Caractérisation de la structure et de la fonction membranaire lipide-protéine à l’aide de bicouches d’interface de gouttelettes

Summary

Un protocole expérimental est présenté pour assembler, stimuler électriquement et analyser les bicouches d’interface de gouttelettes dopées à la gramicidine A. Les relations structure-fonction lipide-protéine sont quantifiées en mesurant les variations de la surface membranaire, du flux ionique et de la conductance à canal unique, et en reliant ces réponses à des changements de conduction ionique similaires à la plasticité dans un modèle membranaire inspiré par des synapses électriques.

Abstract

Les bicouches d’interface gouttelette (DIBs) offrent une plateforme accordable pour sonder les propriétés électromécaniques des membranes lipidiques et lipidiques sous stimulation électrique contrôlée. Les DIB permettent à la fois des mesures de conductance ionique à canal unique et en ensemble sur des surfaces membranaires plusieurs ordres de grandeur supérieures à celles accessibles par les techniques traditionnelles de patch clamp, permettant ainsi des analyses au niveau de la membrane de la déformation électromécanique et de son influence sur les peptides conducteurs d’ions. En accordant systématiquement la structure de la membrane à travers la phase hydrocarbure en vrac (par exemple, hexadécane [C16] vs. dodécane/hexadécane [C12/C16] [25 %/75 %, v/v]), cette plateforme ascendante permet une variation systématique de la composition membranaire et de l’environnement pétrolien, qui influence la viscoélasticité et la réorganisation structurelle de la membrane, et donc la conduction des ions peptidiques. Des procédures détaillées sont fournies pour l’assemblage des membranes 1,2-diphytanoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DPhPC) dopées à la gramicidine A-dopée (DPhPC) en utilisant différentes compositions d’huiles hydrocarbures et pour l’application de protocoles de tension-impulsion qui entraînent les membranes dans des états électromécaniques métastables. La conduction ionique par membrane adaptative est caractérisée, incluant des réponses de type plasticité à court terme (type STP) et de potentialisation et dépression à long terme (LTP/type LTD) dans un système membranaire modèle. Plus largement, ce protocole offre une approche robuste et reproductible pour étudier systématiquement les contributions électromécaniques dépendant de la composition et au niveau de la membrane au comportement conducteur de type synaptique et pour comprendre comment les environnements de membranes lipidiques modulent la fonction des canaux ioniques.

Introduction

Les membranes biologiques sont des structures supramoléculaires essentielles qui peuvent réguler la conduction ionique et permettre la communication entre neurones via les synapses électriques et ^chimiques 1,2,3,4.Ce type de communication est également contrôlé par la plasticité synaptique, où les changements structurels des synapses modulent leur force et leur persistance sur une plage de temps ^5,6, communément décrite en termes de plasticité à court terme (STP) et de potentialisation ou dépression à long terme (LTP ou LTD). Ces phénomènes, qui impliquent des changements dynamiques de la conductance membranaire en réponse à l’activité neuronale, sont souvent associés à la neuroplasticité⁷, qui sous-tend l’apprentissage et la mémoire⁸. Les modèles traditionnels de plasticité mettent souvent l’accent sur la régulation biochimique des canaux ioniques par la synthèse, le trafic ou la phosphorylation des protéines⁹. Cependant, le rôle des membranes plasmatiques neuronales dans les modèles de plasticité a, pour la plupart, été^{négligé 10,11}.

Les méthodes de patch-clamp sont utilisées depuis plus d’un demi-siècle pour étudier l’électrophysiologie du canal ionique unique. Cependant, ils ne peuvent interroger que des zones membranaires bien plus petites que les synapses intactes ou les modèles synthétiques à grande échelle. En tant que tels, ils posent une limitation technique pour l’étude de la réorganisation et de la déformation des membranes mésoscale. La mésoéchelle est de plus en plus reconnue comme une échelle de longueur critique pour comprendre de nombreux aspects de la biophysique membranaire^12,13.

