Article de méthode

Manipulation physique pour générer des embryons miniatures Xenopus

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DOI :

10.3791/70602

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10 avril 2026

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1Department of Biological Sciences, University of South Carolina

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons une méthode de constriction physique pour produire des mini-embryons à partir d’embryons à 1 cellule de Xenopus laevis .

Résumé

Une caractéristique déterminante de l’embryogenèse précoce est la diminution rapide et exponentielle de la taille des cellules individuelles tandis que le volume global de l’embryon reste constant. Le rapport nucléocytoplasmique (N :C) joue un rôle crucial dans la régulation des activités cellulaires et moléculaires essentielles à l’embryogenèse précoce. La manipulation physique de la taille de l’embryon représente donc un moyen important d’étudier ces mécanismes de développement. La grande taille (~ 1,2 mm de diamètre) et la grande plasticité développementale des embryons précoces de Xenopus laevis en font un modèle idéal pour la dissection physique et la manipulation afin d’interroger les mécanismes régulateurs du développement. Ici, nous décrivons une approche pour générer des mini-embryons avec un volume cytoplasmatique modifié et un rapport N :C en constrictant des embryons de Xenopus laevis à 1 cellule avec des nœuds de poils. Il a été démontré que les mini-embryons résultants initient une activation précoce du génome zygotique (ZGA) induite directement par la réduction de la taille cellulaire et la croissance du rapport N :C. Ces mini-embryons, qui peuvent être généralisés à d’autres systèmes embryonnaires, offrent donc un outil unique et puissant pour disséquer les mécanismes médiés par la taille du développement embryonnaire précoce.

Introduction

L’une des caractéristiques les plus marquantes de l’embryogenèse précoce est la réduction exponentielle de la taille cellulaire individuelle au sein d’un embryon qui maintient un volume constant. La synthèse rapide de l’ADN et la réduction de la taille cellulaire entraînent une augmentation du ratio nucléocytoplasmique (rapport N :C), qui joue un rôle important dans la régulation de plusieurs activités emblématiques de la transition médiane blastule (MBT) dans les systèmes embryonnaires modèles, notamment la transcription du gène zygotique, l’allongement du cycle cellulaire et la motilitécellulaire 1,2,3,4 . Les manipulations du rapport N :C par modification de la ploïdie de l’ADN soutiennent son importance fonctionnelle dans l’embryogenèse précoce à travers plusieurs systèmesmodèles 3,4,5,6.

La manipulation physique de la taille embryonnaire représente une technique importante pour étudier les mécanismes régulateurs du développement embryonnaireprécoce 7. L’ablation cytoplasmique par aspiration, qui modifie le rapport N :C chez les embryons précoces de souris, induit une compactationprématurée 8. De plus, la réduction de la taille des embryons de poisson-zèbre par la coupe a révélé un nouveau mécanisme basé sur le gradient de l’échellesomite 9. De plus, la réduction du volume cytoplasmique chez les embryons de Xenopus a révélé une dynamique du cycle cellulaire dépendante du rapport N :C 10. Il est important de noter qu’en générant des mini-embryons de Xénonopus par réduction de la taille cellulaire et en marquant des transcripts naissants avec de la 5-éthynyl-uridine (5-EU) dans des cellules uniques, nous avons démontré que la réduction de la taille cellulaire induit l’activation zygotique du génome (ZGA) de manière dépendantde la dose 11. Ces résultats soutiennent le rôle crucial de la taille cellulaire dans l’embryogenèse précoce.

Ici, nous décrivons une procédure détaillée pour générer des mini-embryons de Xenopus laevis par manipulation physique à l’aide de nœuds de cheveux (Figure 1)10,11. Cette approche s’appuie sur l’utilisation fondamentale de la constriction en boucle capillaire par Newport et Kirschner (1982) sur les premiers embryons de Xenopus 1, fournissant un protocole clair et fiable pour générer des mini-embryons comme outils expérimentaux. De plus, cette méthode est applicable à d’autres systèmesembryonnaires7, ce qui faciliterait la découverte de nouveaux mécanismes d’embryogenèse précoce.

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Protocole

Les travaux sur les animaux décrits ici ont été approuvés par le Comité de soins et d’utilisation des animaux institutionnels (IACUC) de l’Université de Caroline du Sud.

