Génération de substrats de matrice extracellulaire en polyacrylamide et silicone avec rigidité définie pour des applications en biologie cellulaire

Résumé

Bien que la rigidité de la matrice extracellulaire (MEC) soit un régulateur clé du comportement cellulaire, les mécanismes sous-jacents de détection et de transduction restent flous. Pour y remédier, nous proposons des protocoles permettant de créer des substrats à base de polyacrylamide et de silicone avec une rigidité réglable afin de faire progresser notre compréhension de la diaphonie cellulaire-ECM.

Résumé

La matrice extracellulaire (MEC) est un régulateur critique du comportement cellulaire, la rigidité de la ME servant de signal mécanique clé qui régit la signalisation, la morphologie et le destin cellulaire. Cependant, l’étude expérimentale des réponses cellulaires dépendantes de la rigidité est souvent limitée par la disponibilité de plateformes de culture reproductibles, économiques et accessibles, dotées de propriétés mécaniques précisément accordables. Ce protocole décrit des méthodes à base de polyacrylamide (PA) et de silicone pour fabriquer des substrats ECM à rigidité accordable. Les procédures décrivent la préparation du substrat, la fonctionnalisation de la surface et la conjugaison des protéines ECM afin d’assurer une adhésion cellulaire cohérente sur une plage de raideur physiologiquement pertinente. Les substrats à base de PA sont compatibles avec les tests biochimiques en aval, y compris l’extraction de protéines et d’ARN, ainsi qu’avec l’imagerie à fluorescence haute résolution. Les substrats à base de silicone sont optimisés pour la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF), permettant la visualisation des interactions cellule-MEC à la membrane basale. De plus, les substrats mous peuvent être adaptés pour soutenir des cultures sphéroïdes positionnées dans un plan d’imagerie cohérent, facilitant ainsi une acquisition d’images cohérente. Ces méthodes fournissent des plateformes robustes, rentables et reproductibles pour sonder systématiquement comment la rigidité de la MEC régule les processus cellulaires, faisant progresser une compréhension mécaniste du dialogue entre cellule et ECM dans des contextes physiologiques et pathologiques.

Introduction

La matrice extracellulaire (MEC) est un échafaudage structurel et biochimique fondamental qui définit les propriétés mécaniques des tissus et soutient leurs fonctions biologiques. Par exemple, les tissus élastiques tels que les poumons et les artères sont enrichis en ECM à base de collagène et d’élastine qui fournit la résilience mécanique nécessaire à des cycles répétés d’étirement-recul pendant la respiration. En revanche, le système nerveux central contient une ECM riche en glycosaminoglycanes qui crée un environnement hautement complaisant, optimisé pour la différenciation et la signalisation^{neuronale 1}. Sur divers tissus du corps, la raideur tissulaire s’étend sur plusieurs ordres de grandeur, allant de centaines de pascals dans les tissus mous comme le cerveau et les poumons jusqu’aux niveaux de raideur des tendons et des os, respectivement ^2,3. Ces différences mécaniques ne sont pas seulement structurelles, mais jouent également un rôle crucial dans la régulation du comportement cellulaire ^4,5. Par exemple, les cellules souches mésenchymates subissent une spécification de lignée dépendante de la raideur, adoptant des destins neuronaux sur des substrats mous, des destins myogéniques sur des substrats intermédiaires, et des destins ostéogènes sur des substrats^{rigides 6}. Des altérations pathologiques de la raideur de la MCE peuvent également entraîner des réponses cellulaires aberrantes et contribuer à l’initiation et à la progression de la^{maladie 7,8,9}. De même, les modifications des propriétés de la ME autour des cellules modifient également la fonction des organites et divers comportements^{cellulaires 10,11}. Malgré l’importance reconnue de la MCE pour guider la signalisation, la fonction des organites et la pathogenèse des maladies, les mécanismes par lesquels les cellules détectent et transmettent les indices de la MCE en signaux biochimiques restent incomplètement compris.