Une méthodologie est présentée pour utiliser les bicouches d’interface de gouttelettes (DIBs) 1,2-diphytanoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DPhPC)^14,15 dopées avec l’ionophore monovalent peptide cationique, gramicidine-A (gA), afin de modéliser la conduction ionique, un peu comme ce qui se produit dans une synapse électrique. Ce système présente plusieurs avantages clés : (i) les DIB fournissent une plateforme lipidique et pétrolière accordable permettant une réorganisation systématique des^{membranes 16} ; (ii) Les DIB permettent d’étudier des événements à canal unique et ensemble sur une gamme d’échelles de longueur^17,18 ; et (iii) les DIB permettent d’interroger des patchs membranaires de taille^{submillimétrique 2} qui capturent la restructuration collective de membranes induite électromécaniquement, tout en préservant la capacité de résoudre les événements de conduction ionique^{à canal unique 19,20}. Cette méthode convient particulièrement aux études nécessitant une interrogation simultanée électrique et optique de l’électromécanique membranaire sur des surfaces membranaires plus grandes que celles accessibles par le patch clamp conventionnel, tout en conservant la capacité de résoudre des événements de canal discrets. Il est particulièrement utile lorsque l’objectif expérimental est d’examiner comment la composition des membranes, l’environnement pétrolier et les formes d’onde de tension imposées influencent la restructuration collective des membranes et la conduction peptidique. La méthode est moins adaptée aux expériences nécessitant une architecture cellulaire native ou des lectures moléculaires directes des changements conformationnels des protéines dans des membranes biologiques^intactes 19,20,21.

En appliquant une stimulation électrique physiologiquement pertinente, les DIB sont poussés vers des états stationnaires hors d’équilibre dans lesquels la restructuration électromécanique dynamique modifie la conduction des canaux ioniques peptidiques. Ces changements émergents dans la conduction ionique sont descriptivement analogues aux phénomènes neurologiques STP, LTP et LTD discutés dans^{les neurosciences} 22,23,24. Dans la présente étude, ces comportements sont principalement interprétés comme des réponses physiques au niveau de la membrane à la stimulation électrique associées aux propriétés mécaniques intrinsèques des membranes, telles que la viscoélasticité et la compressibilité dans un système de membranes^{modèle 25}. Notamment, l’étude décrite ici s’appuie sur des preuves antérieures selon lesquelles les bicouches lipidiques peuvent présenter une mémoire électrique fondamentale par des décalages persistants de conductance et un stockage de charge capacitive après^stimulation 14,15,25,26,27,28,29,30,31,32,33^{, 34}, offrant de nouvelles perspectives sur les mécanismes par lesquels les bicouches lipidiques peuvent soutenir une fonctionnalité adaptative, semblable à la synaptique, en l’absence de mécanismes cellulaires complexes. Enfin, cette méthodologie permet également d’examiner directement les relations structure-fonction et comment le comportement émergent à l’échelle macroscale découle d’une simple réorganisation^structurelle 21,25,27.

Protocol

Nettoyez soigneusement tous les verrages et équipements préparatoires avec des détergents de laboratoire appropriés et rincez à l’eau distillée avant la préparation de l’échantillon. Portez des lunettes de sécurité en permanence ainsi que des gants en nitrile ou en latex pour éviter toute contamination. Éliminer tous les déchets chimiques conformément aux directives de sécurité institutionnelles. Veillez à ce que les solvants volatils soient correctement stockés conformément aux directives de sécurité institutionnelles. Assurez-vous que l’espace et le matériel du laboratoire d’expérimentation (Figure 1A), le récipient d’expérimentation (Figure 1B) ainsi que les connexions électriques et optiques (Figure 1C) restent dégagés et dégagés de tout obstacle.

1. Préparation d’une solution tampon aqueuse

1. Pèser la quantité appropriée d’acide propanesulfonique 3-(N-morpholino) (MOPS) et de chlorure de potassium (KCl) pour obtenir les concentrations finales souhaitées (par exemple, 10 mM MOPS, 0,1 M KCl dans 500 mL).
2. Ajoutez le MOPS et le KCl à ~450 mL d’eau distillée dans une fiole volumétrique de 500 mL ou un cylindre gradué, puis mélangez avec une barre magnétique jusqu’à ce que la dissolution soit complète.
3. Mesurez le pH avec un pHömètre calibré. Ajustez le pH à 7,4 en ajoutant 1 M d’hydroxyde de potassium (KOH) ou d’acide chlorhydrique (HCl) par incréments de 0,25 mL tout en remuant continuellement.
4. Portez le volume total à 500 mL avec de l’eau distillée et mélangez soigneusement. Transférez le tampon dans une bouteille propre et étiquetée, scellez-le et conservez à 4 °C.
   REMARQUE : Utilisez le tampon jusqu’à ~2 mois. Vérifiez et réajustez le pH à 7,4 avant chaque utilisation.