1. Préparation des matériaux

  1. Préparation de solutions
    1. Préparez 20× MMR en mélangeant 100 mM HEPES, 2 mM EDTA, 2 M NaCl, 40 mM KCl, 20 mMMgCl 2 et 40 mMCaCl 2. Ajustez le pH à 7,8 avec NaOH. Autoclave et stockage à température ambiante.
    2. Préparez une solution de milieu à gradient de densité à 3 % (p/vol) en mélangeant 1,5 g de milieu à gradient de densité dans 50 mL de 0,5× MMR. Remuez doucement avec une barre magnétique jusqu’à ce que le polymère soit dissous. Gardez à 4 °C jusqu’à utilisation.
    3. Préparez un gel d’agarose à 1 % dans une boîte de Petri de 60 mm en mélangeant 0,5 g d’agarose dans 50 mL de MMR à 0,1×. Chauffez avec un four micro-ondes pour dissoudre l’agarose, puis ajoutez 5 mL d’agarose pour enrober le fond d’une boîte de Petri de 60 mm d’une fine couche.
  2. Préparation des nœuds capillaires pour contracter les embryons
    1. Prends des mèches fines et coupe-les en morceaux de ~5 cm.
    2. Utilisez une pince à épiler pour insérer une extrémité du cheveu dans une pointe P10 d’environ ~1 cm de profondeur.
    3. Mettez de la cire sur une cuillère et chauffez-la pour faire fondre la cire. Trempez rapidement la pointe P10 fixée aux cheveux dans la cire, puis laissez-la sécher 1 minute. Assurez-vous que les cheveux sont fixés à l’extrémité de la pointe P10.
    4. Utilisez une pince à épiler pour faire soigneusement un nœud en dessus des cheveux. Ajustez la taille de la boucle à ~1,5 mm. Taillez le surplomb si besoin. Mettez le nœud de côté pour un usage futur.
    5. Répétez les étapes ci-dessus pour faire plus de nœuds capillaires selon les besoins.

2. Fabrication de mini-embryons Xenopus

  1. Pour obtenir des embryons de Xénopus , suivez un protocole standard pour réaliser la fécondation in vitro (FIV) (par exemple, voir Sive et al., 2007)12. L’embryon devrait être à 0,1× MMR, prêt à être utilisé.
  2. Pour visualiser la ZGA dans des cellules uniques d’embryons précoces et étudier leurs mécanismes régulateurs, microinjectez les embryons du stade 1-cellulaire avec de la 5-éthynyl-uridine (5-EU) afin de marquer métaboliquement les transcritsnaissants 11,13 avant de procéder aux procédures suivantes.
  3. Lorsque les embryons sont à ~1 heure après la fécondation (hpf), utilisez une pipette de transfert plastique pour transférer ~20 embryons dans une boîte de Petri de 60 mm (recouverte d’un gel d’agarose à 1 %) contenant ~15 mL de milieu à gradient de densité à 3 % / 0,5 × MMR.
  4. Utilisez une pince à épiler dans une main pour faire tourner un embryon d’environ ~45 à 60 degrés sous un stéréomicroscope afin d’accéder au pôle végétal (l’hémisphère pâle). Tenez l’embryon incliné avec la pince à épiler et utilisez une aiguille de 30 g de l’autre main pour percer délicatement le poteau végétal. Libérez un peu de cytoplasme en pressant doucement l’embryon.
  5. Couvrez soigneusement un nœud de cheveux monté en une pointe P10 sur un embryon afin que le pôle animal (l’hémisphère sombre) soit à l’intérieur du nœud de cheveux. Ajustez la position du nœud en fonction de la taille désirée du mini embryon.
  6. Tenez la pipette P10 d’une main et utilisez une pince à épiler de l’autre main pour tirer les deux extrémités du nœud dans des directions opposées. Le nœud de poils se resserre autour de l’embryon, entre le pôle animal (intact) et le pôle végétal (avec le cytoplasme libéré). Coupez le nœud à cheveux à l’endroit où il s’attache à la pointe P10.
  7. Répétez les étapes 2,4 à 2,6 ci-dessus pour obtenir la quantité désirée de mini-embryons.
  8. Laissez les embryons rester dans un milieu de gradient de densité de 3 % / MMR de 0,5× pendant ~1 à 2 heures. Ensuite, retirez le milieu avec une pipette P1000 sans perturber les embryons et reconstituez avec 15 mL de 0,1× MMR.
  9. Laissez les embryons évoluer jusqu’aux stades souhaités, puis utilisez une pince à épiler pour défaire soigneusement les nœuds des mini-embryons.
  10. Collecter les embryons pour l’analyse souhaitée, par exemple en visualisant le ZGA dans des cellulesindividuelles 11,13.

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Résultats

Les embryons de Xenopus laevis au stade 1-cellulaire étaient constricts avec les nœuds capillaires décrits ci-dessus. Les embryons témoins et mini-embryons au ~stade 9 (8,5 hpf à 23 °C) ont été imagés au stéréomicroscope. Comme montré à la Figure 2, le volume de certains mini-embryons est ~1/3 de celui des embryons témoins. Ce résultat suggère que les premiers embryons de Xenopus peuvent être manipulés pour générer des mini-embryons, fourni...

