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Article de méthode

Visualisation de l’activation du génome zygotique chez des cellules uniques des embryons précoces

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DOI :

10.3791/70592

⸱

3 avril 2026

 , 
1Department of Biological Sciences, University of South Carolina

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons des méthodes permettant de visualiser la transcription naissante lors de l’activation du génome zygotique chez les cellules uniques au début de l’embryogenèse.

Résumé

L’embryogenèse précoce nécessite la transition maternelle-zygotique (MZT) qui nécessite l’activation du génome zygotique (ZGA). Pendant la ZGA, des centaines voire des milliers de gènes sont transcrits, ce qui est essentiel pour divers processus du développement embryonnaire précoce, notamment le maintien de la survie embryonnaire, la spécification du destin cellulaire et la formation des couches germinales. Un défi majeur dans l’étude du ZGA a été de visualiser directement le ZGA dans des cellules individuelles d’embryons précoces. Ici, nous décrivons une méthode permettant de visualiser directement la ZGA dans des cellules uniques d’embryons précoces par marquage métabolique de transcrits naissants à l’aide de 5-éthynyle uridine (5-EU), puis en conjuguant les ARN-EU naissants avec des fluorophores via la chimie du clic et en les visualisant dans des embryons montés entiers par microscopie confocale, en utilisant Xenopus laevis comme modèle. Cette méthode nous a permis de suivre la ZGA unicellulaire dans des embryons montés entiers et de révéler l’apparition hétérogène de la ZGA dans l’espace et le temps lors des débuts de l’embryogenèse. Il peut être utilisé dans d’autres systèmes embryonnaires ou tissus pour étudier la transcription génique et la régulation du génome au niveau unicellulaire.

Introduction

Au début du développement, l’embryon subit la transition maternelle vers zygotique (MZT) qui déplace progressivement le contrôle du développement des facteurs maternels vers ceux des gènes zygotiques. Le MZT nécessite l’activation du génome zygotique initialement dormant, un processus appelé activation du génome zygotique (ZGA) ; les gènes exprimés pendant la ZGA sont nécessaires à la spécification précoce du destin cellulaire, à la gastrulation et à la formationdes axes 1,2. Il est important de noter que le ZGA est conservé chez tous les métazoaires, et que le moment de l’AGZ est strictement contrôlé, bien qu’il varie entre les espèces3 et 4. La dysrégulation du ZGA peut entraîner de graves conséquences, allant de défauts du développement à la mort embryonnaire, comme une fausse couche. Par conséquent, étudier les mécanismes de la ZGA est non seulement important pour comprendre les fondamentaux de la régulation génique, mais a aussi des implications cliniques significatives.

Un défi majeur dans l’étude du ZGA a été de visualiser directement le ZGA à grande échelle chez les embryons précoces et d’étudier ses mécanismes au niveau unicellulaire. Nous avons surmonté ce défi en développant une méthode utilisant le marquage métabolique des transcrits naissants pendant la ZGA avec de l’uridine 5-éthynyle (5-EU), suivi de la conjugaison des ARN-EU naissants en fluorophores via la chimie du clic et la visualisation sur des embryons montés entiers par microscopie confocale, en utilisant Xenopus laevis comme modèle. Le grand embryon de Xénopus (~1,2 mm de diamètre) contient un gradient de taille cellulaire, et le ZGA à grande échelle se situe autour des stades médiens de la blastule (avec début autour du stade 7 et pic autour du stade 9), ce qui en fait un modèle idéal pour étudier les schémas du ZGA5. En utilisant le marquage 5-EU dans les premiers embryons de Xenopus, nous avons pu visualiser et quantifier directement le ZGA à grande échelle dans des cellules individuelles d’embryons entiers précoces, ce qui nous a conduits à découvrir un nouveau schéma spatiotemporel de ZGA principalement régulé par la taille cellulaire 5,6.