2. Préparation de la solution de bouillon de gramicidine

1. Dans une hotte chimique, ajoutez 5 mg de gramicidine A (gA) à un flacon en verre propre de 20 mL. Ajoutez 10 mL de méthanol à l’aide d’une seringue étanche en verre ou au gaz et faites du vortex jusqu’à ce que le peptide soit complètement dissous. Étiquetez le flacon comme « stock gA » et conservez à -80 °C.
   REMARQUE : Les expériences d’ensemble utilisent des rapports lipides : molaires peptidiques de ~1:^10-4. Les expériences à canal unique utilisent un peptide ~10 à 100 fois plus bas (1:^10-5–^10-6) pour résoudre des événements individuels en temps d’enregistrement courts (<1 min). La préparation d’un fond dilué améliore la précision du pipetage à faibles rapports molaires (< ~ 1:^10-4).
2. Purgez deux fioles en verre propres supplémentaires de 20 mL avec du gaz argon pendant ~5 secondes chacune pour enlever la poussière.
3. À l’aide d’une seringue propre étanche, injectez 9,9 mL de méthanol dans chaque fiole purgée.
4. Pipeter 100 μL de la solution stock de gA avec une seringue stérile étanche au gaz dans un flacon pour obtenir un volume total de 10,0 mL. Étiquetez cette fiole comme « A ». Concentration = 2,66 μM gA dans le méthanol.
5. Pipettez 100 μL de solution « A » dans le second flacon en verre pour obtenir un volume total de 10,0 mL. Étiquetez ce flacon comme solution « B ». Concentration = 26,6 nM gA dans le méthanol.
6. Scellez les fioles avec des capuchons et enveloppez avec du parafilm.
7. Conservez toutes les solutions de gA à -80 °C jusqu’à utilisation.

3. Préparation de vésicules lipidiques-peptidiques

1. Purgez un flacon en verre propre de 20 mL avec du gaz argon pendant ~5 s.
2. Ajoutez 4 mg de lipide 1,2-diphytanoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DPhPC) lipide dans le flacon.
3. Dans une hotte à fumée, ajoutez 1 mL de méthanol à l’aide d’une pipette en verre. Faites doucement tournoyer ou transformer le vortex jusqu’à ce que tous les lipides soient dissous.
4. À l’aide d’une seringue étanche au gaz de 500 μL, ajoutez 178 μL de solution « A » (pour les expériences STP au niveau de l’ensemble ; Rapport molaire DPhPC :gA = 1:^10-4) ou 890 μL de solution « B » (pour les expériences à canal unique ; Rapport molaire DPhPC :gA = 1:5×^10-6) dans la solution de méthanol DPhPC. En douceur pour mélanger en vortex.
5. Sous un doux jet d’argon dans la hotte, évaporez le méthanol jusqu’à ce qu’un film lipidique fin et uniforme se forme au fond du flacon.
6. Placez le flacon ouvert dans un four à vide à 40 °C et tirez un vide complet pendant 10 à 12 heures ou toute la nuit pour éliminer les résidus de solvant.
7. Retirez le flacon du four sous vide et ajoutez 2 mL du tampon KCl à 0,1 M préparé dans la Section 1 pour les expériences STP, ce qui donne une concentration finale de lipides et de gramicidine en suspension de 2,36 mM et 236 nM, respectivement. Pour les expériences à canal unique, ajouter 2 mL d’un tampon KCl de 1 M comme préparé dans la Section 1. Vortex pour réhydrater le film lipidique et obtenir une suspension lipidique de 2 mg/mL, aboutissant à une concentration finale de lipides et de gramicidine en suspension de 2,36 mM et 11,8 nM, respectivement.
8. Congelez le flacon à -80 °C pendant au moins 6 minutes, puis décongelez-le sur une plaque chauffante ou un bain marie à 40 °C pendant 6 minutes. Vortex brièvement pour mixer. Répétez ce cycle de gel-dégel six fois pour favoriser la formation de vésicules multilamellares.
9. Assemblez une extrudeuse vésicule lipidique avec une membrane gravée sur piste de 0,1 μm de diamètre en suivant les instructions du fabricant. Faites passer 500 μL de tampon à travers l’extrudeur trois fois pour hydrater la membrane, vérifiez qu’il n’y a pas de fuites, puis jetez le tampon.
10. Chargez 1 mL de la suspension lipidique décongelée dans l’extrudeur et effectuez 31 passages à travers la membrane de 0,1 μm pour obtenir des vésicules unilamellaires de ~100 nm de diamètre et assurer une homogénéité de taille.
11. Transférez les vésicules extrudées (grandes vésicules unilamellaires, LUV) dans un tube PCR de 1 mL, marquez et stockez à 4 °C. À utiliser dans les deux semaines suivant la préparation.
12. Scellez toute suspension lipidique non extrudée restante dans le flacon d’origine, enveloppez de parafilm et conservez-la à -80 °C pour une utilisation ultérieure.
13. Si vous utilisez des échantillons précédemment congelés et non extrudés, refondez à 40 °C à l’aide d’une plaque chauffante ou laissez l’échantillon chauffer à température ambiante, puis extrudez l’échantillon.

