Un protocole standardisé pour induire la sénescence prématurée induite par le stress chez les mélanocytes humains primaires à l’aide de tert-butyl hydroperoxyde

Résumé

Un protocole standardisé pour induire la sénescence prématurée chez les HNM utilisant tBHP, des protocoles standardisés pour analyser les marqueurs clés de sénescence, notamment l’arrêt de croissance, l’activité SA-β-galactosidase et les facteurs SASP.

Résumé

Les facteurs de stress environnementaux, notamment les rayons UV, la pollution de l’air ou la fumée de cigarette, entraînent le vieillissement extrinsèque de la peau. L’exposition à ces facteurs extrinsèques de vieillissement favorise l’accumulation de cellules sénécentes, ce qui contribue à la formation de rides et de troubles de la pigmentation. Les mélanocytes, qui offrent une protection primaire contre les UV, présentent une activité réduite avec l’âge. Les mélanocytes sénéscents s’accumulent dans la peau vieillie et contribuent à son aspect vieillissant ; Cependant, il existe peu de modèles pour étudier la sénescence des mélanocytes, et ce travail vise à développer un modèle reproductible pour des recherches ultérieures. Dans cette étude, nous présentons un modèle de sénescence des mélanocytes néonatals humains (HNM) utilisant de l’hydroperoxyde de tert-butyle (tBHP), un inducteur de stress oxydatif bien caractérisé. Le tBHP perturbe l’homéostasie redox en épuisant les défenses antioxydantes cellulaires et en favorisant la surproduction radicale, entraînant des dommages à l’ADN et aux protéines. Nous caractérisons le phénotype de sénescence des mélanocytes traités avec tBHP à travers l’analyse des marqueurs de sénescence établis, incluant un potentiel de croissance restreint, des changements morphologiques et l’activité SA-β-Galactosidase. Ce modèle fournit un outil précieux pour étudier la sénescence prématurée induite par le stress chez les mélanocytes, offrant un éclairage sur leur rôle dans le vieillissement extrinsèque de la peau et les troubles de la pigmentation.

Introduction

Le vieillissement cutané se compose de deux facteurs distincts : le vieillissement intrinsèque et le vieillissement^{extrinsèque 1,2}. Le vieillissement intrinsèque est causé par des processus chronologiques naturels et des facteurs génétiques, tandis que le vieillissement extrinsèque résulte d’une exposition cumulative aux facteurs de stress environnementaux, principalement les rayons ultraviolets, mais aussi la pollution de l’air, la fumée de cigarette et les agents chimiques, qui accélèrent le vieillissement au-delà des taux chronologiques^{normaux 3,4}. Les expositions environnementales génèrent un stress oxydatif qui submerge les défenses antioxydantes cellulaires, entraînant des dommages à l’ADN, l’oxydation des protéines et la peroxydation des lipides. Ces altérations moléculaires déclenchent des réponses persistantes de dommages à l’ADN et des dysfonctions cellulaires, favorisant finalement une sénescence^{prématurée 5,6}. Cette sénescence induite par le stress contribue aux caractéristiques cliniques de la peau vieillie, notamment des rides, une pigmentation inégale, une élasticité réduite et une fonction de barrière^altérée.

Les mélanocytes résident dans l’épiderme basal et servent de principale défense de la peau contre les dommages induits par les UV en synthétisant la mélanine et en la transférant aux kératinocytes environnants. Paradoxalement, ce rôle protecteur les rend particulièrement vulnérables au stress oxydatif et à la sénescence prématurée lors du vieillissement^{extrinsèque 8,9}. Le processus de mélanogenèse lui-même génère d’importantes espèces réactives d’oxygène comme sous-produits des réactions tyrosinase-catalisées, créant une charge oxydative inhérente qui est encore amplifiée par des expositions environnementales telles que les rayons UV et^{la pollution 10,11}. En conséquence, le stress environnemental chronique peut induire des dommages oxydatifs, des dysfonctions mitochondriales, et finalement une sénescence cellulaire¹². Malgré leur importance, des questions clés subsistent concernant les voies moléculaires régissant la sénescence des mélanocytes et la manière dont le stress oxydatif initie ce processus. De plus, l’influence des mélanocytes sénéscents sur le microenvironnement cutané environnant en tant que facteur de modifications cutanées liées à l’âge, notamment par la libération de facteurs SASP, reste insuffisamment^{comprise 13,14}.

