadineMeda pharma7167204Désinfection préopératoire
Phosphate de riboflavine (RFP)Sigma AldrichR0630000Concentration: 0,01% p/v (finale); 0,02% p/v (stock)
SonicateurBandelein electronicSonoplus GM mini20-
Sonde de sonicateurBandelein electronicMS 1.5Sonde de 1,5 mm de diamètre, 63 mm de longueur.
Sutures de tarsorraphie (non absorbables)Alcon 80653080011–2 sutures selon les besoins
Solution ophtalmique de tobramycine (3 mg/mL)NovartisTobrexDosage: deux fois par jour jusqu'à la fermeture
Tréphine Hessburg-Barron, diamètre de 6,5 mmJedmed21-8265-
Tubes Vacutainer de prélèvement sanguin avec séparateur de gel polymèreBD (Becton, Dickinson and Company)367704-
Solution de xylazineLaboratorios Calier SAXylagesicDose: 5 mg/kg injection intramusculaire

Références

  1. Meek, K., Knupp, C. Corneal structure and transparency. Prog Retin Eye Res. 49, 1-16 (2015).
  2. Akowuah, P. K., Cruz, A. D. L., Smith, C. W., Rumbaut, R. E., Burns, A. R. An epithelial abrasion model for studying corneal wound healing. J Vis Exp. (178), e63112(2021).
  3. Mobaraki, M., et al. Corneal repair and regeneration: current concepts and future directions. Front Bioeng Biotechnol. 7, 135(2019).
  4. Vaidyanathan, U., et al. Persistent corneal epithelial defects: a review article. Med Hypotheses Discov Innov Ophthalmol. 8 (3), 163-176 (2019).
  5. Wilson, S. E., Goshe, J. M. Prevention and treatment of persistent epithelial defects after common refractive surgery procedures. J Refract Surg. 40 (2), 117-124 (2024).
  6. Wirostko, B., Rafii, M. J., Sullivan, D. A., Morelli, J., Ding, J. Novel therapy to treat corneal epithelial defects: a hypothesis with growth hormone. Ocul Surf. 13 (3), 204-212 (2015).
  7. Zernii, E. Y., Baksheeva, V. E., Yani, E. V., Philippov, P. P., Senin, I. I. Therapeutic proteins for treatment of corneal epithelial defects. Curr Med Chem. 26 (3), 517-545 (2019).
  8. Torricelli, A. A., Santhanam, A., Wu, J., Singh, V., Wilson, S. E. The corneal fibrosis response to epithelial-stromal injury. Exp Eye Res. 142, 110-118 (2016).
  9. Anitua, E., et al. Progress in the use of plasma rich in growth factors in ophthalmology: from ocular surface to ocular fundus. Expert Opin Biol Ther. 22 (1), 31-45 (2021).
  10. Meng, S., et al. A versatile hydrogel with antibacterial and sequential drug-releasing capability for the programmable healing of infectious keratitis. ACS Nano. 17 (23), 24055-24069 (2023).
  11. Rafat, M., et al. Bioengineered corneal tissue for minimally invasive vision restoration in advanced keratoconus in two clinical cohorts. Nat Biotechnol. 41 (1), 70-81 (2023).
  12. Di Girolamo, N. Biologicals and biomaterials for corneal regeneration and vision restoration in limbal stem cell deficiency. Adv Mater. 36 (42), 2401763(2024).
  13. Huang, J., et al. Biologically inspired bioactive hydrogels for scarless corneal repair. Sci Adv. 10 (51), eadt1643(2024).
  14. Brunel, L. G., et al. In situ universal orthogonal network (UNION) bioink deposition for direct delivery of corneal stromal stem cells to corneal wounds. Bioact Mater. 48, 414-430 (2025).
  15. Sani, E. S., et al. Sutureless repair of corneal injuries using naturally derived bioadhesive hydrogels. Sci Adv. 5 (3), eaav1281(2019).
  16. Sharifi, S., et al. Tuning gelatin-based hydrogel towards bioadhesive ocular tissue engineering applications. Bioact Mater. 6 (11), 3947-3961 (2021).