4. Préparation du gel d’agarose

1. Placez un bécher en verre propre de 50 mL sur une plaque chauffante. Ajoutez un comprimé d’agarose à 50 mL du même tampon utilisé pour hydrater le film lipidique (par exemple, 10 mM MOPS, 0,1 M KCl, pH 7,4) pour former une solution gelée d’agarose à 1 %.
2. Ajoutez une barre de mélange en Téflon propre et remuez vigoureusement jusqu’à ce que le comprimé se disperse.
3. Couvrez le bécher avec du papier aluminium et percez un petit trou d’évent avec une spatule métallique. Réglez la température de la plaque chauffante à 220–230 °C. La solution deviendra claire et atteindra une ébullition progressive, indiquant la dissolution complète de l’agarose.
4. Éteignez le feu et retirez soigneusement le papier aluminium. Parcourez n’importe quel film de surface avec une spatule métallique propre. Utilisez immédiatement la solution d’agarose chaude pour le revêtement d’électrodes ou laissez-la refroidir et solidifier dans le bécher pour une utilisation ultérieure.
5. Après le revêtement d’agarose par électrode, couvrir l’agarose solidifiée avec du papier aluminium, sceller avec du parafilm, marquer et stocker à 4 °C. Quand besoin, réchauffez jusqu’à ébullition en remuant jusqu’à ce que ce soit complètement refondu.

