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Article de méthode

Établissement d’un modèle murin de mucovisconce rénale par lésió unilatérale ischémie-reperfusion et néphrectomie controlatérale retardée

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DOI :

10.3791/70598

22 mai 2026

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ici, un protocole est présenté pour établir un modèle murin de mucovisconce rénale utilisant une lésion unilatérale de réperfusion ischémique suivie d’une néphrectomie controlatérale retardée. Cette stratégie permet des études longitudinales de la transition AKI-MRC et une évaluation précise de la fonction rénale résiduelle à l’extrémité.

Résumé

La lésion ischémie-rénale par réperfusion (IRI) contribue à l’insuffisance rénale aiguë (AKI) et constitue un facteur majeur de la progression de la maladie rénale chronique (MRC). Un modèle animal reproductible est nécessaire pour faciliter l’évaluation des mécanismes de réparation maladaptative et de fibrose. Ici, un modèle murin standard de mucoviscidosie rénale est établi par une lésion unilatérale de l’ischémie-reperfusion (uIRI) suivie d’une néphrectomie controlatérale (CNx). Cette stratégie assure la survie à long terme de l’animal pendant la progression de la maladie tout en permettant une évaluation précise de la fonction rénale résiduelle du rein blessé au moment de la prélèvement. Les souris mâles C57BL/6 ont été soumises à une ischémie chaude pendant 28 minutes à 37 °C, et un CNx a été réalisé 24 heures avant chaque point de départ de l’étude. Les souris ont été sacrifiées pour des évaluations histologiques et immunohistochimiques aux moments suivants : 2 jours, 5 jours, 1 semaine, 2 semaines, 3 semaines et 4 semaines après l’IRI. Aux jours 2 et 5 postopératoires, les reins présentaient principalement une nécrose tubulaire, en particulier à la jonction corticodéullaire, sans signe de mucoviscidose. À partir d’une semaine après l’opération, ces caractéristiques pathologiques ont été remplacées par une infiltration cellulaire inflammatoire et une atrophie tubulaire précoce ; La fibrose interstitielle est également apparue et a atteint son apogée de gravité dès la deuxième semaine. Au cours des troisième et quatrième semaines après l’opération, les reins ont montré une atrophie tubulaire généralisée compatible avec une atrophie liée à l’inutilisation. Notamment, la fibrose interstitielle a été réduite par rapport à la deuxième semaine, indiquant une progression vers la phase de cicatrices hypocellulaires et quiescentes. Ce modèle reproduit efficacement les scénarios cliniques de la transition de l’AKI vers la MRC et offre une plateforme fiable pour explorer les mécanismes fibrotiques et le dépistage des interventions thérapeutiques.

Introduction

La lésion ischémie-rénale par réperfusion (IRI) est l’un des facteurs critiques conduisant à une insuffisance rénale aiguë (AK) en milieuclinique 1. Les étiologies courantes incluent la transplantation rénale (impliquant une ischémie froide et chaude suivie d’une réperfusion du rein donneur), les chirurgies cardiovasculaires ou rénales nécessitant une occlusion vasculaire temporaire, et les états d’hypoperfusion systémique causés par un traumatisme sévère, une hémorragie majeure ou unesepticémie de type 2.

La physiopathologie de l’IRI implique un processus biphasique complexe. Au départ, pendant la phase ischémique, l’interruption de l’apport en oxygène et en nutriments entraîne un trouble métabolique, une déplétion de l’ATP et une perturbation du cytosquelette dans les cellules épithéliales tubulaires rénales (TECs)3. Par la suite, la restauration du flux sanguin pendant la reperfusion, bien que nécessaire pour sauver le tissu ischémique, déclenche une « insulte secondaire » plus complexe. 4 Cette phase de la lésion est provoquée par une cascade d’événements, incluant le stress oxydatif dû à l’explosion d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), un dysfonctionnement endothélial, une infiltration massive des cellules inflammatoires (telles que les neutrophiles et macrophages), et l’activation du système ducomplément 3. Ces cascades complexes aggravent collectivement l’apoptose et la nécrose des TEC, constituant la principale présentation pathologique de l’AKI.