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Discussion

Ici, nous décrivons une méthode pour générer des mini-embryons chez Xenopus en resserrant physiquement les embryons de stade 1 avec des nœuds de cheveux. Cette approche fournit des preuves directes que la réduction de la taille cellulaire induit la ZGA chez un embryonmodèle 11.

Plusieurs aspects de ce protocole sont essentiels pour générer avec succès des mini-embryons. Pour faire des nœuds capillaires, il est important d’utili...

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Déclarations de divulgation

L’auteur ne déclare aucun intérêt concurrent.

Remerciements

Nous remercions le laboratoire Matthew Good de l’Université de Pennsylvanie pour sa formation. Ce travail a été soutenu en partie par l’Institut national Eunice Kennedy Shriver de la santé infantile et du développement humain (R03HD105802).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Aiguille 30-GBD Médecine305128Pour la perforation des embryons
Plaques de Petri jetables de 60 mmVWR25384-092Pour incuber des embryons
Stereoscopes à zoom ACCU-SCOPE 3075VWR470351-130Pour visualiser les embryons
AgaroseSigma-AldrichA-9414Pour revêtements de boîtes de Petri
Pince à épiler Dumont, Style 5Sciences de la microscopie électronique72701-DPour ajuster et conserver des embryons
Ficoll 400Sigma-AldrichGE17-0300-10Pour incuber des embryons
Pointe de pipette TipOne, 10 & micro ; LUSA Scientific1111-3700Pour monter les nœuds à cheveux
Bloc de cire, noirCarolina Biological Supply Co.974228Pour monter les nœuds à cheveux

Références

  1. Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: I. Characterization and timing of cellular changes at the midblastula stage. Cell. 30 (3), 675-686 (1982).
  2. Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: II. Control of the onset of transcription. Cell. 30 (3), 687-696 (1982).
  3. Kane, D. A., Kimmel, C. B. The zebrafish midblastula transition. Development. 119 (2), 447-456 (1993).
  4. Lu, X., Li, J. M., Elemento, O., Tavazoie, S., Wieschaus, E. F. Coupling of zygotic transcription to mitotic control at the Drosophila mid-blastula transition. Development. 136 (12), 2101-2110 (2009).
  5. Jevtic, P., Levy, D. L. Both nuclear size and DNA amount contribute to midblastula transition timing in Xenopus laevis. Sci Rep. 7 (1), 7908(2017).
  6. Edgar, B. A., Kiehle, C. P., Schubiger, G. Cell cycle control by the nucleo-cytoplasmic ratio in early Drosophila development. Cell. 44 (2), 365-372 (1986).
  7. Chen, H., Qian, W., Good, M. C. Integrating cellular dimensions with cell differentiation during early development. Curr Opin Cell Biol. 67, 109-117 (2020).
  8. Lee, D. R., Lee, J. E., Yoon, H. S., Roh, S. I., Kim, M. K. Compaction in preimplantation mouse embryos is regulated by a cytoplasmic regulatory factor that alters between 1- and 2-cell stages in a concentration-dependent manner. J Exp Zool. 290 (1), 61-71 (2001).
  9. Ishimatsu, K., et al. Size-reduced embryos reveal a gradient scaling-based mechanism for zebrafish somite formation. Development. 145 (11), dev161257(2018).
  10. Clute, P., Masui, Y. Regulation of the appearance of division asynchrony and microtubule-dependent chromosome cycles in Xenopus laevis embryos. Dev Biol. 171 (2), 273-285 (1995).
  11. Chen, H., Einstein, L. C., Little, S. C., Good, M. C. Spatiotemporal patterning of zygotic genome activation in a model vertebrate embryo. Dev Cell. 49 (6), 852-866.e7 (2019).
  12. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Xenopus laevis in vitro fertilization and natural mating methods. CSH Protoc. 2007, pdb prot4737(2007).
  13. Chen, H., Good, M. C. Imaging nascent transcription in wholemount vertebrate embryos to characterize zygotic genome activation. Methods Enzymol. 638, 139-165 (2020).
  14. Meaders, J. L., Burgess, D. R. Microtubule-based mechanisms of pronuclear positioning. Cells. 9 (2), 505(2020).

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Mots-clés

Manipulation de la taille de l embryonRapport nucl ocytoplasmiqueEmbryogen se pr coceActivation du g nomeConstriction physiqueVolume cytoplasmiqueF condation in vitroSt r omicroscopieR gulation de la taille cellulaire

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