Un protocole standardisé pour induire la sénescence prématurée induite par le stress chez les mélanocytes humains primaires à l’aide de tert-butyl hydroperoxyde

Résumé

Un protocole standardisé pour induire la sénescence prématurée chez les HNM utilisant tBHP, des protocoles standardisés pour analyser les marqueurs clés de sénescence, notamment l’arrêt de croissance, l’activité SA-β-galactosidase et les facteurs SASP.

Résumé

Les facteurs de stress environnementaux, notamment les rayons UV, la pollution de l’air ou la fumée de cigarette, entraînent le vieillissement extrinsèque de la peau. L’exposition à ces facteurs extrinsèques de vieillissement favorise l’accumulation de cellules sénécentes, ce qui contribue à la formation de rides et de troubles de la pigmentation. Les mélanocytes, qui offrent une protection primaire contre les UV, présentent une activité réduite avec l’âge. Les mélanocytes sénéscents s’accumulent dans la peau vieillie et contribuent à son aspect vieillissant ; Cependant, il existe peu de modèles pour étudier la sénescence des mélanocytes, et ce travail vise à développer un modèle reproductible pour des recherches ultérieures. Dans cette étude, nous présentons un modèle de sénescence des mélanocytes néonatals humains (HNM) utilisant de l’hydroperoxyde de tert-butyle (tBHP), un inducteur de stress oxydatif bien caractérisé. Le tBHP perturbe l’homéostasie redox en épuisant les défenses antioxydantes cellulaires et en favorisant la surproduction radicale, entraînant des dommages à l’ADN et aux protéines. Nous caractérisons le phénotype de sénescence des mélanocytes traités avec tBHP à travers l’analyse des marqueurs de sénescence établis, incluant un potentiel de croissance restreint, des changements morphologiques et l’activité SA-β-Galactosidase. Ce modèle fournit un outil précieux pour étudier la sénescence prématurée induite par le stress chez les mélanocytes, offrant un éclairage sur leur rôle dans le vieillissement extrinsèque de la peau et les troubles de la pigmentation.

Introduction

Le vieillissement cutané se compose de deux facteurs distincts : le vieillissement intrinsèque et le vieillissement^{extrinsèque 1,2}. Le vieillissement intrinsèque est causé par des processus chronologiques naturels et des facteurs génétiques, tandis que le vieillissement extrinsèque résulte d’une exposition cumulative aux facteurs de stress environnementaux, principalement les rayons ultraviolets, mais aussi la pollution de l’air, la fumée de cigarette et les agents chimiques, qui accélèrent le vieillissement au-delà des taux chronologiques^{normaux 3....}

Protocole

Ce protocole a été optimisé pour la recherche sur les mélanocytes néonatals humains primaires (HNM) afin d’étudier les mécanismes de la sénescence prématurée induite par le stress induite par le tBHP (Figure 1). Les mélanocytes proviennent du prépuce caucasien néonatal (phototype à pigmentation claire) et obtenus d’une source commerciale. Selon la documentation du fournisseur, les tissus humains sont prélevés auprès de donneurs pleinement informés et ayant donné leur consentement, conformément aux cadres éthiques et juridiques établis, y compris la Déclaration d’Helsinki et les réglementations applicables....

Résultats

Le traitement par tBHP induit un arrêt de croissance chez les mélanocytes néonatals humains.
Le traitement par tBHP inhibe la prolifération des mélanocytes par rapport aux témoins non traités (n = 3) (Figure 2A). Au jour 9, les cellules traitées n’atteignent que 1,4 cPDL, tandis que les témoins atteignent 3,1 cPDL. Cette divergence augmente avec le temps, les mélanocytes traités approchant un plateau de 1,9 cPDL au jour 15, tandis que les.......

Discussion

Ce protocole établit une approche standardisée pour induire la sénescence prématurée induite par le stress (SIPS) chez les mélanocytes néonatals humains en utilisant le tBHP, offrant un modèle robuste pour étudier la sénescence spécifiquement dans ce type cellulaire. Des changements constants de prolifération, de morphologie, d’activité SA-β-gal, de marqueurs de dommages à l’ADN et de composants SASP soutiennent le phénotype induit. En se concentrant sur les mélanocytes, cellules qui res.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,22 µm filtre à membrane	Merck	SLGVR33RS
1 M acide citrique	Merck	K91567844	préparer dans aq. dest.
1 M MgCl2	Merck	A649033	préparer dans aq. dest.
1 M Na2HPO4	Merck	K56036736	préparer dans aq. dest.
10 M NaOH	Lab Honeywell	30620	préparer dans aq. dest.
37% formaldéhyde	Sigma	252549
4% paraformaldéhyde	CarlRoth	0335.3
5 M Chlorure de sodium	Sigma	S3014	préparer dans aq. dest.
50% glutaraldéhyde	Sigma	G6403
5-Brom-4-Chlor-3-indolyl-β-D-Galactopyranosid (X-Gal)	Sigma	B9146
Anticorps secondaire conjugué à Alexa Fluor 2 mg/mL	Invitrogen	A11008
BSA (albumine sérique bovine)	Sigma	A7030
Substrat chimiluminescent	Sigma	WBKLS0500
Costar CellLifter	Corning	3008
Lamelles pour culture cellulaire/microscopie	Epredia	CB00200RA120MNZ0
DermaLife Medium de base	CellSystems	LM-0004
Kit DermaLife M pour mélanocytes	CellSystems	LS-1041
Tampon phosphate de Dulbecco tamponné	Sigma	D8537
Mélanocytes néonatals humains	CellSystems	FC-0023
Anticorps LaminB1 (lapin)	Abcam	AB16048	Dilution 1:1000 dans 5% BSA
Milieu de montage contenant du DAPI	Abcam	AB104139
Solution de pénicilline-streptomycine	Sigma	P4333
Géis de gradient de polyacrylamide	Bio-Rad	456-8095
Poly-D-Lysine, 0,1 mg/mL	Gibco	A38904-01
Ferricien de potassium	Sigma	P8131
Ferrocyanure de potassium	Sigma	P-9387
Anticorps pRB (lapin)	CellSignalling	93085	Dilution 1:1000 dans 5% BSA
Cocktail d'inhibiteurs de protéase	préparé par nous	N/A	500 mM NaF; 2 µg/ml Aprotinine; 1 mM PMSF; 1 mM Na-Orthovanadate activé
Tampon RIPA	préparé par nous	N/A	contenant: 50 mM Tris-HCl; 1% NP-40; 0,5% Na-désoxycholate; 0,1% SDS; 150 mM NaCl; 2 mM EDTA
Tampon RLT	Qiagen	1015762	Inclus dans le kit RNeasy Mini
Kit RNeasy Mini	Qiagen	74106
Poudre de lait écrémé (pour 5% de lait dans TBS-T)	Sigma	70166
Citrate de sodium (pour une solution à 0,1%)	Sigma	S4641
Inhibiteur de trypsine de soja, 0,5 mg/mL	Thermofisher	17075-029
tert-Butyl hydroperoxyde (tBHP)	Sigma	458139
Triton X-100 (pour une solution à 0,3%)	Sigma	T9284
Solution trypsine-EDTA	Sigma	T3924
β-mercaptoéthanol	CarlRoth	4227.3
Anticorps γH2AX (lapin)	CellSignalling	2577S	Dilution 1:200