Métastases cérébrales du cancer du sein intracrânien Modèle murin pour la caractérisation des cellules immunitaires et stromales dans les méninges et le bulbe olfactif

Résumé

Le protocole établit les métastases cérébrales du cancer du sein via l’inoculation intracrânienne et caractérise par cytométrie de flux les sous-ensembles clés de cellules lymphatiques et immunitaires qui régulent l’immunité cérébrale. Ces analyses fournissent des éclairages sur la dynamique des cellules immunitaires et stromales qui façonnent le microenvironnement cérébral, favorisant le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Résumé

Le système nerveux central (SNC) est entouré d’interfaces immunitaires spécialisées, notamment les méninges et le bulbe olfactif, qui peuvent servir à la fois de voies permissives pour la colonisation métastatique et de points d’entrée pour les réponses immunitaires anti-tumorales. Comprendre comment la dynamique des cellules immunitaires évolue au sein de ces structures lors de la progression métastatique est essentiel pour identifier les mécanismes qui soutiennent ou restreignent la croissance tumorale dans le cerveau. Ce protocole détaille l’établissement d’un modèle murin de métastases cérébrales atteintes du cancer du sein (BCBM) par injection intracrânienne de cellules E0771 du cancer du sein chez des souris C57BL/6. Après le développement de la tumeur, les méninges et le bulbe olfactif sont soigneusement disséqués, digérés enzymatiquement et transformés en suspensions unicellulaires. Ces populations sont ensuite analysées à l’aide de cytométrie à flux spectral multiparamétrique afin de caractériser de manière exhaustive les sous-ensembles lymphoïdes, myéloïdes et stromales au sein des niches immunitaires associées au SNC. Ce flux de travail permet des analyses comparatives entre témoins tumoraux et non tumoraux, identifiant les altérations au sein des interfaces immunitaires du SNC qui peuvent être à la base de l’évasion immunitaire tumorale et représenter des cibles thérapeutiques potentielles. Dans l’ensemble, le protocole propose une approche reproductible pour étudier la BCBM et interroger la régulation immunitaire aux interfaces du système immunitaire CNS-système périphérique. Il peut être adapté pour d’autres lignées cellulaires cancéreuses, des immunothérapies ou des modèles génétiques murins afin d’étudier les mécanismes de résistance immunitaire et la réponse thérapeutique dans le microenvironnement cérébral.

Introduction

Les métastases cérébrales sont les tumeurs malignes les plus courantes affectant le système nerveux central (SNC), survenant plus fréquemment que les tumeurs cérébrales primaires. Le cancer du poumon, le cancer du sein et le mélanome sont les principaux cancers qui métastasent le plus souvent vers le^{cerveau 1}. Parmi celles-ci, les métastases cérébrales atteintes du cancer du sein (BCBM) représentent un défi clinique majeur, touchant 10 % à 30 % des patientes atteintes de maladie métastatique et montrant une incidence croissante grâce à l’amélioration des thérapies systémiques et aux avancées en^{neuroimagerie 2}. Le pronostic pour les patients atteints de BCBM reste mauvais, car les traitements disponibles – y compris la chirurgie, la radiothérapie et la chimiothérapie – sont en grande partie palliatifs, et les symptômes neurologiques impactent gravement la qualité^{de vie 3}. Bien que les thérapies ciblées et les immunothérapies soient explorées comme des stratégies complémentaires, le bénéfice clinique de l’immunothérapie dans les métastases cérébrales reste^{limité 4,5,6}.

Des travaux récents ont affiné notre compréhension de l’immunité cérébrale et un intérêt renouvelé pour les voies lymphatiques fonctionnelles associées au SNC, y compris les vaisseaux lymphatiques des^{méninges 7} et de la muqueuse^{nasale 8}. Ces structures forment un réseau lymphatique continu entourant le cerveau et s’étendant à proximité du bulbe olfactif et de la plaque cribriforme, se connectant finalement aux ganglions lymphatiques cervicaux. Ce système joue un rôle clé dans l’homéostasie des fluides, la surveillance immunitaire et le trafic cellulaire immunitaire entre le SNC et les organes lymphoïdes^{périphériques 9}. À mesure que l’intérêt grandit pour les approches immunothérapeutiques pour les tumeurs cérébrales et les métastases, ces interfaces lymphatique-immunitaires émergent comme des voies prometteuses, mais encore peu étudiées, par lesquelles l’immunité systémique peut communiquer avec des lésions intracrâniennes. De plus, les mécanismes régissant le recrutement des cellules immunitaires dans le microenvironnement tumoral cérébrale et la manière dont ces cellules interagissent dans cet environnement unique restent peu compris. Ensemble, ces lacunes soulignent la nécessité de modèles précliniques et de procédures permettant une analyse complète des interactions tumeur-immunité et soutiennent le développement de stratégies pour améliorer l’immunité antitumorale contre les métastases cérébrales.

