Article de méthode

Marquage métabolique du transcriptome naissant chez Xenopus : embryogenèse précoce

DOI :

10.3791/70591

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27 mars 2026

 , 
1Department of Biological Sciences, University of South Carolina

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous fournissons des méthodes détaillées pour marquer et purifier métaboliquement les transcrits naissants pour l’analyse du transcriptome chez les embryons précoces de Xénopus en utilisant la 5-éthynyl-uridine (5-EU).

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’embryogenèse précoce nécessite la transcription de nouveaux gènes zygotiques à partir du génome zygotique initialement dormant après la fécondation. Un défi majeur a été de détecter avec précision les nouveaux transcrits et de déterminer leur temps d’expression lors de l’activation du génome zygotique (ZGA). Ici, nous fournissons des procédures détaillées pour le marquage métabolique des transcrits naissants par la 5-ethynyl-uridine (5-EU) dans les premiers embryons de Xenopus laevis . Après la fécondation, le 5-EU est microinjecté dans les embryons du stade unicellulaire pour marquer métaboliquement les ARN nouvellement transcrits pendant la ZGA. Les ARN-UE naissants sont ensuite purifiés après biotinylation via des réactions médiées par la chimie du clic, et le transcriptome naissant est déterminé par séquençage de nouvelle génération. Il est important de noter que cette méthode présente une grande sensibilité et spécificité qui permettent la caractérisation de gènes faiblement activés. Ainsi, cette approche fournit un outil puissant pour étudier la dynamique de la transcription génique au début du développement, et peut être généralisée à d’autres systèmes embryonnaires ou tissus.

Introduction

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Après la fécondation, l’embryon est sous le contrôle des facteurs maternels déposés dans l’ovule, tandis que le génome zygotique reste transcriptionnellement silencieux pendant un certain temps ; Il est activé pour transcrire des centaines voire des milliers de gènes essentiels au développement ultérieur, y compris la spécification du destin cellulaire et la formation des couchesgerminales 1,2,3,4,5,6. Ce phénomène d’activation du génome zygotique (ZGA) lors de la transition maternelle-zygotique (MZT) est très conservé chez toutes les espèces de métazoaires, bien que le moment de la ZGA varie selon les espèces1, 2, 3, 4, 5, 6. Comprendre comment la ZGA est régulée est non seulement important pour comprendre les principes fondamentaux du développement précoce, mais offre aussi un potentiel pour développer de nouvelles stratégies de diagnostic et de traitement des troubles du développement et pour améliorer la santé reproductive.

Un défi majeur de l’étude du ZGA a été de détecter avec précision les nouveaux transcrits et de déterminer leur moment d’apparition lors de l’activation du génome zygotique (ZGA). En raison de la prédominance des transcrits maternels dans les premiersembryons 7, les niveaux élevés de ces transcrits peuvent masquer la détection de nouveaux transcrits pendant la ZGA, en particulier pour ces gènes faiblement activés, utilisant l’ARN-seq conventionnel en vrac. Pour surmonter ce défi, nous avons développé une méthode de mesure du transcriptome naissant en utilisant le marquage métabolique des transcrits naissants avec de la 5-éthynyl-uridine (5-EU), suivie de la biotinylation des ARN-UE naissants via la chimie du clic et leur purification pour le séquençage (EU-ARN-seq)8,9,10. Contrairement à d’autres méthodes de profilage de transcrits naissantes, telles que celles utilisant la 4-thiouridine (4sU)11,12, le marquage 5-EU est très spécifique via la chimie du clic, peut être utilisé à la fois pour l’imagerie et le séquençage, et ne nécessite pas de conversion chimique. De plus, le jeune EU-RNA-seq est très sensible et détecte des centaines de gènes, dont l’activation ne peut être détectée par l’ARN-seq globalconventionnel 8. Cette approche nous a également permis de déterminer avec précision l’apparition de l’activation des gènes zygotiques individuels et de profiler les schémas spatiotemporels distincts de ZGA lors de l’embryogenèseprécoce 8.