Notamment, l’IRI ne se limite pas aux dommages aigus et réversibles. Des preuves substantielles indiquent que la réparation incomplète ou inadaptée après une IRI rénale est un mécanisme central à l’origine de la transition vers une pathologie chronique à long terme. Dans des conditions physiologiques, le rein initie un programme de réparation après l’AKI, qui élimine efficacement les cellules endommagées et favorise la prolifération et la différenciation des TEC survivants afin de restaurer la structure et la fonction des tubules endommagés. Cependant, après une insulte IRI sévère ou répétée, ce processus de réparation peut devenir déréglé, conduisant finalement à une atrophie tubulaire, à une mucoviscoasă interstitielle rénale, et à l’accélération du développement et de la progression de la maladie rénale chronique (MRC)5,6.

Par conséquent, l’élucidation des mécanismes de transition de l’AKI vers la MRC et le développement d’interventions thérapeutiques sont des besoins urgents. Les modèles de rongeurs, en particulier les modèles murins, sont devenus essentiels et indispensables in vivo. Outils pour étudier la fibrose post-IRI en raison de leurs bases génétiques bien définies et de leur similarité avec la progression humaine de la maladie. Cependant, une hétérogénéité significative existe dans les méthodologies actuelles de l’IRI (par exemple, durée de l’ischémie, contrôle de la température, lésions unilatérales vs bilatérales), ce qui conduit à une faible reproductibilité et à une comparabilité inter-étudeslimitée 7.

Pour relever ces défis, la présente étude détaille un protocole standardisé pour un modèle modifié de lésions unilatérales ischémie-réperfusion (uIRI). De plus, ce protocole inclut une néphrectomie controlatérale (CNx) réalisée 24 heures avant la fin de l’étude. Cette stratégie permet de contourner la forte mortalité associée à l’ischémie bilatérale tout en permettant une évaluation précise de la fonction rénale résiduelle et de la progression fibreuse dans le rein blessé. Ce modèle récapitule fidèlement la transition dynamique de l’AKI vers la MRC, offrant une plateforme robuste in vivo. Plateforme pour l’exploration mécaniste et le dépistage thérapeutique.

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Protocole

Toutes les expériences animales ont été menées conformément au Règlement d’administration des affaires relatives aux animaux expérimentaux. Le protocole expérimental a été approuvé par le Comité de soins et d’utilisation des animaux institutionnels (IACUC) de Guangzhou Jennio Biotech Co., Ltd. (Approbation n° JENNIO-IACUC-2025-A053). Toutes les procédures ont été réalisées en stricte conformité avec le Guide for the Care and Use of Laboratory Animals et les directives institutionnelles, en respectant pleinement les principes des 3R. La chronologie de l’étude, incluant les points de sacrifice et la collecte d’échantillons, est résumée à la Figure 1.

1. Préparation des animaux et des instruments

  1. Utilisez des souris mâles C57BL/6 (8 semaines, pesant 20 à 25 g) hébergées dans des installations spécifiques sans agents pathogènes (SPF) pour l’étude.
  2. Divisez les souris au hasard en groupe uIRI et groupe Sham. Pour chacun des six points temporels désignés (2 jours, 5 jours, 1 semaine, 2 semaines, 3 semaines et 4 semaines), allouez n = 4 souris par groupe.
    REMARQUE : Les souris étaient maintenues sur un cycle de 12 heures de lumière et d’obscurité de 12 heures, avec un accès libre à la nourriture et à l’eau. Ils ont été acclimatés à l’environnement de laboratoire pendant au moins une semaine avant l’expérimentation.
  3. Stérilisez tous les instruments chirurgicaux via .Autoclaving à vapeur haute pression avant utilisation.
  4. Maintenir la température corporelle centrale strictement à 37,0 °C ± 0,5 °C grâce à un système de surveillance homéothermique équipé d’une sonde rectale pour une surveillance continue de la température. Insérez la sonde lubrifiée dans le rectum immédiatement après l’induction de l’anesthésie et maintenez-la en place tout au long de l’intervention.
  5. Anesthésier les souris à l’aide d’un système d’anesthésie gazeuse pour petits animaux avec de l’isoflurane (5 % pour l’induction, 1,5 % pour l’entretien, avec un débit d’oxygène de 1,0 L/ min via un vaporisateur calibré).
    REMARQUE : Confirmez l’anesthésie profonde en l’absence de réflexe de retrait des pédales. Toutes les interventions chirurgicales ne doivent être réalisées qu’après que la souris a atteint un état d’anesthésie profonde.
  6. Raser la fourrure sur la zone dorsale gauche du flanc.