  17. Li, M., et al. A “T.E.S.T.” hydrogel bioadhesive assisted by corneal cross-linking for in situ sutureless corneal repair. Bioact Mater. 25, 333-346 (2023).
  18. Chen, F., Le, P., Fernandes-Cunha, G. M., Heilshorn, S. C., Myung, D. Bioorthogonally crosslinked hyaluronate collagen hydrogel for suture-free corneal defect repair. Biomaterials. 255, 120176(2020).
  19. McTiernan, C. D., et al. LiQD cornea: pro-regeneration collagen mimetics as patches and alternatives to corneal transplantation. Sci Adv. 6 (25), eaba2187(2020).
  20. Feng, L., et al. Thermo-gelling dendronized chitosans as biomimetic scaffolds for corneal tissue engineering. ACS Appl Mater Interfaces. 13 (41), 49369-49379 (2021).
  21. Tang, Q., et al. Exosomes-loaded thermosensitive hydrogels for corneal epithelium and stroma regeneration. Biomaterials. 280, 121320(2022).
  22. Lee, Y. P., et al. Facile fabrication of superporous and biocompatible hydrogel scaffolds for artificial corneal periphery. Colloids Surf B Biointerfaces. 175, 26-35 (2019).
  23. He, B., et al. 3D printed biomimetic epithelium/stroma bilayer hydrogel implant for corneal regeneration. Bioact Mater. 17, 234-247 (2022).
  24. Fernandes-Cunha, G. M., et al. Supramolecular host-guest hyaluronic acid hydrogels enhance corneal wound healing through dynamic spatiotemporal effects. Ocul Surf. 23, 148-161 (2023).
  25. Wang, Q., et al. Photocurable and temperature-sensitive bioadhesive hydrogels for sutureless sealing of full-thickness corneal wounds. Small Methods. 8 (3), 2300996(2024).
  26. Brar, S., Ganesh, S., Reddy, S. S., Nagesh, B. N., Shahanand, D. A prospective, comparative, clinical study to evaluate the safety and efficacy of two different 0.1% riboflavin solutions used in collagen crosslinking treatment for patients with keratoconus. Clin Ophthalmol. 15, 2607-2617 (2021).
  27. Lee, H. J., Fernandes-Cunha, G. M., Myung, D. In situ-forming hyaluronic acid hydrogel through visible light-induced thiol-ene reaction. React Funct Polym. 131, 29-35 (2018).
  28. Fernandes-Cunha, G. M., Lee, H. J., Kumar, A., Kreymerman, A., Heilshorn, S., et al. Immobilization of growth factors to collagen surfaces using pulsed visible light. Biomacromolecules. 18 (10), 3185-3196 (2017).
  29. Schuldt, C., et al. Dose-dependent collagen cross-linking of rabbit scleral tissue by blue light and riboflavin treatment probed by dynamic shear rheology. Acta Ophthalmol. 93 (5), 328-336 (2015).
  30. Kubo, M., Sonoda, Y., Muramatsu, R., Usui, M. Immunogenicity of human amniotic membrane in experimental xenotransplantation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (7), 1539-1546 (2001).
  31. Garfias, Y., Zaga-Clavellina, V., Vadillo-Ortega, F., Osorio, M., Jiménez-Martínez, M. C. Amniotic membrane is an immunosuppressor of peripheral blood mononuclear cells. Immunol Investig. 40 (2), 183-196 (2011).
  32. Yazdanpanah, G., et al. A light-curable and tunable extracellular matrix hydrogel for in situ suture-free corneal repair. Adv Funct Mater. 32 (24), 2113383(2022).
  33. Niknejad, H., Yazdanpanah, G., Ahmadiani, A. Induction of apoptosis, stimulation of cell-cycle arrest and inhibition of angiogenesis make human amnion-derived cells promising sources for cell therapy of cancer. Cell Tissue Res. 363 (3), 599-608 (2016).