Nous décrivons ici les procédures détaillées de préparation des échantillons pour l’EU-RNA-seq afin de profiler le transcriptome naissant en utilisant les premiers embryons de Xenopus laevis comme modèle. Ce protocole est adapté d’une méthodeprécédente 10,13 avec des optimisations mineures dans les procédures, incluant la microinjection de 5-EU dans les embryons du stade 1-cellulaire, la biotinylation des ARN-EU naissants via une réaction de clic, et leur purification pour le séquençage (Figure 1). Pour assurer la reproductibilité, selon les stades des embryons précoces avec une abondance variable de transcrits naissants, 1 à 10 μg d’ARN total doivent être utilisés en entrée, bien qu’une quantité plus faible puisse encore être utilisée. Ce protocole peut être appliqué dans d’autres systèmes embryonnaires, tels que Drosophila14 et poisson-zèbre15, ainsi que dans d’autrestissus 13. Cette méthode est un outil puissant pour notre compréhension de la transcription génique et des mécanismes régulateurs dans divers processus biologiques, y compris la révélation de nouveaux principes de l’embryogenèse précoce.

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Protocole

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Les travaux sur les animaux décrits dans cette étude ont été approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université de Caroline du Sud. La sécurité en laboratoire et l’élimination des déchets doivent respecter les réglementations institutionnelles.

1. Préparation des réactifs et des tampons

  1. Solution 20x MMR (Marc’s Modified Ringer) : mélangez 100 mM HEPES, 2 mM EDTA, 2 M NaCl, 40 mM KCl, 20 mMMgCl 2 et 40 mMCaCl 2. Ajustez le pH à 7,8 avec NaOH. Autoclave et stockage à température ambiante.
  2. 3 % de Ficoll (en mousse/v)/0,5x MMR : Ajoutez lentement 1,5 g de Ficoll 400 à 50 mL de 0,5x MMR tout en remuant doucement avec une barre magnétique jusqu’à ce que le Ficoll soit complètement dissous. Autoclave et garde à 4 °C jusqu’à utilisation.
  3. Solution d’origine 5-ethynyl uridine (5-EU) : Pour obtenir la solution de 50 mM, ajoutez 372,8 μL de tampon (notez que tout tampon compatible avec la microinjection peut être utilisé, par exemple 1 cuillère à soupe, pH 7,6) dans le flacon de 5 mg. Mélangez bien et faites des aliquotes de 2 μL. Conserver à -80 °C.

2. Microinjection de 5-EU dans des embryons unicellulaires

  1. Pour obtenir des embryons de Xénopus , suivez les protocoles standards pour réaliser la fécondation in vitro (FIV) (par exemple, voir Sive et al., 2007)16. L’embryon devrait être en MMR 0,1x, prêt à être utilisé.
  2. Ajoutez 1 mL de Ficoll à 3 % / MMR 0,5x dans une chambre de microinjection fabriquée à partir d’une lame en verre standard (25 mm x 75 mm). Utilisez une pipette de transfert en plastique pour transférer 20 embryons (ou plus si nécessaire) au centre de la chambre de microinjection.
  3. Utilisez une pince fine pour découper soigneusement l’extrémité très fine de l’aiguille en verre et collez l’aiguille verticalement (avec son extrémité vers le bas) contre l’argile à modeler sur le mur du comptoir. Utilisez la pipette P2 avec la pointe microchargeuse pour ajouter 0,5 μL de 50 mM 5-EU depuis le haut de l’aiguille en verre.
  4. Assemblez l’aiguille sur un micromanipulateur. Utilisez la pipette P10 pour ajouter 10 μL d’huile d’halocarbure sur un micromètre de scène et passez-la sous un stéréomicroscope.
  5. Pour calibrer le volume d’injection, utilisez d’abord le pied pour presser le tampon sur le sol relié au microinjecteur et injectez une gouttelette dans l’huile d’halocarbone du micromètre. Selon la taille des gouttelettes, ajustez la pression et le temps d’injection sur le microinjecteur pour déterminer que le volume d’injection est de 10 nL, c’est-à-dire 0,27 mm de diamètre au micromètre.
  6. Utilisez une pince à épiler d’une main pour aider à tenir l’embryon, utilisez l’autre main pour tenir le micromanipulateur, et injectez 10 nL de 50 mM EU dans des embryons au stade 1-cellule. La concentration finale de 5-EU dans l’embryon est de ~0,5 mM.
  7. Après microinjection, utilisez une pipette de transfert en plastique pour transférer les embryons de la chambre d’injection vers un nouveau plat en verre contenant 3 % de Ficoll/0,5x MMR. Gardez les embryons injectés dans Ficoll pendant ~1 heure.
  8. Retirez soigneusement la solution Ficoll et remplacez le médium par un MMR 0,1x. Gardez les embryons en 0,1x de MMR jusqu’à une utilisation ultérieure. Surveillez constamment le développement des embryons et retirez tout embryon anormal si nécessaire.
  9. Lorsque les embryons atteignent les stades de développement souhaités, on utilise une pipette de transfert en plastique pour transférer 10 embryons dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL. Utilisez une pipette P200 pour retirer soigneusement tout milieu résiduel dans le tube, puis congelez les embryons dans de l’azote liquide.
    Remarque : Pour garantir la rigueur et la reproductibilité, ne collectez que les embryons normaux en fonction de leur apparence par rapport au témoin. Retirer et exclure tout embryon anormal de l’analyse ultérieure. Si nécessaire, prélève également le même nombre d’embryons sans microinjection que les témoins négatifs.
  10. Conservez les embryons dans un congélateur à -80 °C jusqu’à une utilisation ultérieure.