Les progrès dans la compréhension de la diaphonie cellule-ECM ont été en partie freinés par la disponibilité limitée de plateformes expérimentales offrant un contrôle précis des propriétés de la MCE tout en restant pleinement compatibles avec les tests biochimiques standards et les flux de travail d’imagerie. De plus, l’étude des interactions cellule-ECM est souvent perçue comme techniquement complexe, car elle nécessite une expertise interdisciplinaire couvrant la science des matériaux, la biologie cellulaire et le bio-ingénierie. Cette méthode vise à relever ces défis en fournissant des protocoles étape par étape pour générer des substrats ECM à base de PA et de silicone, avec des propriétés mécaniques définies, qui peuvent être facilement préparés dans la plupart des environnements de laboratoire humide.

Les hydrogels PA à rigidité accordable sont des incontournables de la mécanobiologie ; cependant, leur utilité est souvent entravée par le coût élevé des réactifs pour la conjugaison de la MEC, une fonctionnalisation incohérente des surfaces et une faible compatibilité avec les flux de travail biochimiques à grande échelle. De plus, les approches pratiques et standardisées pour la récolte et l’imagerie d’échantillons sur des substrats de rigidité variable ne sont pas bien établies. Ces goulots d’étranglement peuvent être abordés grâce à notre plateforme de gel PA décrite, caractérisée par quatre innovations clés : (i) réduction substantielle des coûts, (ii) chimie de la fonctionnalisation reproductible, (iii) production évolutive via du matériel réutilisable, et (iv) intégration transparente avec de nombreux tests de biologie cellulaire et biochimiques conventionnels. Cette approche utilise différents rapports d’acrylamide et de bisacrylamide pour générer des hydrogels aux propriétés mécaniques distinctes (Tableau 1). Les gels PA sont inertes et ne se conjuguent pas directement aux protéines ECM. Par conséquent, une réaction de polymérisation des radicaux libres initiée par les UV est utilisée pour conjuguer un réseau fin et réticulé de tétraacrylate de di(triméthétyllpropane), d’ester d’acide acrylique N-hydroxysuccinimide (NHS-acrylate) et de bisacrylamide à la surface des gels PA (Figure 1). Ce réseau crée une surface adhésive à double action pour les protéines ECM : le NHS-acrylate assure un ancrage covalent stable pour les protéines ECM, tandis que le tétraacrylate facilite une adsorption uniforme des protéines^{ECM 12}. De plus, nous proposons des méthodes démontrant comment récolter des protéines et des acides nucléiques tels que l’ARN de ces substrats de manière compatible avec les analyses de biologie cellulaire en aval telles que le western blotting et la réaction en chaîne par transcription inverse-quantitative polymérases (RT-qPCR). De plus, les substrats PA conformes ainsi soutiennent également la formation des sphéroïdes et la position des sphéroïdes dans un plan focal cohérent, permettant une analyse systématique des comportements cellulaires^{3D 13}.

En revanche, les limites optiques des hydrogels PA restreignent leur utilisation dans les modalités d’imagerie avancées, en particulier la microscopie à fluorescence interne totale (^{TIRF) 14}. Pour répondre à cette contrainte, nous avons développé des substrats ECM à base de silicone mécaniquement accordables, optimisés pour l’imagerie TIRF. Ces matériaux présentent un indice de réfraction étroitement adapté à celui du verre tout en maintenant une rigidité accordable sur une large plage (Figure 2A). Une fine couche de gel de silicone, avec des rapports de pièces variables, est appliquée par centrifugation sur un verre de couverture avant la conjugaison ECM (Figure 2B et Tableau 2). Cependant, l’hydrophobie intrinsèque et l’inertie chimique du silicone empêchent la conjugaison directe de la MEC. Nous mettons donc en œuvre une stratégie de modification de surface pour permettre l’attachement covalent des ligands ECM. Le traitement par plasma d’oxygène introduit des groupes hydroxyles sur la surface du silicone (Figure 2C). Par la suite, le (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) convertit ces groupes hydroxyle en amine réactive. Le 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl) carbodiimide chlorhydrate (EDC), un cross-titriculer carbodiimide de longueur zéro, facilite ensuite la formation de liaisons amides covalentes entre les groupes amines à la surface du gel et les groupes carboxyle sur les protéines ECM.