Nous décrivons ici les détails de cette approche, adaptée de travaux antérieurs avec des optimisations 5,7, incluant la fixation des embryons après le marquage métabolique de transcrits naissants avec la 5-EU, la conjuguation d’ARN-EU naissants avec un fluorophore via une réactionde clic 8, et l’immunocoloration pour les marqueurs subcellulaires, suivie de l’obtention des embryons pour l’imagerie confocale. Cette méthode peut être appliquée à d’autres systèmes embryonnaires, y compris le poisson-zèbre 9,10, ou utilisée dans le séquençage pour profiler le transcriptomenaissant 11, soutenant ainsi son application générale et large dans divers types d’échantillons et d’analyses. Dans l’ensemble, cette méthode constitue un nouveau moyen important d’étudier les mécanismes régulateurs du génome chez les cellules individuelles.

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Protocole

Les travaux sur les animaux décrits ici ont été approuvés par le Comité de soins et d’utilisation des animaux institutionnels (IACUC) de l’Université de Caroline du Sud.

1. Préparation avant le début du protocole

REMARQUE : Avant de commencer le protocole, préparez les solutions suivantes à l’aide d’eau sans RNase.

  1. Préparez 1× sérum sérum tamponné en tris (TBS), pH 7,6 : 50 mM Tris-HCl et 150 mM NaCl. Ajustez le pH à 7,6. Conserver à température ambiante. Utilisez le tampon dans les deux mois.
  2. Préparer 1× solution physiologique tamponnée avec Tween 20 (TBST), pH 7,6 : ajouter Triton X-100 à une concentration finale de 0,1 % (vol/vol) à 1× cuillères à soupe (pH 7,6) préparé à l’aide d’eau sans RNase. Conserver à température ambiante. Utilisez le tampon dans un mois.
  3. Préparez 4 % de paraformoldéhyde (PFA)/1× MEM : mélangez 1 flacon (10 mL) de stock de 16 % de PFA et 4 mL de 10 × de MEM (1000 mM acide propanesulfonique 3- (N-morpholino)propanesulfonique [MOPS] pH 7,4, 20 mM d’EGTA et 10 mM deMgSO 4). Ajoutez de l’eau sans RNase à 40 mL. Aliquot et conserver à -20 °C. Utilisez la solution dans les 6 mois.
  4. Préparez 70 %, 50 % et 25 % de méthanol en 0,5× SSC : mélangez méthanol et 0,5× SSC en 3:1, 1:1 et 1:3, respectivement. Utilisez la solution dans les six mois.
  5. Préparez la solution de blanchiment : mélangez pour atteindre une concentration finale de 2 % (vol/vol)H2O2, 5 % (vol/vol) formamide et 0,5 × SSC dans de l’eau sans RNase. Préparez cette solution juste avant utilisation.
  6. Préparez la solution de blocage : Ajoutez une concentration finale de 10 % (vol/vol) de sérum de chèvre et 0,2 % (poids/vol) de BSA dans 1× TBST. Conserver à -20 °C. Utilisez la solution dans les 6 mois.
  7. Préparez le réactif de dégagement BABB : Mélangez 1 part d’alcool benzylique (BA) et 2 parts de benzoate benzylique (BB). Conserver à température ambiante. Utilisez la solution dans les 6 mois.