3. Extraction totale d’ARN et mesure de la concentration

REMARQUE : Utilisez un kit d’extraction d’ARN total à base de membrane silicicale pour isoler les ARN totaux des embryons précoces et un kit de quantification d’ARN à haute sensibilité à fluorescence pour déterminer les concentrations d’ARN. Suivez les instructions fournies par le kit, et les étapes suivantes sont légèrement modifiées par rapport au manuel. Toutes les solutions et réactifs utilisés dans les étapes suivantes doivent être exempts de RNase.

  1. Mettez les échantillons du congélateur à -80 °C sur la glace.
  2. Ajoutez 700 μL du Buffer RLT du kit d’extraction ARN dans chaque tube. Utilisez une pipette P1000 pour faire des pipettes de haut en bas au moins 15 fois ou jusqu’à ce que tous les embryons soient dissous.
  3. Laissez les échantillons sur la glace pendant 20 minutes. Mélangez doucement à nouveau en pipettant de haut en bas au moins 10 fois pour homogénéiser complètement les embryons.
  4. Ajoutez 700 μL d’éthanol à 70 % aux embryons homogénéisés. Pipeter de haut en bas pour bien mélanger et transférer les 700 μL du mélange dans une colonne de spin.
  5. Centrifugez la colonne à 10 000 x g pendant 1 minute. Abandonnez le flux direct. Répétez la centrifugeuse jusqu’à ce que le reste du mélange soit complet.
  6. Ajoutez 350 μL du tampon RW1 et centrifugez la colonne à 10 000 x g pendant 1 minute. Abandonnez le flowthrough.
  7. Ajoutez soigneusement 80 μL de DNase I au centre de la membrane dans la colonne. Incubez pendant 15 minutes à température ambiante.
  8. Ajoutez 350 μL de tampon RW1 et centrifugez la colonne à 10 000 x g pendant 1 minute. Abandonnez le flowthrough.
  9. Ajoutez 500 μL de RPE tampon et centrifugez la colonne à 10 000 x g pendant 1 minute. Abandonnez le flowthrough. Répétez le lavage une fois de plus.
  10. Séchez la colonne en la centrifugant à nouveau à 10 000 x g pendant 2 minutes.
  11. Transférez la colonne dans un nouveau tube sans RNase. Ajoutez délicatement 35 μL de H2O sans RNase au centre de la membrane dans la colonne.
  12. Centrifugez la colonne à 10 000 x g pendant 1 minute. Collectez l’ARN élué et gardez la glace.
  13. Pour mesurer la concentration d’ARN, préparez d’abord la solution de travail à l’aide du kit de quantification de l’ARN en diluant le réactif ARN (colorant) à 1:200 dans le tampon ARN. Calculez le volume total de la solution de travail en fonction du nombre total d’étalons et préparez 200 μL pour chaque étalon ou échantillon.
  14. Installez une bande à 8 tubes de 0,2 mL. Pour diluer chaque étalon, ajoutez 10 μL à 190 μL de la solution de travail. Pour diluer chaque échantillon, ajoutez 1 μL à 199 μL de la solution de travail. Mélangez bien.
  15. Mets la bande à 8 tubes dans un fluoromètre. Sélectionnez le test ARN, calibrez avec les étalons et lisez les concentrations des échantillons.

4. Biotinylation et purification naissante de l’ARN de l’UE

REMARQUE : Un kit de capture d’ARN naissant basé sur la chimie du clic est utilisé pour biotinyler et retirer les ARN-UE naissants. Suivez les instructions fournies par le kit, et les étapes suivantes sont légèrement modifiées. Les ARN provenant d’embryons non injectés, ainsi que les ARN-UE sans biotinylation, peuvent servir de contrôles de fond pour la spécificité du pulldown.