Collectivement, ces plateformes ECM fournissent des systèmes rentables, reproductibles et évolutifs pour sonder les mécanismes de signalisation dépendants de la rigidité de l’ECM. Leur flexibilité permet une intégration fluide avec des tests biochimiques, des images haute résolution et des flux de travail à haut débit, permettant d’étudier comment la rigidité de la VEL influence le comportement cellulaire et favorise la progression de la maladie.

Protocole

1. Production d’hydrogels ECM à base de PA

1. Fonctionnalisation des surfaces vitrées pour l’attache du gel PA
   REMARQUE : Effectuez toutes les étapes à température ambiante sur un vibrateur orbital. Rincez soigneusement avec de l’eau de qualité entre les étapes.
   1. Nettoyez les surfaces vitrées avec de l’eau de Javel à 10 % pendant 3 heures dans un plat résistant aux produits chimiques (par exemple, polystyrène). Utilisez un volume suffisant pour recouvrir complètement le verre et assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles piégées ni de zones sèches.
      ATTENTION : L’eau de Javel est un produit chimique hautement corrosif et réactif. Suivez les instructions de sécurité du fabricant.
   2. Incubez les couvercles dans de l’acide chlorhydrique (HCl) à 0,2 M pendant 16 heures avec une légère agitation sur un shaker.
      ATTENTION : L’HCl est très corrosif et peut provoquer des brûlures cutanées. Portez des équipements de protection adaptés.
   3. Ajoutez 0,1 M de NaOH et incubez pendant 1 heure.
      ATTENTION : Les solutions de NaOH sont corrosives et peuvent provoquer des brûlures cutanées. Portez des équipements de protection adaptés.
   4. Incubez les couches de couverture dans des APTES à 0,5 % dans de l’eau de haute qualité pendant 30 minutes.
      ATTENTION : Aptes est toxique. Travailler avec des APTES dans une hotte à fumée avec des équipements de protection appropriés.
   5. Rincez les couvertures avec un grand volume d’eau pour éliminer les résidus d’APTES.
      REMARQUE : Un lavage incomplet provoquera une réaction entre APTES et glutaraldéhyde à l’étape suivante et entraînera des précipités blancs qui compromettront l’activation de la surface du verre.
   6. Incubez les couches de couverture dans 0,5 % de glutaraldéhyde dans le PBS pendant 1 heure.
      ATTENTION : Le glutaraldéhyde est toxique. Travailler avec du glutaraldéhyde dans une hotte à fumée avec un équipement de protection approprié.
   7. Séchez les bâtons de protection sur un matériau absorbant (par exemple, des essuie-touts) toute la nuit. Conservez les couvertures dans un contenant propre et scellé jusqu’à utilisation.
2. Préparation de la solution d’hydrogel PA et moulage en gel
   REMARQUE : Les formulations nécessaires pour obtenir des hydrogels avec le module élastique spécifié sont fournies dans le Tableau 1. Les volumes de gel recommandés et les dimensions du verre pour différentes applications expérimentales sont présentés dans le tableau 3.
   1. Mélangez les composants hydrogel de PA dans un tube microcentrifuge de 1,7 mL, à l’exclusion du persulfate d’ammonium (APS) et du tétraméthyléthylénediamine (TEMED).
      REMARQUE : Ne préparez pas de grands volumes car les gels à plus forte rigidité polymérisent rapidement et peuvent durcir avant la fin de la coulée.
   2. Dégazez le mélange de gel PA, les tubes APS et TEMED dans une chambre à vide à 25 mmHg pendant 30 minutes.
   3. Préparez les toits de couverture hydrophobes en appliquant un revêtement hydrofuge sur les coton-tige-coton. Assurez-vous que les couvertures sont exemptes de traces pour maintenir une polymérisation constante du gel.
   4. Ajoutez de l’APS et du TEMED à la solution dégazée, puis pipettez doucement le mélange sur les caches activées.
   5. Placez les engourdes hydrophobes sur la solution pour créer une fine couche d’hydrogel uniforme. Laissez les gels polymériser pendant 35 minutes à température ambiante. Veillez à ce qu’aucune bulle ne soit piégée entre les bâtons de couverture et que la solution ne déborde pas par-dessus les bords.