Bien que les mélanocytes soient particulièrement sensibles à la sénescence induite par le stress oxydatif, les modèles expérimentaux pour étudier ce processus restent^{limités à 15,16}. La plupart des recherches sur la sénescence continuent de s’appuyer sur des modèles de sénescence réplicatifs ou induits par le stress chez les fibroblastes, mais ces approches ne capturent pas la biologie distincte des mélanocytes ni leur potentiel à influencer le vieillissement cutané par la communication croisée avec les cellules voisines et leur propre profil SASP¹⁷. Cette lacune met en lumière la nécessité de modèles de sénescence spécifiques aux mélanocytes qui reflètent plus fidèlement leurs réponses physiologiques aux facteurs de stress environnementaux^18,19 et leur contribution au vieillissement de la peau humaine.

Malgré la disponibilité des approches de sénescence induite par le stress, leur mise en œuvre dans les mélanocytes humains primaires reste techniquement difficile et est souvent associée à une variabilité importante. Les mélanocytes sont particulièrement sensibles au stress oxydatif, ce qui crée une fenêtre expérimentale étroite entre une induction efficace de la sénescence et une cytotoxicité excessive. De plus, les différences dépendantes du donneur dans les préparations cellulaires primaires contribuent encore à des résultats incohérents entre les études. Ces défis sont souvent sous-déclarés, et les protocoles sont souvent insuffisamment standardisés, limitant la reproductibilité. Le protocole actuel comble cette lacune en fournissant un schéma thérapeutique optimisé et reproductible, un calendrier de dosage défini et des lectures standardisées pour une induction et une évaluation fiables de la sénescence chez les mélanocytes humains primaires.

Le tert-butyl hydroperoxyde (tBHP) est un inducteur bien caractérisé du stress oxydatif qui favorise la sénescence en générant des espèces réactives de l’oxygène et en appauvrissant les défenses antioxydantes cellulaires. Il a été largement utilisé pour induire la sénescence chez les fibroblastes dermiques, où il déclenche des marqueurs de sénescence caractéristiques tout en maintenant la viabilité cellulaire^20,21. Parce que le tBHP produit un stress oxydatif soutenu via des voies biochimiques définies, il offre un système reproductible et accessible pour étudier la sénescence induite par le stress oxydatif et étudier les mécanismes moléculaires reliant les dommages oxydatifs aux processus^{de vieillissement 22,23}. Contrairement aux modèles basés sur les UV, le tBHP est particulièrement avantageux lorsqu’une induction contrôlée et reproductible du stress oxydatif est nécessaire, indépendante des paramètres d’irradiation et sans équipement spécialisé.

Le HNM fournit un modèle pertinent pour étudier les mécanismes extrinsèques du^{vieillissement 24}. En tant que cellules primaires dérivées du prépuce, elles conservent intactes les voies de réponse au stress et évitent les artefacts associés à la modification génétique ou à^{l’immortalisation 25}. Les mélanocytes néonatals fournissent un modèle expérimental optimal car ils présentent des dommages de base minimes, permettant une évaluation claire des voies de sénescence induites par le facteur de stress^{environnemental 26,27}.

Cette étude utilise un stress oxydatif induit par le tBHP dans les mélanocytes néonatals humains primaires, surmontant les limites des modèles cellulaires non mélanocytaires et immortalisés couramment utilisés dans la recherche sur la sénescence. Il offre une plateforme standardisée pour examiner les mécanismes de sénescence spécifiques aux mélanocytes et caractériser le phénotype sénéscent à l’aide de marqueurs établis. Dans l’ensemble, ce protocole fournit un modèle reproductible et physiologiquement pertinent pour étudier la sénescence induite par le stress oxydatif chez les mélanocytes.