Ici, nous décrivons un protocole qui combine la génération d’un modèle murin BCBM reproductible et immunocompétent par inoculation intracrânienne stéréotaxique des cellules E0771 avec l’isolement et la dissociation des méninges et du bulbe olfactif pour l’immunophénotypage par cytométrie à flux spectral. Cette approche permet une modélisation contrôlée de la BCBM pour évaluer la sécurité et l’efficacité des interventions thérapeutiques et permet une caractérisation approfondie des populations immunitaires et stromales à l’interface cerveau-lymphatique-immunitaire, fournissant un aperçu des acteurs cellulaires qui façonnent le microenvironnement tumoral cérébral et influencent les réponses thérapeutiques.

Les modèles animaux restent indispensables pour étudier les métastases cérébrales, car de nombreux aspects critiques de la progression métastatique ne peuvent pas être reproduits in vitro. Plusieurs modèles murins in vivo ont été développés pour générer des métastases cérébrales, chacune présentant des avantages et des limitations spécifiques¹⁰. Les modèles de métastases spontanées, y compris l’implantation orthotopique ou les modèles murins génétiquement modifiés, imitent plus étroitement la progression clinique de la maladie mais génèrent rarement des lésions intracrâniennes, nécessitent de longues périodes expérimentales et présentent souvent une grande variabilité due à une maladie extracrânienne généralisée. Les approches systémiques, incluant les injections intracardiaques, intracarotides ou dans les veines caudales, introduisent les cellules tumorales dans la circulation et imitent mieux la dissémination hématogène, l’extravasation de la barrière hémato-encéphalique et la colonisation. Cependant, ces modèles ne captent pas les premières étapes de l’invasion tumorale primaire et produisent fréquemment des métastases extracrâniennes étendues et variables, notamment dans les poumons. Parmi les modèles systémiques, l’injection intracarotide présente la plus faible variabilité, mais nécessite une expertise chirurgicale avancée. Alternativement, l’injection intracrânienne offre plusieurs avantages, notamment un contrôle précis de la localisation des tumeurs, un développement tumoral rapide et reproductible, ainsi qu’une variabilité réduite entre les expériences. Cette approche peut également être complétée par une implantation tumorale primaire orthotopique suivie d’une résection chirurgicale afin d’imiter plus précisément le parcours métastatique. Bien que l’injection intracrânienne ne récapitule pas la cascade métastatique complète et ne soit pas adaptée à l’étude de l’invasion et de la dissémination précoces, elle fournit un modèle robuste pour évaluer l’efficacité thérapeutique face aux lésions établies et étudier les interactions au sein du microenvironnement cérébral. Une limitation connue est que l’injection elle-même peut induire une neuroinflammation locale, pouvant influencer les lectures immunitaires, qui peuvent être évaluées en comparant les profils immunitaires chez des souris injectées et non injectées.