5. Préparation des électrodes

1. Coupez un fil d’argent de 0,125 mm de diamètre en ~70 mm de longueurs pour les électrodes de tête et ~130 mm pour les électrodes de masse.
2. À l’aide d’une flamme ouverte (par exemple, un briquet portatif ou un bec Bunsen), maintenez une extrémité de chaque fil d’argent horizontalement dans le cône central le plus chaud de la flamme jusqu’à ce que la pointe fonde et forme une boule sphérique de ~0,2 mm de diamètre (Figure 2A).
3. Placez les fils sur une surface propre et vérifiez au microscope que les billes sont sphériques et de taille similaire. Si une boule est oblongue ou irrégulière, coupez la pointe et répétez la fusion (étape 5.2).
4. Placez les extrémités des deux fils d’argent dans un récipient en verre contenant de l’eau de Javel fraîche (hypochlorite de sodium, NaClO). Assurez-vous que les boules sont complètement immergées et incubez pendant au moins 1 heure pour chlorer la surface et former Ag/AgCl. Un aspect brun-gris terne confirme la réussite de la chloration (Figure 2B).
5. Retirez les fils de l’eau de Javel une fois que les extrémités de la boule sont gris terne, rincez soigneusement avec de l’eau distillée, puis posez-les sur une surface propre et sans peluches pour les faire sécher.
6. Procurez-vous un porte-pipette de tête et un porte-électrode de terre. Coupez en deux un capillaire en verre borosilicate de 100 mm (1,0 mm de diamètre extérieur, 0,58 mm de diamètre intérieur) à l’aide d’un coupe-verre.
7. Insérez un demi-capillaire dans le porte-pipette de tête et serrez le support pour le fixer. Montez un capillaire complet de 100 mm sur le support d’électrode au sol et fixez-le.
8. Insérez l’extrémité non sphérique du fil d’argent de 130 mm dans le capillaire de l’électrode de masse jusqu’à ce que ~20 mm de l’extrémité à boule dépassent. Collez l’extrémité opposée du fil au support, en laissant ~5 mm exposés pour la mise à la terre.
9. Répétez l’étape suivante avec un fil de 70 mm pour l’électrode de la tête de scène, en assurant un contact ferme entre le fil et le connecteur de la tête de tête (pièce dorée). Coupez tout fil excédentaire à l’extrémité du connecteur de la tête de l’étage.
10. Trempez chaque boule d’argent chlorée dans l’agarose, juste au-dessus de la jonction boule-arbre, pour former un revêtement fin et uniforme. Faites au moins 10 plongées dans les dedans.
11. Retirez l’électrode et laissez l’agarose gélifier à température ambiante. Répétez le trempage si nécessaire pour obtenir une coquille lisse et uniforme d’agarose de plusieurs dizaines de micromètres d’épaisseur. Évitez de revêtir le fil trop haut ou trop bas (Figure 2C).
12. Montez la tête d’étage et les électrodes de terre sur des micromanipulateurs. Connectez le fil de terre exposé (~5 mm) à la masse de l’amplificateur à l’aide d’une pince crocodile.
13. À l’aide d’une pince à épiler, pliez doucement chaque électrode à mi-chemin entre l’extrémité sphérique et le capillaire afin que l’extrémité à boule soit perpendiculaire à l’étage du microscope. Évitez les courbures supérieures à 90° afin de minimiser la distorsion optique dans les vues du microscope, tant visuelles que vidéo.
14. Ajustez l’orientation des électrodes dans leurs supports de sorte que les extrémités à boule recouvertes d’agarose soient perpendiculaires au plan d’imagerie du microscope (Figure 3A).

6. Formation des bicouches d’interface de gouttelettes (DIBs)

1. Placez une boîte de Petri propre et à fond transparent sur la platine d’un microscope inversé. Remplissez la plaque d’huile d’alcane (par exemple, 100 % d’hexadécane, ou 25 %/75 % v/v dodécane/hexadécane) à une profondeur de ~ 5 mm (Figure 1B).
2. À l’aide des contrôles du micromanipulateur, descendez les deux extrémités de la boule recouvertes d’agarose dans l’huile à une profondeur de ~2,5 mm sous la surface de l’huile. Évitez les mouvements rapides avec le micromanipulateur pour éviter les collisions entre électrode et la tête de la boule avec la boîte de Petri.
3. Ajustez la mise au point du microscope jusqu’à ce que les deux extrémités de la boule et leurs revêtements en agarose soient nettement nettes. Placez les électrodes près du bord du champ de vision afin que les deux puissent être observées simultanément.
4. À l’aide d’une pipette calibrée de 2 μL, aspirez la suspension vésiculaire lipidique peptidique extrudée. Distribuez lentement 250 nL de la suspension directement sur chaque extrémité à boule recouverte d’agarose à l’aide d’une pointe de pipette séparée pour chacune, sans toucher la coquille d’agarose avec la pointe de la pipette.
   REMARQUE : Pour minimiser les vibrations des mains et augmenter la stabilité, ancrez les deux coudes sur le rebord anti-vibration de la table. Stabiliser le poignet pipetteur avec la main non pipetante, immerger lentement la pipette dans l’huile, puis approcher progressivement l’électrode. Une brève retenue de souffle lors du chargement des gouttelettes peut encore réduire les mouvements imprévus.
5. Laissez les gouttelettes se répandre et recouvrir la coque d’agarose et s’affaisser de l’électrode sous la gravité. Observez l’affaissement latéral à travers la paroi de la boîte de Petri si c’est clair (Figure 3B).
   REMARQUE : Le temps nécessaire pour l’affaissement des gouttelettes dépend de la répartition de la taille de la vésicule, de la température et de la topographie de l’agarose. Pour les DIB DPhPC, attendez au moins 5 minutes après le dépôt de^{gouttelettes 15}.
6. Poussez doucement la table anti-vibration pour évaluer la préparation aux gouttelettes. Confirmez que les gouttelettes affaissantes se déplacent avec un léger délai par rapport au mouvement de l’électrode, indiquant la formation de gouttelettes lipidiques monocouches entièrement recouvertes.
   REMARQUE : Le mouvement retardé se produit parce que la formation d’une monocouche lipidique autour de la gouttelette aqueuse réduit significativement la tension superficielle, retardant ainsi la réponse physique lors du déplacement de l’électrode dans l’huile.
7. Si ce comportement n’est pas observé, attendez 2 à 3 minutes supplémentaires et répétez le processus.