Protocole

Ce protocole a été optimisé pour la recherche sur les mélanocytes néonatals humains primaires (HNM) afin d’étudier les mécanismes de la sénescence prématurée induite par le stress induite par le tBHP (Figure 1). Les mélanocytes proviennent du prépuce caucasien néonatal (phototype à pigmentation claire) et obtenus d’une source commerciale. Selon la documentation du fournisseur, les tissus humains sont prélevés auprès de donneurs pleinement informés et ayant donné leur consentement, conformément aux cadres éthiques et juridiques établis, y compris la Déclaration d’Helsinki et les réglementations applicables sur la protection des données. Les cellules étaient fournies sous une forme désidentifiée. Aucune approbation éthique supplémentaire n’a été requise pour leur utilisation dans cette étude. Toutes les expériences ont été réalisées en utilisant la même lignée de mélanocytes afin d’assurer la cohérence. Notez que lors de l’utilisation de différentes lignées cellulaires primaires, les conditions de la culture, ainsi que les concentrations et les procédures de manipulation, peuvent devoir être ajustées davantage.

1. Préparatifs

REMARQUE : Pour initier le traitement par tBHP, les mélanocytes doivent être décongelés au moins trois jours à l’avance pour permettre une récupération et une confluence suffisantes. La phase de traitement dure 4 jours, le jour de semis étant désigné comme Jour 0. Les détails de tous les matériaux utilisés dans cette étude sont donnés dans le tableau des matériaux.

1. Pour préparer le milieu de culture, combinez le milieu basal des mélanocytes avec les facteurs de croissance correspondants. Feu flamber le couvercle de chaque flacon avant d’ajouter son contenu au milieu pour minimiser la contamination. Ajoutez 1 % (v/v) de PenStrep au milieu préparé et conservez-le à 4 °C jusqu’à utilisation.
2. Avant l’ensemencement, préparez la solution inhibitrice de trypsine en diluant l’inhibiteur de trypsine du soja dans le DPBS. Filtrez la solution à travers une membrane de 0,22 μm, une aliquote, et stockez à −20 °C. Une fois décongelé, il peut être utilisé jusqu’à 10 jours.

2. Dégel cellulaire (jour -3)

ATTENTION : Tous les matériaux en contact avec des cellules humaines doivent être considérés comme biologiquement contaminés et éliminés conformément aux directives institutionnelles de biosécurité. Pour évaluer la sénescence, nous utilisons des tests complémentaires qui évaluent l’arrêt de croissance, l’activité SA-β-gal et des marqueurs moléculaires supplémentaires. Ici, nous présentons les protocoles pour ces tests et les résultats attendus lors du travail avec ces indicateurs de sénescence.

1. Pipeter 20 mL de solution tampon phosphate de Dulbecco (qualité culture cellulaire) dans un tube conique de 50 mL à température ambiante. Maintenez la fiole contenant les cellules sur la glace jusqu’à ce qu’elle dégèle.
2. Enflammez le couvercle avant d’ouvrir la fiole contenant les cellules, dévissez, puis flamvez à nouveau les côtés pour éviter une contamination potentielle.
3. Transférez 500 μL de DPBS dans le flacon contenant les cellules. Décongelez doucement les cellules en les pipettant de haut en bas, puis transférez tout le contenu dans le tube.
4. Centrifugez à 100 × g pendant 5 minutes à température ambiante. Le pellet résultant doit paraître beige à brunâtre (ou plus foncé, selon l’origine ethnique du donneur).
5. Préparez une fiole T75 avec 14 mL de milieu mélanocytique.
6. Enflammez une pipette en verre Pasteur (flammez à chaque manipulation des mélanocytes), aspirez soigneusement le DPBS, puis resuspendez la pellete dans 1 mL de substrat.
7. Transférez dans la fiole préparée précédemment.
8. Incubez à 37 °C, 5 % de CO₂, et observez quotidiennement au microscope. Changez de moyen au moins toutes les 48 heures.
   REMARQUE : Chaque fiole cryopréservée contient environ 1 × 10⁶ mélanocytes humains primaires. Toutes les expériences ont été réalisées avec des cellules au passage 9.