La caractérisation immunitaire des méninges et du bulbe olfactif reste un domaine de recherche relativement nouveau et peu exploré. La plupart des études s’appuient sur des échantillons de ganglions lymphatiques du cerveau entier ou^{du col de l’utérus 11}, qui ne parviennent pas à capturer la composition cellulaire distincte ni les fonctions immunitaires spécialisées de ces tissus associés aux lymphatiques. La récupération des deux structures offre une vision plus large et plus informative de l’immunité cérébrale. Combiné à la cytométrie spectrale multiparamétrique à flux, ce flux de travail soutient un profilage à haut débit des populations cellulaires immunitaires abondantes et rares impliquées dans la communication immunitaire CNS-périphérique. Cela inclut la quantification des marqueurs de surface et intracellulaires pour identifier les sous-ensembles cellulaires, évaluer les états d’activation et évaluer les changements induits par le traitement. D’autres méthodologies d’analyse immunitaire du SNC non couvertes par ce protocole incluent l’immunohistochimie (IHC) et l’immunofluorescence (IF), qui préservent la distribution spatiale des cellules immunitaires mais sont limitées par un multiplexage à faible marqueur, la quantification subjective et la sous-représentation des rares types^{cellulaires 12}. Plus récemment, le séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) a élargi la capacité à profiler les populations immunitaires du SNC en permettant la découverte d’états cellulaires et de programmes transcriptionnels à haute résolution. Bien qu’il offre une puissante compréhension transcriptomique, le scRNA-seq est limité par le coût, les artefacts de dissociation, la perte de transcript et la perte de résolution au niveau^{protéique 13,14}. La cytométrie en flux, bien que dépourvue d’analyse spatiale et sensible aux effets liés à la dissociation, offre une résolution phénotypique supérieure grâce à un panel multiparamétrique avancé et un profilage immunitaire quantitatif robuste.

Ensemble, les méthodologies décrites ici fournissent une plateforme flexible et puissante pour modéliser le BCBM et interroger la dynamique immunitaire aux interfaces lymphatiques du SNC, soutenant le développement préclinique de thérapies ciblant à la fois le microenvironnement tumoral cérébral et ses voies de régulation immunitaire associées.

Protocole

Toutes les procédures animales ont été menées conformément aux directives de la Faculté de pharmacie de l’Université de Lisbonne. Les protocoles ont été examinés et approuvés par l’autorité portugaise compétente pour la protection animale, la Direção-Geral de Alimentação e Veterinária (Référence 0421/000/000/2021).

1. Préparation des cellules E0771 pour l’implantation in vivo

1. Dans un capot stérile, cultivez des cellules d’E0771 dans un flasque T75 à l’aide du Médium Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco, complété avec 10 % (v/v) de sérum fœtal bovin (FBS) et 1 % (v/v) de pénicilline et de streptomycine (PEST).
   1. Assurez-vous que les cellules sont authentifiées par un profilage STR dès la réception du fournisseur et confirmées exemptes de mycoplasmes par des tests de routine. Cultivez les cellules tumorales sur au moins 2 à 8 passages après la décongélation avant l’implantation cérébrale.
2. Le jour de l’implantation, assurez-vous que les cellules sont saines et confluentes à 80-90 %. Retirez le milieu et lavez les cellules avec du sérum physiologique tamponné de phosphate (PBS).
3. Ajoutez la trypsine à la flasque et faites éclore pendant 5 minutes à 37 °C. Ensuite, ajoutez trois fois le volume du milieu complété (DMEM avec 10 % de FBS en v/v et 1 % de PEST) pour neutraliser la trypsine et dissocier les cellules.
4. Transférez les cellules dans un tube et centrifugez à 300 x g pendant 5 minutes à température ambiante (RT). Retirez le surnageant et resuspendez le pellet dans PBS pour le comptage cellulaire.
5. Centrifugez à nouveau (300 x g pendant 5 min), éliminez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans le PBS à une concentration de 1 x 10⁵ cellules E0771 en 2 μL par animal. Gardez la suspension cellulaire sur glace jusqu’à l’inoculation contre la tumeur. Préparez la suspension cellulaire immédiatement avant l’injection.