      REMARQUE : Suivez les volumes recommandés pour le gel pour garantir une bonne épaisseur ; Les gels excessivement fins permettent aux cellules de détecter le verre^{sous-jacent 15}. Avant de démonter le sandwich gel, vérifiez le mélange résiduel dans le tube de la microcentrifuge pour confirmer la polymérisation.
   6. Immergez le sandwich hydrogel dans du PBS pour séparer les couches. Assurez-vous que l’hydrogel reste attaché à la couche inférieure activée, et que la gaine supérieure hydrophobe se détache facilement.
3. Fonctionnalisation des hydrogels avec des ligands ECM
   REMARQUE : Toutes les étapes de cette section doivent être effectuées dans des conditions stériles à l’intérieur d’un cabinet de biosécurité.
   1. Stériliser les hydrogels en les immergeant dans 70 % d’éthanol, puis transférez-les dans des plastiques en culture tissulaire avec du PBS stérile.
      REMARQUE : Ne laissez pas d’hydrogels dans l’éthanol pendant une longue période, car cela déshydratera les gels et compromettrait la conjugaison de l’ECM.
   2. Préparez une solution de fonctionnalisation du mélange maître composée d’eau, d’éthanol, de HEPES et de bisacrylamide (Tableau 4).
      ATTENTION : La bisacrylamide est toxique à l’inhalation ou à l’ingestion.
   3. Préparez des solutions diluées de photoinitiateur UV et de tétraacrylate. Les deux réactifs sont dissous dans l’éthanol (Tableau 4).
      REMARQUE : Effectuez des dilutions en série de tétraacrylate à chaque fois, car des quantités excessives peuvent entraîner une surpolymérisation et des dépôts visibles de surface noire (voir Figure 3A).
   4. Peser la quantité requise d’acrylate NHS à l’aide d’une balance analytique. Resuspendez l’acrylate du NHS dans 50 % d’éthanol et 50 % d’eau juste avant utilisation.
      REMARQUE : Une quantité excessive d’acrylate NHS entraînera la formation de dépôts noirs visibles à la surface et peut entraîner un revêtement ECM irrégulier (Figure 3B).
   5. Ajoutez le photoinitiateur UV, le tétraacrylate et les solutions NHS-acrylate au master mix préparé à l’étape 1.3.2. Aspirez le PBS et ajoutez le mélange maître aux gels, en veillant à ce qu’ils soient bien couverts.
   6. Exposez les hydrogels (sans couvercles de vaisselle de culture tissulaire) à la lumière UV pendant 400 s (source de lumière UV avec une longueur d’onde inférieure à 365 nm).
      ATTENTION : Portez une protection oculaire appropriée lorsque vous travaillez avec la lumière UV.
   7. Retirez les gels et posez-les sur la glace. Aspirez la solution de fonctionnalisation, puis lavez les gels trois fois avec un HEPES stérile prérefroidi de 25 mM (pH 6,0), suivi de trois lavages avec un pré-refroidissement stérile de 0,9 % de NaCl.
   8. Incubez les hydrogels avec le ligand ECM de choix dans un HEPES stérile prérefroidi de 100 mM (pH 8,0) avec 100 mM de NaCl pendant la nuit à 4 °C sur un shaker orbitaire.
      REMARQUE : La concentration de ligands ECM peut être choisie à la discrétion de l’utilisateur ; Cependant, il est crucial de maintenir des concentrations identiques de ligands sur tous les substrats de rigidité variable au sein d’un même lot.
   9. Aspirez soigneusement la solution du ligand ECM 16 heures plus tard. Lavez les hydrogels trois fois avec du PBS et ajoutez un substrat de base sans sérum (ou PBS) pour les garder hydratés. Incubez les gels toute la nuit dans un incubateur de culture tissulaire pour vérifier la stérilité avant l’ensemencement des cellules.
      REMARQUE : Le milieu apparaîtra trouble après une incubation nocturne à 37 °C dans un milieu de culture de base si une contamination est présente.
   10. Utilisez immédiatement les gels pour la germination des cellules ou conservez-les à 4 °C dans un milieu de base pendant pas plus de 3 semaines.