3. Ensemencement des cellules (jour 0)

1. Assurez-vous de la confluence de 80 à 90 % des cellules le jour de la mise en semis.
2. Aspirez le substrat de la fiole et lavez deux fois avec du DPBS.
3. Détacher les cellules en ajoutant 2 mL de solution de trypsine-EDTA et en les incubant pendant 5 minutes à 37 °C, 5 % de CO₂.
4. Tapotez doucement la fiole et observez au microscope pour confirmer le décollement complet de la cellule (incubez plus longtemps si nécessaire).
5. Arrêtez la réaction en ajoutant 1,5 fois le volume d’inhibiteur de trypsine (1,5 fois plus grand).
6. Transférez la suspension de la cellule dans un tube conique de 15 mL et diluez avec du DPBS jusqu’à un volume final de 10 mL.
7. Centrifugez la suspension à cellules à 100 × g pendant 5 minutes.
8. Aspirez le surnageant et résuspendez jusqu’au volume désiré dans le milieu.
9. Pour les plaques traitées à tBHP, semez 6 × 10⁵ cellules par plat de 10 cm. Pour les plaques de contrôle, semez 4 × 10⁵ cellules par plaque.
   REMARQUE : Pour les plaques traitées au tBHP, semez une densité cellulaire plus élevée afin de garantir qu’un nombre suffisant de cellules soient disponibles pour les expériences, car leur taux de croissance diminuera progressivement au cours du traitement. Si l’on ensemence des cellules sur des couches pour des expériences de microscopie, les couches doivent être enrobées de 0,1 mg/mL de poly-D-lysine et complètement séchées avant l’ensemencement des cellules.
10. Incubez toute la nuit à 37 °C avec 5 % de CO₂. Changez le média toutes les 48 heures pour les plaques de contrôle.

4. traitement tBHP (jours 1–4)

1. Préparez une solution de travail de 10 mM à partir de stock tBHP (diluée dans un DPBS ou un support).
   REMARQUE : le tBHP est sensible à la lumière : couvrez le contenant en travaillant avec. La solution de travail peut être utilisée jusqu’à une semaine lorsqu’elle est correctement stockée à 4 °C. Planning de traitement : Le jour 1 (le lendemain de l’ensemencement) marque le début de l’exposition au tBHP. Les mélanocytes sont traités deux fois par jour, avec au moins 4 heures d’intervalle entre les applications. Ce traitement est répété du jour 1 au jour 4, pour un total de 4 jours de traitement. La concentration et le schéma de traitement sélectionnés de tBHP ont été adaptés à partir de travaux antérieurs sur les fibroblastes dermiques, où des concentrations plus faibles suffisaient à induire la sénescence. Dans les mélanocytes primaires, cependant, des concentrations plus élevées étaient nécessaires pour atteindre une induction de sénescence robuste, et 100 μM tBHP a été identifié comme optimal sur la base d’expériences de titration équilibrant induction de sénescence et viabilité cellulaire
2. Ajouter 100 μM de tBHP aux cellules pendant 1 h par traitement (Pour commencer, ajouter le volume approprié de solution de travail, en veillant à pipeter dans le milieu liquide).
3. Déplacez la plaque d’avant en arrière et de gauche à droite pour répartir le tBHP uniformément dans le milieu.
   REMARQUE : Évitez les mouvements circulaires car cela peut entraîner une répartition inégale du tBHP dans le milieu.
4. Incubez précisément 1 heure à 37 °C avec 5 % de CO₂.
5. Pour arrêter le traitement à la tBHP, aspirez le milieu.
6. Laver les plaques deux fois avec un DPBS préchauffé (37 °C).
7. Ajoutez le volume approprié de médium frais dans les assiettes.
8. Laissez les cellules récupérer dans l’incubateur pendant au moins 4 heures avant d’initier le traitement suivant.
9. Répétez cette procédure le même jour pour la seconde séance et poursuivez les jours suivants. Maintenir les cellules en culture après la fin du traitement jusqu’au jour 9 pour évaluer les marqueurs de sénescence.
10. Surveillez les plaques de contrôle et le passage en cas de confluent.