  1. Biotinylation et nettoyage de l’ARN
    1. Pour chaque échantillon, mélangez les composants suivants dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL pour obtenir une réaction de clic de 50 μL : ARN total (1–10 μg), 1x tampon EU, 2 mMCuSO 4, 0,25 mM azid de biotine, 10 mM additif 1, et 12 mM additif 2.
    2. Incubez le mélange de réaction à température ambiante pendant 30 minutes sur un nutator.
    3. À chaque réaction ci-dessus, ajoutez 1 μL de glycogène, 50 μL d’acétate d’ammonium 7,5 M et 700 μL d’éthanol 100 % refroidi. Pipettez 5 fois pour bien les mélanger.
    4. Mettez le tube dans un congélateur à -80 °C et conservez-le toute la nuit.
    5. Centrifugez le tube à 13 000 x g pendant 20 minutes à 4 °C. Retirez soigneusement le surnageant sans déranger la pastille.
    6. Ajoutez 700 μL d’éthanol à 75 % et mélangez doucement pour resuspendre le pellet. Centrifugez le tube à 13 000 x g pendant 5 minutes à 4 °C. Retirez soigneusement le surnageant sans déranger la pastille. Répétez le lavage une fois de plus.
    7. Faites sécher le granule à l’air pendant 5 à 10 minutes à température ambiante. Résuspendez le pellet dans un H2O sans RNase de 10 μL.
  2. Purification de l’ARN de l’UE
    1. Pour retirer les ARN-UE naissants, pour chaque échantillon, il faut distribuer 5 μL de billes magnétiques recouvertes de streptavidine dans un nouveau tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL.
    2. Ajoutez 9 μL de tampon de lavage 2. Mélangez bien et placez le tube sur un support magnétique. Laissez reposer 2 minutes. Retirez le surnageant. Répétez le lavage deux fois de plus. Resuspendez les billes dans 5 μL de tampon de lavage 2.
    3. Préparez le mélange maître suivant dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 mL (15 μL pour chaque échantillon) : 12,5 μL de tampon de liaison ARN (composant G), 0,2 μL de RNase OUT diluée 1:10, et 2,3 μL de H2O sans RNase. Ajoutez 15 μL du mélange à chaque tube contenant l’échantillon d’ARN.
    4. Incubez pendant 5 minutes sur un bloc chauffant à 69 °C. Mets le tube sur la glace.
    5. Ajoutez 5 μL des billes pré-lavées ci-dessus à chaque tube contenant l’échantillon d’ARN. Incubez pendant 30 minutes sur un nutator à température ambiante.
    6. Ajoutez 50 μL de tampon de lavage 1. Mélangez bien et placez le tube sur un support magnétique. Laissez reposer 2 minutes. Retirez le surnageant. Répétez le lavage 4 fois de plus.
      Note : Le surnageant après le premier lavage, qui contient vraisemblablement uniquement les transcriptions maternelles, peut être collecté pour mesurer le transcriptome maternel.
    7. Ajoutez 50 μL de tampon de lavage 2. Mélangez bien et placez le tube sur un support magnétique. Laissez reposer 2 minutes. Retirez le surnageant. Répétez le lavage 4 fois de plus.
    8. Resuspendez les billes dans 5 μL de tampon de lavage 2. Les billes, qui contiennent les ARN-UE naissants, sont prêtes pour une synthèse directe d’ADNc et la préparation de la bibliothèque.
      Note : Avant de procéder à la préparation de la bibliothèque, l’enrichissement des transcrits naissants peut être évalué en mesurant l’expression de gènes individuels connus à l’aide de la réaction en chaîne transcription-polymérase inverse (RT-PCR).

5. Préparation et séquençage de la bibliothèque d’ARN

  1. Utilisez des kits disponibles dans le commerce pour préparer les bibliothèques d’ADNc et suivez les instructions fournies par le kit. Utilisez le kit quantitatif de la bibliothèque NEBNext pour Illumina afin de quantifier les bibliothèques et de les mettre en commun.
  2. Regroupez les bibliothèques en suivant les instructions des kits de séquençage de nouvelle génération couramment utilisés. Diluez les bibliothèques à ~1,8 pM avant de les charger dans le séquenceur de paillasse pour obtenir une densité optimale de cluster de ~200k/mm2 lors du séquençage. Séquencez les bibliothèques en utilisant le séquençage de nouvelle génération couramment utilisé. A utilisé un séquençage à extrémité paire à 75 pb pour ~20 millions de lectures par échantillon.
  3. Quantifiez les lectures transcriptomiques en alignant les séquences sur la construction génomique 9.2 de Xenopus laevis en utilisant salmon17 et effectuez une analyse différentielle de l’expression génique avec DESeq218. Pour visualiser les pics dans le navigateur génomique, mappez les séquences au génome à l’aide de STAR19 et affichez-les dans l’Inspecteur de Génomique Intégrative (IGV)19.