2. Intervention chirurgicale

  1. Modèle uIRI (Jour 0)
    1. Placez la souris dans le décubitus latéral droit pour exposer le flanc gauche.
    2. Réaliser une incision longitudinale cutanée de 1 cm à 1,5 cm sur le dos gauche, suivie d’une incision musculaire pour pénétrer dans l’espace rétropéritonéal.
    3. Poussez doucement le rein gauche à l’aide d’un coton tige-tige stérile humidifié au sérum physiologique.
      REMARQUE : Le rein ne doit être déplacé qu’en manipulant le coussinet graisseux péri-rénal ou à l’aide de cotons-tiges stériles. Les pinces ne doivent jamais toucher la surface rénale.
    4. Disséquez soigneusement le pédicule rénal à l’aide de pinces à pointe fine pour isoler l’artère et la veine rénales du tissu conjonctif environnant.
    5. Pincez le pédicule rénal gauche à l’aide d’un micro-clip vasculaire non traumatique pour induire l’ischémie.
      REMARQUE : La dissection du pédicule rénal doit être réalisée de manière propre et complète. La procédure doit explicitement exclure l’uretère de l’application de la pince. Un clampage urétéral involontaire induirait une lésion hybride IRI/obstruction utérale unilatérale (UUO), introduisant potentiellement un composant obstructif permanent.
    6. Commencez un minuteur dès le serrage. La durée de l’ischémie est strictement fixée à 28 minutes.
    7. Vérifiez visuellement l’ischémie : la couleur du rein devrait passer d’un rouge vif à un violet foncé en quelques secondes.
    8. Couvrez le rein d’une gaze stérile imbibée de solution physiologique tiède.
    9. Après 28 minutes, retirez la pince pour initier la réperfusion.
    10. Confirmez visuellement la reperfusion : la couleur des reins devrait revenir au rose/rouge en quelques minutes.
    11. Ramenez doucement le rein dans la cavité abdominale.
    12. Fermez la couche musculaire avec des points absorbables 5-0 et l’incision cutanée avec des points nylon 5-0.
  2. Opération simulée (jour 0)
    1. Effectuez les mêmes étapes d’anesthésie, d’incision et d’extériorisation rénale comme décrites à l’étape 2.1.
    2. Disséquez le pédicule rénal mais ne pincez pas les vaisseaux.
    3. Gardez le rein extériorisé pendant la même durée (28 minutes) avant de le ramener dans la cavité abdominale et de refermer l’incision.
  3. Chirurgie CNx
    REMARQUE : Effectuer le CNx 24 heures avant le point de prélèvement programmé pour chaque groupe spécifique afin d’évaluer la fonction résiduelle du rein blessé.
    Pour le groupe de 2 jours : Effectuez le CNx le premier jour post-IRI.
    Pour le groupe de 5 jours : Effectuez CNx au 4e jour post-IRI.
    Pour le groupe d’une semaine : Effectuez le CNx au 6e jour post-IRI.
    Pour le groupe de 2 semaines : Effectuez CNx au jour 13 après IRI.
    Pour le groupe de 3 semaines : Effectuez le CNx au jour 20 après IRI.
    Pour le groupe de 4 semaines : Effectuez le CNx au jour 27 après l’IRI.
    1. Anesthésiez la souris comme décrit à l’étape 1.5. Ensuite, rasez et désinfectez le flanc dorsal droit.
    2. Fais une petite incision sur le flanc du côté droit pour exposer le rein droit.
    3. Externaliser le rein droit et disséquer doucement le pédicule rénal.
    4. Ligavez fermement le pédicule rénal (artère, veine et uretère) à l’aide d’une suture de soie 4-0 non absorbable.
    5. Retirez le rein droit distal de la ligature.
      REMARQUE : Assurez-vous qu’il n’y a pas de saignement actif provenant du moignon.
    6. Ramenez le moignon pédiculaire dans la cavité abdominale et refermez l’incision comme décrit à l’étape 2.1.12.
    7. Laissez la souris récupérer sur un coussin chauffant.