5. Analyse de la courbe de croissance

1. Compter les cellules et les contrôles traités à tBHP en suivant le protocole d’ensemencement.
2. Resemez la même densité initiale ou toutes les cellules au cas où vous comptez moins que les 6 × 10^{5 cellules} pour les plaques tBHP.
3. Effectuez des comptages cellulaires les jours 4, 9 et 15 de culture.
4. Calculez la courbe de croissance à l’aide de la formule suivante :
   lg (compte) - log (graine) / 0,301 + cPDL
   Compte : nombre de cellules obtenues à la fin du passage.
   Graine : nombre de cellules initialement placées au début du passage.
   cPDL : niveau cumulatif de doublement de la population repris des passages précédents.

6. Activité SA-β-galactosidase

1. Au jour 9, lavez les cellules deux fois dans le PBS avant de fixer avec 2 % de formaldéhyde et 0,4 % de glutaraldéhyde.
2. Lavez les cellules deux fois avec du PBS.
3. Incuber les cellules fixes avec une solution colorante d’un pH de 6,0 (150 mM de NaCl, 2 mM de MgCl, 5 mM de ferricyanure de potassium, 5 mM de ferrocyanure de potassium, 40 mM d’acide citrique, 12 mM de phosphate de sodium, et 1 mg/mL de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside (X-gal).
4. Après 18 heures d’incubation à 37 °C en l’absence de CO₂, laver les cellules deux fois avec PBS.
5. Image utilisant la microscopie optique.
6. Quantifiez le nombre de cellules colorées en bleu au microscope en comptant le nombre de cellules bleues et en les divisant par le nombre total de cellules dans un champ. Exprimez les résultats en pourcentage de cellules positives.

7. Coloration par immunofluorescence

ATTENTION : Les déchets contenant du formaldéhyde, du glutaraldéhyde et du paraformaldéhyde doivent être manipulés comme déchets chimiques dangereux et éliminés conformément aux réglementations institutionnelles de sécurité.

1. Utilisez des cellules cultivées sur des manteaux pré-enduit de 0,1 mg/mL de poly-D-lysine.
2. Le jour 9, lavez les cellules deux fois, puis fixez avec du paraformodéhyde à 4 % pendant 15 minutes.
3. Lavez les cellules deux fois avec du PBS.
4. Perméabiliser en utilisant 0,3 % de Triton-X et 0,1 % de citrate de sodium dans le PBS.
5. Bloquez avec 1 % de BSA dans PBS-T pendant 30 minutes à température ambiante.
6. Incuber les cellules avec un anticorps primaire γH2AX pour détecter la réponse permanente de dommages à l’ADN pendant la nuit à 4 °C dans une chambre humidifiée.
7. Le lendemain, lavez-vous deux fois avec du PBS.
8. Appliquez un anticorps secondaire pendant 1 h à température ambiante.
9. Colorez les noyaux avec DAPI si désiré.
10. Laver deux fois avec PBS-T, suivi de deux lavages avec PBS et deux fois avec ddH₂O.
11. Montez les gaines et laissez-les sécher complètement avant l’imagerie.
12. Analysez l’intensité moyenne de fluorescence et/ou les foyers γH2AX à l’aide du logiciel ImageJ.

8. Isolation de l’ARN et RT-qPCR

ATTENTION : Le β-mercaptoéthanol est hautement toxique et doit être manipulé dans une hotte à fumée. Les déchets contenant β-mercaptoéthanol doivent être éliminés comme déchets chimiques dangereux.