2. Inoculation intracrânienne à l’aide d’un appareil stéréotaxique

1. Obtenez des femelles C57BL/6 souris (âgées de 6 à 8 semaines) et acclimatez-les à l’établissement pour animaux pendant au moins 7 jours avant l’opération. Gardez les souris d’intérieur dans des conditions contrôlées avec un cycle clair/obscurité de 12 heures et fournissez nourriture et eau à volonté de manière à libre.
   REMARQUE : Un minimum de cinq animaux par groupe expérimental est recommandé afin d’assurer une puissance statistique suffisante pour un profilage immunitaire comparatif significatif entre les affections tumorales et témoins.
2. Préparez le champ chirurgical et tous les matériaux nécessaires avant de commencer la procédure :
   1. Instruments chirurgicaux : scalpel, ciseaux, pinces, porte-aiguilles, fil de suture.
   2. Équipements et autres : instrument stéréotaxique, seringue en verre, perceuse, rasoir, tige-coton, coussin chauffant.
   3. Anesthésie : Préparez la kétamine-xylazine (K-X) (25 mg/mL et 2 mg/mL, respectivement) dans un tube de 15 mL.
   4. Analgésie : Préparez la buprénorphine à 15 μg/mL dans un tube de 15 mL.
   5. Autres solutions : povidone-iode, peroxyde d’hydrogène à 3 % v/v (_{H 2O2}), pommade ophtalmique.
      ATTENTION : H_2O2 est nocif s’il est avalé et peut provoquer une irritation cutanée.
3. Anesthésiez la souris par injection intrapéritonéale (p.i.) de K-X (100 μL pour 10 g de poids corporel). Confirmez une anesthésie adéquate en l’absence de réponse à la pincée des orteils.
4. Appliquez une pommade ophtalmique sur les deux yeux pour éviter la déshydratation et placez la souris sur une bouillotte tout au long de l’intervention.
5. Rasez le cuir chevelu et désinfectez la zone chirurgicale avec du povidone-iode. Faites une incision longitudinale de 1 cm le long de la ligne médiane pour exposer le crâne.
6. Nettoyez le crâne exposé avec_H2O2à l’aide d’un coton-tige-coton en mouvement circulaire pour visualiser le bregma. En cas de mousse excessive, retirez-la avec un écouvillon sec.
7. Placez la souris dans le cadre stéréotaxial. Placez la bregme comme point de référence (0,0) et mesurez 2,5 mm latéral et 0,5 mm avant la bregme. Marquez le site d’injection.
8. Retirez la souris et percez un petit trou aux coordonnées marquées. Évitez de percer trop profondément pour éviter les lésions cérébrales.
9. Montez la seringue sur l’injecteur. Resuspendez les cellules et chargez la seringue en verre avec un volume suffisant pour deux injections (4–5 μL). Ne préparez pas plus de deux injections à la fois pour éviter la décantation cellulaire.
10. Repositionnez la souris dans la stéréotaxie, alignez l’aiguille avec le trou, puis descendez-la lentement à une profondeur de 3,0 mm dans le parenchyme cérébral. Injectez les cellules (ou PBS stériles pour un contrôle simulé) à 1 μL/min.
11. Après l’injection, gardez l’aiguille en place pendant au moins 1 minute, rétractez 1,5 mm, maintenez encore une minute, puis retirez complètement. Cela minimise le reflux et assure un dépôt cellulaire approprié.
12. Fermez l’incision avec des points de suture et appliquez de la povidone-iode. Administrez la buprénorphine (100 μL) par voie sous-cutanée.
13. Gardez la souris sur un coussin chauffant jusqu’à la récupération complète de l’anesthésie. Remettez la souris dans une cage propre et surveillez quotidiennement toute détresse, signes neurologiques ou infections.

3. Perfusion intracardiaque souris

1. Anesthésier les souris par injection i.p. de K-X (100 μL pour 10 g de poids corporel). Confirmez une anesthésie adéquate en l’absence de réponse à la pincée des orteils.
2. À l’aide de ciseaux, réalisez une incision de 5 à 6 cm à travers la paroi abdominale et deux incisions à travers la cage thoracique jusqu’à la clavicule. Faites attention à ne pas couper de gros vaisseaux sanguins.
3. Avec le cœur exposé, coupez l’oreillette droite pour permettre la circulation sanguine. Injectez du PBS glacé dans le ventricule gauche avec une seringue de 20 mL équipée d’une aiguille de 25 G × 1 pouce.
4. Arrêtez la perfusion lorsque le liquide qui s’écoule est dégagé du sang. Pour les souris adultes, il faut environ 20 mL de PBS.

4. Isolement des méninges et du bulbe olfactif de la souris

1. Après une perfusion intracardiaque, décapitez la souris à l’aide de ciseaux chirurgicaux. Retirez complètement le cuir chevelu pour exposer le crâne.
2. À l’aide de ciseaux, coupez le crâne dans le plan transversal de la région postérieure vers les yeux, en veillant à ne pas endommager le tissu cérébral sous-jacent. Extraire doucement le cerveau à l’aide de pinces fines, en évitant le contact ou le grattage de la surface interne du crâne.
3. Après l’ablation du cerveau, les méninges durales restent attachées à la surface interne du crâne. Immergez le crâne dans du PBS glacé pendant au moins 5 minutes pour faciliter la séparation intacte des méninges.
4. Disséquez le bulbe olfactif de la région antérieure du cerveau et transférez-le dans un PBS glacé pour un stockage temporaire jusqu’au traitement.
5. À l’aide de pinces à pointe fine, détachez doucement les méninges de la surface interne du crâne en soulevant et en pelant délicatement la fine couche tissulaire. Transférer les méninges dans un PBS glacé jusqu’à un traitement supplémentaire. Évitez de déchirer le tissu pour assurer une récupération optimale des cellules en aval.