2. Génération de substrats ECM à base de silicone mécaniquement accordables

1. Préparation des gaines de verre pour le revêtement au gel de silicone
   1. Nettoyez les gouverneaux en verre avec 3 M NaOH pendant 20 minutes.
   2. Lavez soigneusement avec de l’eau de haute qualité cinq fois et aspirez l’eau à la fin. Laissez-les sécher à l’air libre et utilisez un jet d’azote pour éliminer les gouttelettes ou débris restants.
2. Préparation du gel de silicone
   1. Pesez les composantes A et B de l’élastomère de silicone à deux composantes selon le rapport de poids spécifié dans le tableau 2, à l’aide d’une balance analytique. Utilisez une pointe de pipette coupée pour aspirer les solutions visqueuses.
   2. Mélangez soigneusement les composants A et B à l’aide d’une pointe de pipette pour assurer une incorporation complète.
   3. Dégazez le mélange dans une chambre à vide à 25 mmHg pendant 10 minutes.
3. Moulage en gel sur des bâtons de verre
   1. Placez une housse sur un tapis en caoutchouc positionné sur le décoiffeur de centrifugation, en veillant à ce qu’il soit bien centré.
      REMARQUE : Le tapis en caoutchouc assure un bon joint sous vide. Sans un joint adéquat, la toile de couverture peut être déplacée et se briser. Un mauvais centrage peut entraîner un revêtement non uniforme.
   2. Activez l’aspirateur pour fixer la gaine de protection.
   3. Ajoutez 100 μL de gel au centre de la housse. Couche centrifugée à 500 tr/min pendant 10 s, suivie de 8 000 tr/min pendant 60 s.
   4. Faites cuire la housse enduite à 80 °C pendant 2 heures. Laissez-la refroidir à température ambiante.
      REMARQUE : Conserver à température ambiante jusqu’à un mois avant utilisation.
4. Fonctionnalisation du gel de silicone avec des ligands ECM
   1. Exposez les gaines de protection recouvertes de gel silicone au plasma oxygène pendant 5 minutes à 11 W de puissance.
      REMARQUE : Une exposition au plasma à oxygène plus longtemps ou à une puissance supérieure peut provoquer des fissures des gels. La combinaison optimale de puissance et de temps peut devoir être testée selon l’équipement utilisé.
   2. Préparez une solution de silanisation contenant 95 % d’éthanol, 0,5 % d’APTES et 4,5 % de_{dH 2}O.
      REMARQUE : Effectuez toutes les étapes suivantes dans des conditions stériles à l’intérieur d’une armoire de biosécurité.
      ATTENTION : Aptes est toxique. Travailler avec des APTES dans une hotte à fumée avec des équipements de protection appropriés.
   3. Incubez la couche de couverture gel-enduit avec la solution de silanisation pendant 10 minutes.
   4. Lavez-le soigneusement avec du PBS cinq fois.
   5. Préparez la solution ECM contenant 100 μg/mL EDC et la MEE de choix à la concentration souhaitée dans PBS.
      REMARQUE : L’EDC est instable en solution et sensible à l’humidité. Préparez-le frais avant l’utilisation et conservez-le bien fermé dans un endroit frais et sec, à l’abri de l’humidité et du soleil direct.
      ATTENTION : L’EDC est nocif s’il est avalé et toxique s’il est inhalé. Portez des équipements de protection adaptés et travaillez dans une hotte à fumée.
   6. Incubez la couche de couverture avec la solution ECM pendant 1 heure à 37 °C ou toute la nuit à 4 °C.
   7. Lavez la feuille de couverture avec PBS cinq fois. Rincez avec un substrat de base et ajoutez les cellules.
      REMARQUE : La densité cellulaire optimale dépend de la lignée cellulaire spécifique et des objectifs expérimentaux (par exemple, subconfluent pour la morphologie ou monocouche pour l’adhésion cellule-cellule). Par exemple, une densité de 0,1 x 10⁶ cellules/cm² est couramment utilisée pour les fibroblastes afin d’atteindre une confluence de 50 % en 48 heures.