1. Au jour 9, trypsizinez les cellules à l’aide de 2 mL de trypsine-EDTA.
2. Arrêtez la réaction en appliquant 1,5 fois la quantité d’inhibiteur de trypchine.
3. Transférez la suspension de cellules dans un tube conique de 15 mL et centrifugez à 100 x g pendant 5 minutes.
4. Aspirez soigneusement le surnageant.
5. Des granulés de lyse en les resuspendant dans un tampon RLT de 350 μL contenant 1 % de β-mercaptoéthanol.
6. Isoler l’ARN à l’aide d’un kit de purification d’ARN en colonne.
7. Déterminer la concentration d’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre (260 nm).
8. Pour la synthèse de cDNA, utiliser 1 μg d’ARN pour la transcription inverse dans un volume total de réaction de 10 μL en utilisant un mélange standard de transcription inverse (incluant tampon RT, dNTPs, amorces aléatoires, transcriptase inverse et inhibiteur de RNase) suivi de conditions de cycle thermique selon les instructions du fabricant.
9. Effectuer RT-qPCR pour les facteurs SASP
   REMARQUE : Les facteurs SASP sélectionnés (IL-8, IL-6 et MMP-1) représentent des composantes bien établies du phénotype sécrétaire associé à la sénescence et ont été choisis en fonction de leur pertinence pour la biologie cutanée, y compris la signalisation inflammatoire et le remodelage extracellulaire de la matrice
   IL-6 (Avant-traction : 5' AAGCCAGAGCTGTGTGCAGATGAGTA 3' Rev : 5' TGTCCTGCAGCCACTGGTTC 3')
   IL-8 (Avant-traction : 5' ACCGGAAGGAACCATCCAC 3' Rev : 5' AAACTGCACCTTCACAGAG 3')
   MMP-1 (Avant-roue : 5' CATCGTGTTGCAGCTCATGA 3' Rev : 5' ATGGGCTGGACAGGATTTTG 3')
   GAPDH (Avant-traction : 5' GAGTCAACGGATTTGGTCGT 3' Rev : 5' GATCTCGCTCCTGGAAGATG 3')
10. Analysez l’expression relative d’ARNm en utilisant la méthode ΔΔCt avec normalisation au gène de maintien GAPDH.

9. Isolement des protéines et Western blot

1. Au jour 9, prélève des lysats protéinés.
2. Aspirez le médium et lavez les plaques deux fois avec du DPBS froid.
3. Lyse mécaniquement les cellules à l’aide d’un grattoir cellulaire après avoir ajouté 150 μL de tampon RIPA (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM de NaCl, 1 % NP-40, 0,5 % de désoxycholate de sodium, 0,1 % de SDS et 2 mM d’EDTA) complété avec des inhibiteurs de protéases et transféré dans un tube de 1,5 mL.
4. Effectuez trois cycles de congélation et de décongélation suivis d’une incubation de 30 minutes sur glace.
5. Centrifugez à 9600 x g à 4 °C pendant 10 minutes.
6. Déterminez la concentration en protéines du surnageant à l’aide du test BCA.
7. Séparez des quantités égales (20 μg) de protéines sur des gels de polyacrylamide et transférez dans des membranes PVDF activées.
8. Bloquez les membranes dans le lait écrémé à 5 % dans le TBS-T.
9. Incubez avec les anticorps primaires pRB et LaminB1 pendant la nuit à 4 °C.
10. Le lendemain, lavez les membranes 3 fois avec TBS-T.
11. Incuber dans des anticorps secondaires appropriés conjugués à HRP pendant 1 h à température ambiante.
12. Détecter les protéines par chimiluminescence et effectuer une analyse densitométrique.