2. Fixation des embryons microinjectés à 5-EU

  1. Pour microinjecter de la 5-éthynyl-uridine (5-EU) dans des embryons à 1 cellule, suivez les procédures décritesprécédemment 11. Laissez les embryons se développer jusqu’aux stades souhaités de ZGA, par exemple le stade 9 lorsque le ZGA est actif dans la plupart des cellules de l’embryon.
  2. Pour fixer les embryons microinjectés au 5-EU, ajoutez d’abord environ 1,8 mL de 4 % de PFA/1× MEM dans un flacon en verre à scintillation de 2 mL. Ensuite, utilisez une pipette de transfert en plastique pour transférer ~20 embryons dans le flacon en verre. Minimisez la quantité de substrat de culture ajoutée à la fiole en verre.
  3. Remplissez le flacon en verre jusqu’au sommet avec 4 % de PFA/1× MEM supplémentaire. Fermez la fiole avec le bouchon ; aucune bulle d’air ne doit être laissée derrière.
  4. Placez la fiole en verre sur un rotateur et faites tourner l’embryon à basse vitesse (par exemple, 10 tr/min) pendant au moins 2 heures à température ambiante.
  5. Utilisez une pipette pour retirer délicatement le fixateur. Remplissez le flacon en verre de méthanol à 100 %. Placez le flacon en verre sur un rotateur et faites tourner les embryons à basse vitesse pendant 5 minutes.
  6. Retirez délicatement le méthanol et ajoutez du nouveau méthanol. Répétez la rotation et la déshydratation au moins deux fois afin que les embryons soient complètement déshydratés.
  7. Stockez les embryons dans du méthanol à -20 °C.
    REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici. Laissez les embryons rester dans le méthanol pendant au moins 2 jours avant de procéder aux étapes suivantes. Les embryons peuvent être utilisés en moins de 2 mois.

3. Conjuguation d’ARN naissants avec un fluorophore par réaction de clic

  1. Pour réhydrater les embryons, retirez d’abord le méthanol du flacon en verre, puis ajoutez 2 mL de méthanol à 75 % dans 0,5× SSC, et refermez le flacon avec le bouchon. Placez le flacon en verre sur un rotateur et faites tourner les embryons à basse vitesse pendant 5 minutes.
  2. Retirez le liquide dans la fiole en verre après la rotation. Répétez l’étape ci-dessus séquentiellement en utilisant 50 % de méthanol dans 0,5× SSC, 25 % de méthanol dans 0,5× SSC et 0,5× SSC. Pour réhydrater complètement les embryons, répétez le lavage final avec 0,5× SSC au moins deux fois.
  3. Ajoutez 2 mL de solution de blanchiment fraîchement préparée (2 % d’H, 2O2 et 5 % de formamide dans 0,5× SSC) dans le flacon en verre. Placez le flacon en verre sur un morceau de papier aluminium, puis placez-le sous une lumière LED à une distance qui ne surchauffera pas les échantillons.
  4. Blanchissez les embryons sous la lumière jusqu’à ce que tous les pigments deviennent blancs, ce qui prend généralement 5 à 6 heures. Notez qu’en raison de la décomposition deH2O2 enO2, cela engendra de petites bulles d’air qui peuvent faire flotter les embryons. Vérifiez les embryons périodiquement (par exemple toutes les 30 minutes) et faites doucement tourner le flacon en verre pour laisser les embryons se déposer dans la solution blanchissante.
  5. Retirez soigneusement le tampon de blanchiment. Ajoutez 2 mL de SSC de 0,5× pour rincer rapidement les embryons. Répétez le rinçage rapide une fois de plus si nécessaire.
  6. Ajoutez 2 mL de 1× TBST dans le flacon en verre. Placez le flacon en verre sur un rotateur et faites tourner les embryons à faible vitesse pendant 1 heure. Retirez le liquide dans la fiole en verre après la rotation.
  7. Répétez l’étape ci-dessus au moins 5 fois. Notez qu’un lavage approfondi des embryons est essentiel pour les étapes suivantes.
  8. Ajoutez 2 mL de 1× cuillère à soupe dans le flacon en verre. Placez le flacon en verre sur un rotateur et faites tourner les embryons à basse vitesse pendant 5 minutes. Retirez le liquide dans la fiole en verre après la rotation.
  9. Répétez l’étape ci-dessus une fois de plus.
  10. Préparez le mélange pour la réaction de clic dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL en ajoutant les réactifs suivants pour atteindre des concentrations finales de 100 mM de Tris-HCl (pH 8,5), 1 mM de CuSO4, 25 μM de tétraméthylrhodamine (TAMRA)-azide et 100 mM d’acide ascorbique. Ajoutez l’acide ascorbique en dernier à la réaction. Faites une pipette de haut en bas pour bien mélanger.
  11. Ajoutez un mélange de réaction de 200 μL aux embryons dans le flacon en verre. Assurez-vous que le volume du mélange de réaction est suffisant pour immerger tous les embryons dans le flacon. Incubez pendant 12 heures à température ambiante dans le noir.
  12. Retirez soigneusement le mélange de réaction au clic. Notez que la fluorescence non spécifique sur les embryons peut être observée. Rincez rapidement les embryons deux fois avec 1× TBST, puis lavez-les avec 1× TBST pendant au moins 5 fois, en changeant la solution toutes les 1 h comme décrit ci-dessus.
  13. Continuez à laver les embryons en changeant 1× TBST toutes les 2 heures, et laissez-les toute la nuit à 4 °C sur un rotateur. Arrêtez de vous laver lorsque la fluorescence non spécifique est presque visible. Notez que, comme les résidus de la réaction de clic peuvent être nocifs pour l’immunocoloration en aval, assurez-vous que les embryons sont bien lavés pendant 1 à 2 jours avant de passer aux étapes suivantes.