3. Préparation du substrat ECM pour l’immunocoloration et l’imagerie

1. Immunocoloration et imagerie sur des substrats à base de PA
   REMARQUE : Les hydrogels PA de dix-huit millimètres fournissent généralement une surface imaginaire suffisante pour une analyse quantitative. Pour les applications d’imagerie, couler les hydrogels et effectuer l’immunocoloration dans des « chambres orange » préparées à partir de tubes de 15 mL. Réutilisez les chambres orange pour plusieurs cycles de coulage et de coloration en gel, à condition que cela conserve une intégrité structurelle.
   1. Des bagues perforatrices à partir de film polycarbonate et de film en caoutchouc siliconique utilisant des perforations de 18 mm de diamètre extérieur et de 14 mm intérieures pour préparer les entretoises et joints.
   2. Découpez une ouverture au centre d’un bouchon de tube centrifugeuse de 15 mL à l’aide de ciseaux pour créer une chambre de coulage et de coloration en gel.
   3. J’ai vu le tube centrifugeuse à 14 mL. Coupez les bords irréguliers avec un scalpel et limez le bord du bouchon pour s’assurer qu’il tient dans une plaque standard à 12 trous.
   4. Assemblez le sandwich de revêtement hydrogel (comme décrit à la Section 1), en plaçant l’anneau d’entretoise sur le gaine activé.
   5. Démontez le sandwich une fois que les gels sont complètement polymérisés.
   6. Stériliser les hydrogels de 18 mm et transférer sur une plaque de culture tissulaire à 12 puits avec PBS stérile.
   7. Effectuer la fonctionnalisation des ligands ECM comme décrit à la section 1.
   8. Faites des cellules de semence et fixez-les avec 4 % de formaldéhyde.
      REMARQUE : Évitez les fixateurs à base d’alcool, car ils déshydratent les gels et compromettent l’intégrité structurelle.
      ATTENTION : Le formaldéhyde est toxique et doit toujours être utilisé à l’intérieur d’une hotte à vapeur.
   9. (Optionnel) Réassemblez les échantillons sur la chambre du bouchon du tube centrifuge. Utilisez un joint en silicone pour sceller la chambre.
      REMARQUE : Effectuez un test de fuite avec PBS pendant plusieurs heures avant de tacher. Bien que cette méthode puisse sembler plus laborieuse, elle favorise une coloration uniforme et réduit la consommation d’anticorps.
   10. Procéder à la coloration par immunofluorescence selon les protocoles préférés de l’utilisateur.
   11. Après la coloration, conservez les échantillons dans du PBS complétés avec 50 % de glycérol. Imagez les échantillons dès que possible.
       REMARQUE : Évitez les supports de montage standards qui durcissent, car ils peuvent fissurer les hydrogels avec le temps et endommager les échantillons. L’intensité de fluorescence diminue avec le temps ; Image dans la semaine pour une qualité de signal optimale.
   12. Placez une petite goutte de PBS (ou de support de montage) sur la surface du fond en verre d’une boîte de culture tissulaire. Inversez soigneusement les hydrogels colorés sur la goutte afin que les cellules soient orientées vers le verre de recouvrement, puis procédez à l’imagerie.
2. Immunocoloration et imagerie sur substrats ECM à base de silicone
   1. Fixez les échantillons à 4 % de formaldéhyde et colorez-les directement sur un plat à fond de verre en suivant un protocole d’immunofluorescence standard. Évitez les fixateurs à base d’alcool car ils fissureront les substrats de la MEC.
   2. Échantillonnez directement à l’aide d’un microscope à fluorescence traditionnel.