3. Soins postopératoires et surveillance

  1. Gardez les souris sur la bouillotte jusqu’à ce qu’elles retrouvent pleinement conscience et mobilité.
  2. Ramenez les souris dans des cages propres avec de la nourriture et de l’eau facilement accessibles.
  3. Surveillez quotidiennement l’état de santé des souris.
    1. Vérifiez la mortalité quotidiennement.
    2. Surveillez les changements de toilettage, les signes de détresse ou de douleur, et la posture.
    3. Inspectez les incisions pour détecter des signes d’infection, d’inflammation ou de déhiscence.

4. Évaluations postopératoires

  1. Collecte d’échantillons
    REMARQUE : Les souris ont été sacrifiées à des moments déterminés : 2 jours, 5 jours, 1 semaine, 2 semaines, 3 semaines et 4 semaines après l’IRI afin d’évaluer l’évolution de la blessure et de la fibrose.
    1. Anesthésiez les souris avec 3 % d’isoflurane.
    2. Prélever des échantillons de sang pour une analyse biochimique sérique (si nécessaire).
    3. Euthanasiez les souris par luxation cervicale.
    4. Prélève rapidement le rein gauche (blessé).
    5. Sécuriser le tissu rénal : fixer une portion dans du paraformoldéhyde commercial à 4 % pour une analyse histologique, puis congeler le tissu restant dans de l’azote liquide et conserver à -80 °C pour l’analyse moléculaire.
  2. Traitement et coupe tissulaires
    1. Déshydrater, clarifier et incruster les tissus fixés dans la cire de paraffine, en suivant strictement le protocole de traitement tissulaire décrit par Feldman etWolfe 8.
    2. Coupez les blocs de paraffine à une épaisseur de 4 μm à l’aide d’un microtome rotatif.
    3. Montez les sections de tissu sur des lames en verre et laissez-les cuire à 60 °C pendant 2 heures pour garantir l’adhérence des tissus.
  3. Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E)
    1. Déparaffinez les lames tissulaires dans le xylène et réhydratez-les à travers une série descendante d’éthanol gradué vers de l’eau distillée.
    2. Effectuer une coloration H&E pour évaluer les dommages morphologiques. Exécutez les étapes de teinture et de lavage exactement comme détaillé dans le protocole standardisé de Feldman etWolfe 8.
    3. Déshydratez, dégagez et dégagez les lames teintées à l’aide d’un support de montage résineux.
  4. Coloration trichrome de Masson
    1. Déparaffinez et réhydratez les sections tissulaires en eau distillée.
    2. Appliquez séquentiellement les colorants mordents, nucléaires, cytoplasmiques et collagène pour évaluer le dépôt de collagène et la mucoviscidose. Suivez les temps exacts d’incubation des réactifs et les étapes de lavage définies par Islam etKumar 9.
    3. Rincez, déshydratez, nettoyez et dégagez les lames pour une évaluation microscopique.
  5. Immunohistochimie (IHC)
    1. Déparaffinez et réhydratez les sections tissulaires.
    2. Effectuer la récupération d’épitopes induite par la chaleur à l’aide d’un tampon de citrate de sodium de 10 mM contenant 0,05 % de Tween-20 (pH 6,0) tel que décrit par Magaki et al.10.
    3. Bloquer l’activité endogène de la peroxydase en incubant les sections dans du peroxyde d’hydrogène à 3 %.
    4. Bloquez les sites de liaison non spécifiques avec de l’albumine sérique bovine à 5 % dans du PBS pendant 30 minutes à température ambiante.
    5. Incubez les sections avec l’anticorps principal anti-alpha-muscle lisse actine (α-SMA) (dilution 1:400) pendant la nuit à 4 °C.
    6. Lavez les lames et faites éclore avec l’anticorps secondaire pendant 1 h à température ambiante.
    7. Visualisez l’antigène cible à l’aide de la DAB et contre-colorez avec de l’hématoxyline, en suivant les étapes procédurales fournies par Magaki et al.10.
    8. Déshydratez, nettoyez et dégagez les lames pour l’imagerie finale.