4. Immunocoloration des embryons avec des marqueurs subcellulaires (optionnelle)

  1. Pour bloquer les embryons, retirez le 1× TBST du flacon en verre lors de l’étape finale de lavage ci-dessus, puis ajoutez 200 μL de la solution bloqueante (10 % sérum de chèvre/0,2 % BSA/1× TBST). Enveloppez le flacon en verre avec un morceau de papier aluminium pour protéger les embryons de la lumière. Placez la fiole en verre sur un nutator et secouez doucement les embryons pendant au moins 1 heure à température ambiante (ou toute la nuit à 4 °C).
  2. Diluez l’anticorps primaire (par exemple, anticorps anti-H3) à 1:1 000 dans 200 μL de 10 % de sérum de chèvre/1× TBST. Ajoutez l’anticorps dilué dans le flacon en verre et enveloppez le flacon dans un morceau de papier aluminium. Incubez les embryons toute la nuit à 4 °C sur un nutator à faible vitesse.
  3. Retirez soigneusement l’anticorps du flacon en verre. Rincez rapidement les embryons deux fois en ajoutant 2 mL de 1× TBST dans le flacon en verre et en le retirant.
  4. Ajoutez 2 mL de 1× TBST à la fiole en verre, puis enveloppez-la avec un morceau de papier aluminium. Placez le flacon en verre sur un rotateur et faites tourner les embryons à faible vitesse pendant 1 heure. Retirez le liquide dans la fiole en verre après la rotation.
  5. Répétez l’étape ci-dessus au moins 5 fois.
  6. Diluez l’anticorps secondaire (par exemple, anticorps Alex Fluor 488 de lapin) à 1:1 000 dans 200 μL de 10 % de sérum de chèvre/1× TBST. Si une coloration ADN est nécessaire, diluez le colorant d’ADN (par exemple, TO-PRO-3) avec l’anticorps secondaire.
  7. Ajoutez l’anticorps dilué à la fiole en verre et enveloppez-la dans du papier aluminium. Incubez les embryons toute la nuit à 4 °C sur un nutator à faible vitesse.
  8. Retirez soigneusement l’anticorps du flacon en verre. Rincez rapidement les embryons deux fois en ajoutant 2 mL de 1× TBST dans le flacon en verre et en le retirant.
  9. Ajoutez 2 mL de 1× TBST à la fiole en verre, puis enveloppez-la avec un morceau de papier aluminium. Placez le flacon en verre sur un rotateur et faites tourner les embryons à faible vitesse pendant 1 heure.
  10. Répétez l’étape ci-dessus au moins 5 fois.