5. Dissociation tissulaire en cellules uniques

1. Méninges
   1. Transférer les méninges dans 3 mL de RPMI 1640 contenant 0,05 % de collagénase II et DNase I. Incuber pendant 20 minutes à 37 °C, en agitant doucement toutes les 10 minutes. La surdigestion réduit la viabilité cellulaire et doit être évitée.
   2. Faites passer le tissu digéré à travers une tamoire cellulaire de 40 μm dans un tube de 50 mL. Dissociez mécaniquement les tissus restants en pressant doucement une ventouse à seringue contre la passoire et lavez avec 5 mL de PBS.
   3. Centrifugez à 300 x g pendant 5 minutes à 4 °C. Jetez le surnageant et remettez le pellet en suspension dans un PBS de 3 mL.
   4. Répétez la centrifugation. Rejetez le surnageant, resuspendez la pastille finale dans le volume restant, puis transférez sur une plaque U-bottom de 96 puits.
2. Bulbe olfactif
   1. Retirez le PBS et dissociez mécaniquement les tissus à l’aide d’un piston à seringue. Ajoutez 3 mL de solution digestive contenant 0,02 % de collagénase II dans la solution saline équilibrée de Hanks (HBSS). Incubez pendant 20 minutes à 37 °C, en agitant doucement toutes les 10 minutes.
   2. Faites passer la suspension à cellules à travers une tamoire de 70 μm dans un tube de 50 mL et lavez avec un PBS de 10 mL.
   3. Centrifugez à 300 x g pendant 5 minutes à 4 °C. Jetez le surnageant et resuspendez la pastille finale dans le volume restant. Transférer sur une plaque U-bottom à 96 puits.
3. Conservez les plaques à 4 °C jusqu’à ce qu’elles soient teintées.
   REMARQUE : Effectuer la coloration le jour même pour garantir une viabilité cellulaire optimale.