5. Analyse statistique

  1. Présentez toutes les données quantitatives en moyenne ± écart-type (DE).
    REMARQUE : Les analyses statistiques et la génération de graphes ont été réalisées à l’aide du logiciel GraphPad Prism version 10.0. Les différences entre plusieurs groupes par rapport à un seul groupe témoin (Sham) ont été analysées à l’aide d’une analyse unidirectionnelle ordinaire de la variance (ANOVA), suivie du test de comparaison multiple de Dunnett. Une valeur P de < 0,05 était considérée comme statistiquement significative (*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P. < 0,0001). N’indique pas de différence significative.

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Résultats

Pendant toute la période expérimentale, le taux global de survie était de 100 % pour le groupe Sham et le groupe uIRI (n = 4 par moment). Aucune mortalité n’a été observée ni lors de la chirurgie uIRI initiale ni lors de la procédure CNx retardée qui a suivi. Ce résultat confirme le profil de sécurité élevé et la fiabilité de ce protocole à deux étapes par rapport aux modèles bilatéraux d’ischémie, qui souffrent généralement d’une mortalité induite par l’urémie significative.

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Discussion

La présente étude décrit un protocole standardisé pour établir un modèle murin de mucoviscidose interstitielle rénale utilisant uIRI, suivi d’un CNx réalisé 24 heures avant la fin de l’étude. Le dépistage histopathologique dynamique a révélé des phases pathologiques distinctes : nécrose tubulaire aiguë caractérisée par un pic d’incidence entre les jours 2 et 5, suivie d’une fibrogenèse active et d’activation des myofibroblastes culminant à 1 à 2 semaines, et notablement, vers les semaine...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.

Remerciements

Cette étude a été soutenue par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82373042), l’équipe conjointe d’innovation pour la recherche clinique et fondamentale (202409), et la Fondation des sciences naturelles de la province du Shandong (ZR2022QH291, ZR2025MS1199).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Anticorps anti-&alpha ;-SMAProteintech14395-1-APAnticorps primaire utilisé dans l’IHC pour détecter l’expression de l’AMS alpha et évaluer l’activation des myofibroblastes
Kit de test d’azote d’urée sanguine (BUN)Institut de recherche en biotechnologie Jiancheng de Nankin Co., Ltd.C013-2-1Utilisé pour quantifier les niveaux de BUN sérique afin d’évaluer la fonction rénale résiduelle
Kit de test de créatinine (CRE)Institut de recherche en biotechnologie Jiancheng de Nankin Co., Ltd.C011-2-1Utilisé pour quantifier les niveaux de créatinine sérique afin d’évaluer la fonction rénale résiduelle
Système d’anesthésie gazeuseNankin Calvin Biotechnology Co., Ltd.KW-MZJ-4Équipé d’isoflurane pour l’anesthésie générale
Logiciel GraphPad PrismGraphPad Software, Inc.N/AUtilisé pour l’analyse statistique et la représentation graphique des données (https://www.graphpad.com)
Système de surveillance homéothermiqueScience de la conduiteCS-HS-0001Équipé d’une sonde rectale pour une surveillance et une régulation continues et en boucle fermée de la température corporelle centrale
Logiciel ImageJInstituts nationaux de la santéN/ALogiciel open source utilisé pour la quantification morphométrique des zones fibrotiques et du signal IHC
IsofluraneRWD Life Science Co., Ltd  ;R510-22Agent anesthésique inhalant utilisé lors des interventions chirurgicales
Masson' s Kit de coloration trichromeBeyotimeC0189MPour quantifier le dépôt de collagène
Micro-clip vasculaire non traumatiqueROBOZ SURGICAL INSTRUMENT CO.RS-5481TUtilisé pour pincer le pédicule rénal pendant 28 minutes
Paraformoldéhyde (4 %)Beyotime Biotech IncP0099-100mlUtilisé pour la fixation rapide d’échantillons de tissu rénal prélevés
Tampon au citrate de sodium (10 mM, pH 6,0)Thermo Fisher Scientific Inc.  ;005000Utilisé pour la récupération d’épitopes induite par la chaleur avant la coloration immunohistochimique
Microscope chirurgical stéréotaxiqueBeijing Zhongtian Guangzheng Technology Co., Ltd.TS-39NKUtilisé pour la chirurgie IRI

Références

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