4. Récolte de protéines et d’ARN dans des cellules placées sur des substrats ECM

1. À l’aide de pinces, retirez soigneusement les gels de la cuve de culture et immergez-les dans un PBS stérile pour rincer les résidus de culture et le sérum.
   REMARQUE : Manipulez les couvertures avec précaution, car elles sont extrêmement fragiles et peuvent facilement se casser.
2. Tamponnez doucement le bord de l’hydrogel avec des lingettes à faible teneur pour éliminer l’excès de PBS.
3. Ajouter un volume approprié de tampon d’extraction d’ARN sur le couvercle d’une boîte de culture tissulaire.
   REMARQUE : Les réactifs à base de phénol-guanidine sont compatibles avec l’extraction d’ARN à partir de gels PA. Des tampons de lyse protéiques peuvent être utilisés selon les besoins expérimentaux. Visualisez les échantillons au microscope après l’incubation du tampon de lyse afin d’assurer une perturbation cellulaire complète.
4. Placez la housse (côté gel vers le bas) sur la solution de lyse. Soulevez et abaissez soigneusement l’hydrogel plusieurs fois pour assurer une lyse uniforme de toutes les cellules.
5. Grattez doucement la surface du gel pour libérer le lysat.
   REMARQUE : N’utilisez pas de grattoirs à cellules plastiques commerciales, car le plastique rigide pourrait endommager les hydrogels mous et contaminer le lysat avec des morceaux de gel. Le plastique souple utilisé pour fabriquer les entretoises (voir l’étape 3.1.1) convient à cet usage et peut être réutilisé pour fabriquer des grattoirs sur mesure.
6. Stockez l’ARN ou les lysats de protéines à -80 °C jusqu’à ce qu’il soit procédé à des méthodes biochimiques conventionnelles ou utilisez-les immédiatement.

5. Génération de la culture sphéroïde à un seul plan

1. Préparez l’hydrogel PA à 75 Pa sur des cache-bâtons de 18 mm et fonctionnalissez la surface avec un extrait de membrane basale (BME) ou un autre ligand ECM approprié pour faciliter l’attachement cellulaire.
2. Ajoutez les cellules de semence aux hydrogels ou gels de silicone recouverts d’ECM à la densité souhaitée.
3. Après 2 heures, retirez doucement les cellules non attachées et ajoutez une couche BME diluée dans un milieu basal prérefroidi.
   REMARQUE : Le BME polymérise en se réchauffeant. Préparez les embouts avant de pipeter. Le pourcentage de BME incorporé est déterminé par l’intégrité mécanique et la stabilité souhaitées de l’échafaudage 3D résultant.
4. Incuber les cultures à 37 °C dans un incubateur de culture tissulaire pendant 1,5 h afin de permettre la polymérisation BME.
5. Ajoutez doucement un milieu de culture cellulaire pour couvrir complètement les gels 3D.
6. Maintenir les cultures dans des conditions standard. Les cellules continueront de croître et de s’auto-assembler en sphéroïdes 3D au fil du temps jusqu’à atteindre le point d’arrivée expérimentale souhaité.

Résultats

La rigidité du gel PA générée à l’aide des formulations du Tableau 1 a été testée expérimentalement à l’aide d’un rhéomètre. Des gels avec des valeurs de rigidité nominale de 0,4 kPa, 6 kPa et 60 kPa, couvrant trois ordres de grandeur, ont été sélectionnés. Les valeurs mesurées de rigidité étaient de 363 ± 76 Pa pour les gels 400 Pa, 6,41 ± 0,50 kPa pour les gels 6 kPa, et 36 ± 8 kPa pour les gels 60 kPa (Figure 4A). Pour évaluer l’attache uniforme de la...