5. Élimination des embryons avant imagerie confocale

  1. Pour déshydrater les embryons, retirez soigneusement le tampon dans le flacon en verre après le lavage final, puis ajoutez 2 mL de méthanol à 100 %. Enveloppez la fiole en verre dans du papier aluminium, placez-la sur un rotateur, puis laissez les embryons tourner à basse vitesse pendant 5 minutes. Retirez le liquide dans la fiole en verre après la rotation.
  2. Répétez l’étape ci-dessus au moins 5 fois.
  3. Pour déshydrater complètement les embryons, répétez l’étape ci-dessus au moins 5 fois en utilisant 2 mL de méthanol anhydre à 100 %.
  4. Retirez soigneusement autant de méthanol que possible du flacon en verre.
  5. Utilisez une pipette en verre pour ajouter lentement 500 μL du réactif de dégagement BABB dans le flacon en verre. Les embryons flottent dans le BABB et attendent 10 minutes jusqu’à ce que tous se posent au fond du flacon en verre. Notez que les embryons deviendront presque invisibles, et retirez soigneusement la BABB sans endommager les embryons.
  6. Répétez l’étape ci-dessus au moins deux fois de plus, ou jusqu’à ce qu’aucune ligne de schlieren ne soit visible. Pour éliminer complètement les embryons, maintenez-les en BABB pendant 1 à 2 jours avant l’imagerie.
  7. Créer des chambres d’imagerie en découpant un petit carré (par exemple, ~5 mm × 5 mm) de la bande VHB d’une épaisseur de ~ 1,1 à 1,2 mm (similaire à la taille de l’embryon) et d’une taille de ~10 mm × 10 mm, puis en le collant sur un verre de couverture de 24 mm × 40 mm.
  8. Transférez soigneusement les embryons dégagés dans la chambre, puis couvrez-les d’un autre verre de couverture. Les embryons seront à l’intérieur du sandwich de lunettes de couverture afin que les deux côtés puissent être photographiés.
  9. Réalisez des images sous microscope confocal.

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Résultats

Les embryons de Xenopus laevis au stade 1-cellulaire ont été microinjectés avec du 5-EU, et ceux au stade 9 ont été fixés lorsque le ZGA à grande échelle était présent dans tout l’embryon. Les embryons ont été traités selon le protocole décrit ci-dessus. Les ARN naissants dans les embryons ont été marqués avec TAMRA-azide par réaction de clic, l’histone H3 a été marquée à l’aide d’anticorps anti-histone H3, et l’ADN a été marqué avec TO-PRO-3. Les embryons ont été imagés au micr...

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Discussion

ZGA représente l’une des transitions les plus critiques lors des premiers stades du développementembryonnaire 2,3. Nous avons ici décrit des procédures détaillées pour préparer des échantillons afin de visualiser directement le ZGA dans les embryons de Xénonopus précoces montés entiers, incluant la fixation des embryons microinjectés en 5-EU, la conjuguation d’ARN naissants avec un fluorophore via la réaction clic, l’imm...

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Déclarations de divulgation

L’auteur ne déclare aucun intérêt concurrent.