Résultats

Le traitement par tBHP induit un arrêt de croissance chez les mélanocytes néonatals humains.
Le traitement par tBHP inhibe la prolifération des mélanocytes par rapport aux témoins non traités (n = 3) (Figure 2A). Au jour 9, les cellules traitées n’atteignent que 1,4 cPDL, tandis que les témoins atteignent 3,1 cPDL. Cette divergence augmente avec le temps, les mélanocytes traités approchant un plateau de 1,9 cPDL au jour 15, tandis que les...

Discussion

Ce protocole établit une approche standardisée pour induire la sénescence prématurée induite par le stress (SIPS) chez les mélanocytes néonatals humains en utilisant le tBHP, offrant un modèle robuste pour étudier la sénescence spécifiquement dans ce type cellulaire. Des changements constants de prolifération, de morphologie, d’activité SA-β-gal, de marqueurs de dommages à l’ADN et de composants SASP soutiennent le phénotype induit. En se concentrant sur les mélanocytes, cellules qui res...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,22 µm filtre à membrane	Merck	SLGVR33RS
1 M acide citrique	Merck	K91567844	préparer dans aq. dest.
1 M MgCl2	Merck	A649033	préparer dans aq. dest.
1 M Na2HPO4	Merck	K56036736	préparer dans aq. dest.
10 M NaOH	Lab Honeywell	30620	préparer dans aq. dest.
37% formaldéhyde	Sigma	252549
4% paraformaldéhyde	CarlRoth	0335.3
5 M Chlorure de sodium	Sigma	S3014	préparer dans aq. dest.
50% glutaraldéhyde	Sigma	G6403
5-Brom-4-Chlor-3-indolyl-β-D-Galactopyranosid (X-Gal)	Sigma	B9146
Anticorps secondaire conjugué à Alexa Fluor 2 mg/mL	Invitrogen	A11008
BSA (albumine sérique bovine)	Sigma	A7030
Substrat chimiluminescent	Sigma	WBKLS0500
Costar CellLifter	Corning	3008
Lamelles pour culture cellulaire/microscopie	Epredia	CB00200RA120MNZ0
DermaLife Medium de base	CellSystems	LM-0004
Kit DermaLife M pour mélanocytes	CellSystems	LS-1041
Tampon phosphate de Dulbecco tamponné	Sigma	D8537
Mélanocytes néonatals humains	CellSystems	FC-0023
Anticorps LaminB1 (lapin)	Abcam	AB16048	Dilution 1:1000 dans 5% BSA
Milieu de montage contenant du DAPI	Abcam	AB104139
Solution de pénicilline-streptomycine	Sigma	P4333
Géis de gradient de polyacrylamide	Bio-Rad	456-8095
Poly-D-Lysine, 0,1 mg/mL	Gibco	A38904-01
Ferricien de potassium	Sigma	P8131
Ferrocyanure de potassium	Sigma	P-9387
Anticorps pRB (lapin)	CellSignalling	93085	Dilution 1:1000 dans 5% BSA
Cocktail d'inhibiteurs de protéase	préparé par nous	N/A	500 mM NaF; 2 µg/ml Aprotinine; 1 mM PMSF; 1 mM Na-Orthovanadate activé
Tampon RIPA	préparé par nous	N/A	contenant: 50 mM Tris-HCl; 1% NP-40; 0,5% Na-désoxycholate; 0,1% SDS; 150 mM NaCl; 2 mM EDTA
Tampon RLT	Qiagen	1015762	Inclus dans le kit RNeasy Mini
Kit RNeasy Mini	Qiagen	74106
Poudre de lait écrémé (pour 5% de lait dans TBS-T)	Sigma	70166
Citrate de sodium (pour une solution à 0,1%)	Sigma	S4641
Inhibiteur de trypsine de soja, 0,5 mg/mL	Thermofisher	17075-029
tert-Butyl hydroperoxyde (tBHP)	Sigma	458139
Triton X-100 (pour une solution à 0,3%)	Sigma	T9284
Solution trypsine-EDTA	Sigma	T3924
β-mercaptoéthanol	CarlRoth	4227.3
Anticorps γH2AX (lapin)	CellSignalling	2577S	Dilution 1:200