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Résultats

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Les embryons de Xenopus laevis (quatre réplicés biologiques) aux stades de 5 à 9 heures après la fécondation (hpf) à 22 °C, qui couvre les stades du stade 5 (avec peu de ZGA à grande échelle) au stade 9 (avec un ZGA élevé), ont été traités selon le protocoleau-dessus de 8. Les ARN totaux, les ARN neufs purifiés et les ARN à flux ont été utilisés pour préparer les bibliothèques et ont été séquencés. Comme le montre la Figure 2...

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Discussion

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Nous avons fourni ici un protocole détaillé pour le marquage métabolique du transcriptome naissant lors de l’embryogenèse précoce, incluant la microinjection du 5-EU dans des embryons unicellulaires, l’extraction totale des ARN et la mesure de leurs concentrations, ainsi que la biotinylation et la purification des ARN-UE naissants pour la préparation et le séquençage de la bibliothèque (EU-ARN-Seq) (Figure 1). En raison de la grande sensibilité et de la spéc...

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Déclarations de divulgation

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L’auteur ne déclare aucun intérêt concurrent.

Remerciements

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Nous remercions le laboratoire Matthew Good de l’Université de Pennsylvanie pour sa formation. Ce travail a été soutenu en partie par l’Institut national Eunice Kennedy Shriver de la santé infantile et du développement humain (R03HD105802).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
& micro ; Microinjecteur PUPMInstruments de précision mondiauxUPUMPPour la microinjection (microinjection sous pression)
5-ehtynyl uridineThermo Fisher ScientificE10345Pour la microinjection (marquage de traqnscripts naissants)
Stereoscopes à zoom ACCU-SCOPE 3075VWR470351-130Pour la microinjection (visualisation des embryons)
Acétate d’ammoniumSigma-AldrichA2706Pour la précipitation de l’ARN
Acide ascorbiqueSigma-AldrichA7506Pour la réaction au clic
Capillaires en verre borosilicateInstruments de précision mondiauxTW100-4Pour la microinjection (fabrication d’aiguilles en verre)
CentrifugeuseEppendorf5425RPour centrifugeuse
Kit de capture d’ARN naissant Click-iTThermo Fisher ScientificC10365Pour la biotinylation et la purification de l’ARN naissant
CuSO4Sigma-Aldrich61230Pour la réaction au clic
DNase IRoche Diagnostics4716728001Pour l’extraction d’ARN
Ficoll 400Sigma-AldrichGE17-0300-10Pour la microinjection (incubation d’embryons)
Boîte de Petri en verre (60 mm)VWR75845-542Pour la fécondation
GlycogèneThermo Fisher ScientificAM9510Pour la précipitation de l’ARN
Huile d’halocarbone 27Sigma-AldrichH8773Pour la microinjection (calibration du volume d’injection)
L-cystéineSigma-Aldrich168149Pour les embryons déjellly
Embouts de microchargeurCalibre ScientificEPE-5242956003Pour la microinjection (chargement du 5-EU dans l’aiguille en verre)
NEBNext Library Quant Kit pour IlluminaNEBE7630Pour la quantification des bibliothèques
NSQ 500/550 Haute sortie KT v2.5 (75 CYS)Illumina20024906Pour le séquençage
Fluoromètre Qubi FlexThermo Fisher ScientificQ33327Pour mesurer la concentration d’ARN
Kit de liaison HS à ARN qubitThermo Fisher ScientificQ32852Pour mesurer la concentration d’ARN
RNeasy Mini KitQiagen74104Pour l’extraction d’ARN
Micromètre de scèneLa science de Ward470175-914Pour la microinjection (calibration du volume d’injection)
RNA-seq universel avec NuQuantNuGEN0364Pour la préparation à la bibliothèque

Références

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Mots-clés

Embryogen se de XenopusActivation du g nome zygotiqueMarquage la 5 thynyluridineTechnique de microinjectionChimie clickPurification de l ARNS quen age de nouvelle g n rationDynamique de l expression g nique

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