Discussion

Le protocole de fabrication ECM décrit offre un flux de travail reproductible, évolutif et rentable, et peut être facilement mis en œuvre dans la plupart des laboratoires. Bien que les ustensiles traditionnels en verre et en culture plastique soient pratiques et permettent une collecte rapide de données, les substrats synthétiques ne parviennent pas à reproduire la rigidité tissulaire physiologiquement pertinente. Des substrats mécaniquement accordables alternatifs tels que le polydiméth...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
(3-Aminopropyl)triéthoxysilane (APTES)	919-30-2	-	Thermo Fisher Scientific
Tubes microcentrifuge 1,7 mL	-	LMCT1.7B	FroggaBio
Plaques de culture de tissus, traitées, 12 puits	-	83.3921	Sarstedt
Tubes de centrifugation 15 mL (pour la chambre orange)	-	CLS430790	Corning
2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyéthoxy)-2-méthylpropiophénone (Irgacure)	106797-53-9	-	Thermo Fisher Scientific
Solution de bisacrylamide à 2%	110-26-9	-	Bio-Rad
3-(3-Dimethylaminopropyl)-1-éthylcarbodiimide chlorhydrate (EDC)	25952-53-8	-	Chem Impex International
4',6-Diamidino-2-phénylindole dihydrochlorure	28718-90-3	-	Sigma
4',6-Diamidino-2-phénylindole dihydrochlorure (DAPI)	-	D1306	Invitrogen
Solution d'acrylamide à 40%	01/06/1979	-	Bio-Rad
Glutaraldéhyde à 50%	111-30-8	-	Thermo Fisher Scientific
Culots de culture de tissus, traités, 6 cm	-	83.3901	Sarstedt
Cellules A549	-	CCL-185	ATCC
Ester d'acide acrylique N-hydroxysuccinimide	38862-24-7	-	Thermo Fisher Scientific
Anticorps anti-lapin Alexa Fluor 488	-	A11008	Invitrogen
Ester NHS d'Alexa Fluor 594 (tris(triéthylammonium salt))	-	A37572	Invitrogen
Persulfate d'ammonium	7727-54-0	-	Bio-Rad
Film en polycarbonate résistant aux chocs et transparent (0,005 po.; espaceur)	-	85585K72	McMaster-Carr
Gomme de silicone CY 52-276, composants A et B	2624028	-	Dow
Milieu de Dulbecco modifié de l'aigle (DMEM)	-	11995-065	Thermo Fisher Scientific
Éthanol, anhydre	64-17-5	-	Greenfield Canada
Mélange Fast SYBR Green	-	4385612	Thermo Fisher Scientific
Sérum bovin fœtal	-	A52567-01	Thermo Fisher Scientific
Fibronectine	-	356008	Corning
Formaldehyde (16%)	-	28908	Thermo Fisher Scientific
HEPES	7365-45-9	-	BioShop
Feuille de caoutchouc silicone haute température (0,020 po.; joint)	-	86435K452	McMaster-Carr
Acide chlorhydrique	7647-01-0	-	BioShop
Ensemble d'outils de poinçon à grands trous creux	-	66000	Mayhew Pro
Matrigel	-	356234	Corning
Flacon de stockage des milieux en verre borosilicaté, 250 mL	-	CLS1395250	Corning
Flacon de stockage des milieux en verre borosilicaté, 500 mL	-	CLS1395500	Corning
Plaque de réaction MicroAmp Fast Optical à 96 puits	-	4346906	Thermo Fisher Scientific
Lamelles de couverture de lame de microscope, diamètre 18 mm	-	72222-01	Electron Microscopy Sciences
Lamelles de couverture de lame de microscope, diamètre 50 mm	-	1.84E+16	eBay
PBS (1×)	-	14190144	Thermo Fisher Scientific
PBS (10×)	-	70011044	Thermo Fisher Scientific
Phalloïdine	17466-45-4	-	Biotium
Anticorps anti-phospho-FAK (Tyr397)	-	85567	Cell Signaling Technology
Anticorps anti-phospho-MLC (Ser19)	-	3671	Cell Signaling Technology
Nettoyeur à plasma	-	PDC-32G	Harrick Plasma
Primers qPCR (avant et arrière)	-	N/A	Integrated DNA Technologies
Kit de synthèse de cDNA qScript	-	95047	QuantaBio
Rain-X	-	-	Rain-X
Tubes à vis, base conique, 15 mL	-	62.554.101	Sarstedt
Tubes à vis, base conique, 50 mL	-	62.547.205	Sarstedt
Pipette sérologique, 10 mL	-	170356N	Thermo Fisher Scientific
Pipette sérologique, 25 mL	-	170357N	Thermo Fisher Scientific
Pipette sérologique, 5 mL	-	170355N	Thermo Fisher Scientific
Pipette sérologique, 50 mL	-	170358N	Thermo Fisher Scientific
Hydroxyde de sodium	1310-73-2	-	BioShop
Coloration de gel protéique SYPRO Ruby	-	S12000	Invitrogen
TEMED	110-18-9	-	Bio-Rad
Réactif TRIzol	-	15596026	Thermo Fisher Scientific
Chambre UV	-	165-5031	Bio-Rad