6. Coloration cellulaire et acquisition par cytométrie en flux

1. Conception des panneaux
   1. Veuillez consulter le tableau 1.
      REMARQUE : Le panneau de ce protocole a été conçu pour un cytomètre à flux spectral équipé de 4 lasers (violet, bleu, jaune-vert et rouge) et d’un total de 51 détecteurs (48 canaux de fluorescence + 3 canaux de diffusion). Le panneau doit être conçu en fonction de la configuration du cytomètre en flux et des protéines/marqueurs d’intérêt.
2. Coloration cellulaire
   1. Centrifugez les plaques de 96 puits en U à 300 x g pendant 5 minutes à 4 °C. Jetez soigneusement le surnageant. À partir de cette étape, protégez les plaques de la lumière.
   2. Ajouter un colorant de viabilité de 50 μL (FVD, dilution 1:5000 en PBS) dans les puits appropriés et incuber pendant 20 minutes à la RT. Laver avec 150 μL PBS, centrifuger à 300 x g pendant 5 minutes à 4 °C, puis éliminer le surnageant. Ajoutez uniquement du colorant de viabilité aux contrôles de viabilité et aux échantillons.
   3. Bloquer les récepteurs Fc en incubant les cellules avec 30 μL d’anticorps anti-CD16/CD32 (0,01 μg/mL dans le tampon FACS : PBS avec 2 mM d’EDTA et 0,5 % de BSA) pendant 10 minutes sur glace. Laver avec un tampon FACS de 170 μL, centrifuger à 300 x g pendant 5 minutes à 4 °C, puis jeter le surnageant.
   4. Ajoutez un mélange d’anticorps de 30 μL ou des contrôles monocolores (préparés selon les dilutions d’anticorps listées dans le tableau des matériaux, dans le tampon FACS) et incubez pendant 20 minutes sur de la glace. Laver avec un tampon FACS de 170 μL, centrifuger à 300 x g pendant 5 minutes à 4 °C, puis jeter le surnageant.
   5. Fixer les cellules avec 100 μL de paraformodéhyde (PFA) à 2 % dans le PBS pendant 20 minutes à RT. Laver avec 100 μL de PBS, centrifuger à 300 x g pendant 5 minutes à 4 °C, puis éliminer le surnageant.
      REMARQUE : Pour les marqueurs intracellulaires, remplacez cette étape par fixation et perméabilisation à l’aide d’un ensemble tampon commercial, puis effectuez une coloration intracellulaire avant la resuspension finale.
   6. Resuspendez les granulés de cellules finales dans 200 μL de tampon FACS. Stockez les assiettes à 4 °C jusqu’à leur acquisition sur le cytomètre de débit.
3. Contrôles colorés en une seule couleur et Fluorescence Moins One (FMO)
   1. Des échantillons colorés en une seule couleur sont nécessaires pour l’optimisation du démélange. Les cellules sont utilisées pour des échantillons colorés en une seule couleur pour les marqueurs montrant des pics positifs et négatifs. Sinon, l’utilisation de billes de compensation est préférée et recommandée pour obtenir un démélange optimal. Préparez des billes de compensation pour les anticorps conjugués fluorescents selon le protocole du fabricant.
      REMARQUE : La préparation des contrôles FMO est une étape importante pour atteindre un bon filtrage, en particulier pour les marqueurs qui ne montrent pas de pics positifs et négatifs clairs. Préparez plusieurs échantillons de FMO pour différents fluorochromes selon les besoins.
   2. Préparez des échantillons de FMO pour les antigènes de surface cellulaire en suivant les étapes de la Partie 6.2, mais excluez l’anticorps d’intérêt du mélange d’anticorps à l’étape 6.2.4.
4. Acquisition et analyse de cytométrie en flux
   1. Allumez le cytomètre, lancez le logiciel d’acquisition du cytomètre à débit, et préparez les billes de contrôle qualité (QC) (1 goutte dans un PBS de 300 μL) dans un tube d’échantillon de 12 x 75 mm pendant que la machine chauffe (au moins 30 minutes).
   2. Nettoyez l’instrument en faisant fonctionner : 3 min 10 % d’eau de Javel, 30 min_{H 2}O à débit élevé. Remettez le débit bas pour les étapes suivantes.
   3. Sélectionnez l’onglet QC, chargez le tube et faites passer les billes en appuyant sur start. Une fois le contrôle qualité terminé, un message indiquant « Passé » apparaît.
   4. Allez dans l’onglet acquisition, sélectionnez ou créez l’expérience et commencez l’acquisition en verrouillant les cellules par FSC et SSC. Acquérez des contrôles non teintés et monocolores, lancez l’assistant de démixage et enregistrez les paramètres. Prenez des échantillons colorés.

Résultats

Après l’inoculation intracrânienne des cellules E0771, les souris ont développé une lésion localisée du cancer du sein aux coordonnées stéréotaxiques ciblées. Les coordonnées stéréotaxiques ciblant le parenchyme striatal (2,5 mm latéral, 0,5 mm antérieur au bregma, et 3,0 mm ventral à partir du bregma) ont été sélectionnées sur la base des atlas cérébraux standard de souris et les approches d’implantation intracrânienne précédemment^{décrites 15,16}. Cette région es...