  34. Kakavand, M., Yazdanpanah, G., Ahmadiani, A., Niknejad, H. Blood compatibility of human amniotic membrane compared with heparin-coated ePTFE for vascular tissue engineering. J Tissue Eng Regen Med. 11 (6), 1701-1709 (2017).
  35. Basasoro, A., et al. The influence of amniotic membrane proteins on corneal regeneration when delivered directly or using hydrogel platforms. Front Med (Lausanne). 12, 1498319(2025).
  36. Tsubota, K., Goto, E., Shimmura, S., Shimazaki, J. Treatment of persistent corneal epithelial defect by autologous serum application. Ophthalmology. 106 (10), 1984-1989 (1999).
  37. Geerling, G., MacLennan, S., Hartwig, D. Autologous serum eye drops for ocular surface disorders. Br J Ophthalmol. 88 (11), 1467-1474 (2004).
  38. Jeng, B. H., Dupps, W. J. Autologous serum 50% eyedrops in the treatment of persistent corneal epithelial defects. Cornea. 28 (10), 1104-1108 (2009).
  39. Romo-Valera, C., et al. In vitro evaluation of gelatin-based hydrogels as potential fillers for corneal wounds. Biomacromolecules. 26 (6), 3344-3355 (2025).
  40. Romo-Valera, C., et al. Comparison of the regenerative potential of different functionalized gelatin-based hydrogels as fillers of rabbit corneal wounds. Front Med (Lausanne). 12, 1667446(2025).
  41. Wilhelmus, K. R. The Draize eye test. Surv Ophthalmol. 45 (6), 493-515 (2001).
  42. Kay, J., Calandra, J. Interpretation of eye irritation tests. J Soc Cosmet Chem. 13 (6), 281-289 (1962).
  43. Weidinger, A., Poženel, L., Wolbank, S., Banerjee, A. Sub-regional differences of the human amniotic membrane and their potential impact on tissue regeneration application. Front Bioeng Biotechnol. 8, 613804(2021).
  44. Romo-Valera, C., Etxebarria, J., Freire, V., Durán de la Colina, J., Arluzea, J., et al. An in vitro pre-screening model to evaluate the corneal anti-inflammatory effect of human blood-derived products and amniotic membrane extracts incorporated into gelatine-based hydrogels. Experimental eye research. 260, 110617(2025).
  45. Ingraldi, A. L., Audet, R. G., Tabor, A. J. The preparation and clinical efficacy of amnion-derived membranes: a review. J Funct Biomater. 14 (10), 531(2023).
  46. Murri, M. S., et al. Amniotic membrane extract and eye drops: a review of literature and clinical application. Clin Ophthalmol. 12, 1105-1112 (2018).
  47. Shakouri-Motlagh, A., O’Connor, A. J., Kalionis, B., Heath, D. E. Improved ex vivo expansion of mesenchymal stem cells on solubilized acellular fetal membranes. J Biomed Mater Res A. 107 (1), 232-242 (2019).
  48. Acharya, M., Gour, A., Dave, A. Commentary: tarsorrhaphy. Indian J Ophthalmol. 68 (1), 33-34 (2020).
  49. Dhillon, H., Bahadur, H., Raj, A. A comparative study of tarsorrhaphy and amniotic membrane transplantation in the healing of persistent corneal epithelial defects. Indian J Ophthalmol. 68 (1), 29-33 (2020).
  50. Maharjan, S. S., Pant, A. R., Joshi, P., Shrestha, P., Sharma, R. Outcomes of fungal corneal ulcer with impending perforation after temporary suture tarsorrhaphy. Nepal J Ophthalmol. 14 (27), 72-81 (2022).
  51. Bamrolia, N. R., Arora, R., Yadava, U. Unusual presentation of a case of Sjogren’s syndrome with neurological and ocular manifestation. Cont Lens Anterior Eye. 35 (2), 85-88 (2012).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Hydrogels de g latiner ticulation la riboflaviner ticulation par lumi re bleuecorn e de lapinfabrication d hydrogelsk ratectomie stromale ant rieureextrait de membrane amniotiquehydrogel injectablebiomat riaux ophtalmiques

Articles connexes