Remerciements

Nous remercions le laboratoire Matthew Good de l’Université de Pennsylvanie pour sa formation. Ce travail a été soutenu en partie par l’Institut national Eunice Kennedy Shriver de la santé infantile et du développement humain (R03HD105802).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
16 % de paraformaldéhyde (PFA)EMS15710-SPour la création de la solution fixative
20 et fois ; SSCMediatechMT46-020-CMPour fabriquer la solution de blanchiment
Mélangeur nutant 3DVWR76595-802Pour la nutation des embryons
Fioles à filetage vissé de 9 mm (2 mL)VWR46610-722Pour le traitement des embryons
Anticorps anti-histone H3Abcamdéc. 1791Pour l’immunocoloration
Acide ascorbiqueSigma-AldrichA7506Pour avoir provoqué la réaction de clic
Alcool benzyliqueSigma-Aldrich305197Pour le dégagement des embryons
Benzoate de benzyleACROS Organics105860010Pour le dégagement des embryons
Albumine sérique bovine (BSA)Sigma-AldrichA3059Pour fabriquer la solution de blocage
Bouchons pour fioles à filetage de 9 mm (2 mL)VWR46610-712Pour le traitement des embryons
Verre de couverture (24 mm et multiplié 40 mm)VWR48393-060Pour fabriquer une chambre d’imagerie
CuSO4Sigma-Aldrich61230Pour avoir provoqué la réaction de clic
Acide éthylénétique (oxyéthylénènitrilo)acide tétraacétique (EGTA)Thermo Fisher ScientificAC409915000Pour la création de la solution fixative
Fiji ImageJNIHPour le traitement de l’imagerie
FormamideThermo Fisher ScientificAC181090010Pour fabriquer la solution de blanchiment
Pipettes à pasteur-verreVWR14673-010Pour transférer le BABB
Anticorps secondaire anti-lapin de chèvre Alex Fluor 488Thermo Fisher ScientificA27034Pour l’immunocoloration
Sérum de chèvreAbcamab7481Pour fabriquer la solution de blocage
Peroxyde d’hydrogèneSigma-AldrichH1009Pour fabriquer la solution de blanchiment
Sulfate de magnésium (MgSO4)Thermo Fisher ScientificM65-500Pour la création de la solution fixative
MéthanolThermo Fisher ScientificA4524Pour déshydrater les embryons
Méthanol, anhydreSigma-Aldrich322415Pour déshydrater les embryons
MOPSThermo Fisher ScientificAC172631000Pour la création de la solution fixative
Mélangeur nutant multimodeVWR76595-812Pour la nutation des embryons
Pipette de transfert en plastiqueThermo Fisher Scientific13-711-9AMPour transférer des embryons
Lame de rasoirThermo Fisher Scientific18-100-970Pour découper des bandes
Eau sans RNaseThermo Fisher ScientificBP561-1Pour créer des solutions sans Rnase
Roto-Mini PLUS (rotateur)VWR470313-912Pour la roation des embryons
Tétraméthylrhodamine (TAMRA)-azideAbcamab146486Pour avoir provoqué la réaction de clic
TO-PRO-3Thermo Fisher ScientificT3605Pour colorer l’ADN
Triton X-100Sigma-Aldrich10789704001Pour fabriquer le tampon de lavage
Base Trizma (Base Tris)Sigma-AldrichT1503Pour fabriquer le tampon Tris
Bandes VHB 3M GPH-110GF (45 mil.)VWR76524-608Pour fabriquer une chambre d’imagerie
Microscope confocal Zeiss LSM 700ZeissPour l’imagerie confocale

Références

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  2. Vastenhouw, N. L., Cao, W. X., Lipshitz, H. D. The maternal-to-zygotic transition revisited. Development. 146 (11), dev161471(2019).
  3. Jukam, D., Shariati, S. A. M., Skotheim, J. M. Zygotic genome activation in vertebrates. Dev Cell. 42 (4), 316-332 (2017).
  4. Palfy, M., Joseph, S. R., Vastenhouw, N. L. The timing of zygotic genome activation. Curr Opin Genet Dev. 43, 53-60 (2017).
  5. Chen, H., Einstein, L. C., Little, S. C., Good, M. C. Spatiotemporal patterning of zygotic genome activation in a model vertebrate embryo. Dev Cell. 49 (6), 852-866.e7 (2019).
  6. Chen, H., Good, M. C. Nascent transcriptome reveals orchestration of zygotic genome activation in early embryogenesis. Curr Biol. 32 (19), 4314-4324.e7 (2022).
  7. Chen, H., Good, M. C. Imaging nascent transcription in whole-mount vertebrate embryos to characterize zygotic genome activation. Methods Enzymol. 638, 139-165 (2020).
  8. Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (41), 15779-15784 (2008).
  9. Chan, S. H., et al. Brd4 and P300 confer transcriptional competency during zygotic genome activation. Dev Cell. 49 (6), 867-881.e8 (2019).
  10. Adar-Levor, S., et al. Cytokinetic abscission is part of the midblastula transition in early zebrafish embryogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (15), e2021210118(2021).
  11. Chen, H. Quantifying nascent transcription in early embryogenesis. Methods Mol Biol. 2923, 143-162 (2025).
  12. Harland, R. M. In situ hybridization: An improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).

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