Discussion

En combinant l’implantation intracrânienne de tumeurs avec l’isolement, la dissociation et la caractérisation immunitaire des méninges et du bulbe olfactif, ce protocole permet une étude détaillée de l’interaction dynamique entre le microenvironnement tumoral cérébral et les interfaces immunitaires associées au SNC. La méthode offre une formation reproductible de tumeurs intracrâniennes, des suspensions cellulaires de haute qualité et une résolution robuste des sous-ensembles immunitaire...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Alexa Fluor 594 anti-mouse CD45R/B220 antibody (clone RA3-6B2)	BioLegend	103254	utilisé à une dilution de 1:300
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD8 antibody (clone 53-6.7)	BioLegend	100730	utilisé à une dilution de 1:50
APC anti-mouse P2RY12 antibody (clone S16007D)	BioLegend	848006	utilisé à une dilution de 1:80
Betadine	Selleck Biotechnology GmbH	S4678-100mg	Povidone-iodine
Bovine Serum Albumin (BSA), lyophilized powder, ≥96% (agarose gel electrophoresis)	Sigma-Aldrich	A2153	Pour préparer le tampon FACS
Brilliant Violet 421 anti-mouse Podoplanin antibody (clone 8.1.1)	BioLegend	127423	utilisé à une dilution de 1:80
Brilliant Violet 510 anti-mouse CD11b antibody (clone M1/70)	BioLegend	101263	utilisé à une dilution de 1:30
Brilliant Violet 570 anti-mouse NK1.1 antibody (clone PK136)	BioLegend	108733	utilisé à une dilution de 1:40
Brilliant Violet 650 anti-mouse CD19 antibody (clone 6D5)	BioLegend	115541	utilisé à une dilution de 1:50
Brilliant Violet 711 anti-mouse CD44 antibody (clone IM7)	BioLegend	103057	utilisé à une dilution de 1:80
Brilliant Violet 785 anti-mouse F4/80 antibody (clone BM8)	BioLegend	123141	utilisé à une dilution de 1:40
Bupaq 3 mg/mL	Bio5	1002241	Buprénorphine
Cell strainer 40-μm	Avantor	732-2757
Cell strainer 70-μm	Avantor	732-2758
Centrifuge 5910 Ri	Eppendorf	5943000011
Collagenase type II	Worthington Biochemical Corporation	LS004176
Corning Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix	Corning	356231
Cytek Aurora Spectral Flow Cytometer	Cytek Biosciences
Dnase I	Worthington Biochemical Corporation	LS002006
Drill	Stoelting Europe	51630
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high-glucose, pyruvate	Gibco	41966029
E0771 cell line	ATCC	CRL-3436
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	Merck	E4884	Pour préparer le tampon FACS
FCS Express Flow Cytometry Software	De Novo Software
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	A5256801
FITC anti-mouse CD3 (clone 17A2)	BioLegend	100204	utilisé à une dilution de 1:50
Ghost Dye Red 780	Cytek Biosciences	13-0865-T500	Colorant de viabilité (utilisé à une dilution de 1:5000)
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red	Gibco	14025092
Heating Pad	MOBICLINIC
Hydrogen Peroxide 34.5 to 37% (H2O2)	ACROS	10002780
Ketamax 100 mg/mL	Bio3	1009495	Kétanine
Lubrithal Eye Gel	Bio4	1731329
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) 1M	Gibco	15630080
Paraformaldehyde (PFA) 16 %	Avantor	43368	Pour préparer le tampon de fixation
Pacific Blue anti-mouse Ly-6G antibody (clone 1A8)	BioLegend	127612	utilisé à une dilution de 1:50
PE anti-mouse Ly-6C antibody (clone HK1.4)	BioLegend	128008	utilisé à une dilution de 1:300
PE anti-mouse P2RY12 antibody (clone S16007D)	BioLegend	848004	utilisé à une dilution de 1:80
PE/Cyanine5 anti-mouse CD11c antibody (clone N418)	BioLegend	117316	utilisé à une dilution de 1:80
PE/Cyanine7 anti-mouse CD80 antibody (clone 16-10A1)	BioLegend	104734	utilisé à une dilution de 1:100
PE-eFluor 610 anti-mouse CD31 antibody (clone 390)	eBioscience	61-0311-82	utilisé à une dilution de 1:160
PE/Fire 810 anti-mouse I-A/I-E (clone M5/114.15.2)	BioLegend	107667	utilisé à une dilution de 1:300
Penicillin-Streptomycin (PEST), 10 000 U/mL	Gibco	15140-122
PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45 antibody (clone 30-F11)	BioLegend	103132	utilisé à une dilution de 1:80
Phosphate-buffered saline (PBS) 10X, pH 7.4	Gibco	70011044
Prism (version 10)	GraphPad
RN Needle (27/51/3)S	Hamilton Company	7762-01
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement	Gibco	61870044
Scalpel Blades, carbon steel	B Braun	BB510
Sedaxylan 20 mg/mL	Bio2	1112384	Xylasine
Spark Blue 574 anti-mouse CD4 antibody (clone GK1.5)	BioLegend	100490	utilisé à une dilution de 1:50