7. Installation électrique et surveillance bicouche (visuelle et électrique)

1. Assurez-vous que le microscope, la table antivibration, la cage de Faraday et tous les composants électriques, y compris l’amplificateur, le numériseur, le générateur de fonctions et l’ordinateur, sont connectés à une masse commune (Figure 1).
2. Organisez les connexions de l’instrument selon le guide de réglage du fabricant. Utilisez la Figure 1C comme référence schématique pour la configuration électrique et optique essentielle. Consultez les instructions détaillées sur la mise à la terre³⁵, la configuration matérielle/logicielle et l’ajustement du décalage de la pipette pour les expériences DIB.
   REMARQUE : Suivez les instructions de configuration spécifiques à chaque équipement pour tous les logiciels et matériels listés dans le tableau des matériaux.
3. Connectez les électrodes de tête et de masse à l’amplificateur patch-clamp.
4. Configurez un générateur de fonctions externe (ou le canal de sortie du logiciel d’acquisition) pour générer une forme d’onde de tension triangulaire de 10 Hz et 10 mV. Confirmez l’amplitude et la fréquence sur un oscilloscope connecté et à l’intérieur du logiciel d’acquisition.
5. Après que les gouttelettes se soient affaissées pendant ~ 10 minutes, utilisez les micromanipulateurs pour amener les deux gouttelettes en contact doux. Ajustez la position des électrodes de sorte que la surface de contact des gouttelettes ne dépasse initialement pas ~ 1/^{4 de leur} diamètre.
6. Allumez la forme d’onde triangulaire 10 Hz, 10 mV et surveillez la réponse capacitive au courant avec l’amplificateur et le logiciel d’acquisition.
7. Attendre la formation spontanée de la bicouche, indiquée électriquement par une réponse capacitive en expansion de pic à pic et optiquement par une réflexion interne croissante (apparence ovale) due au contact de la bicouche (Figure 4). Confirmer que les bicouches lipidiques pures présentent des plateaux rectangulaires de courant au stimulus de tension triangulaire, tandis que les bicouches dopées à gA à ~1:^10-4 lipides : peptides présentent des plateaux inclinés réfléchissant la conduction ionique en ensemble.
8. Ajustez la surface de contact des gouttelettes en déplaçant légèrement les électrodes jusqu’à ce que la réponse du courant capacitif pic à crête à la forme d’onde triangulaire de 10 Hz, 10 mV soit comprise entre ~100 et 200 pA pour des diB de ~250 nL dans les huiles C16 ou C12/C16, correspondant à une plage de capacité de ~250–500 pF³³.
   REMARQUE : Des impulsions à haute fréquence ou des tensions de maintien en courant continu non nulles peuvent induire un effet électromouillant et une expansion excessive de la bicouche, entraînant la coalescence des gouttelettes et la rupture de la bicouche. La plage de 100–200 pA offre un équilibre entre la stabilité bicouche et le rapport signal/bruit, permettant une expansion suffisante de la surface lors de la stimulation.
9. Si le DIB se fusionne, soulevez les électrodes de l’huile. Rincez soigneusement les tampons d’électrodes avec le même tampon aqueux utilisé pour les échantillons lipidiques et l’agarose.
10. Retirez toutes les gouttelettes aqueuses de la boîte de Petri avec une seringue stérile. Remplissez avec de l’huile fraîche si besoin, re-plongez les électrodes. Rechargez la solution LUV sur les électrodes comme décrit à la Section 6 et répétez le processus.
11. Une fois les réponses capacitives ou conductrices stables confirmées, désactivez la forme d’onde triangulaire et laissez le DIB s’équilibrer pendant au moins 15 minutes avant d’appliquer les protocoles de stimulation.

8. Protocoles de stimulation électrique

1. Expériences d’impulsions (réponses d’ensemble de type STP et LTP / LTD)
   1. Configurez le générateur de fonctions ou le logiciel d’acquisition pour fournir des impulsions de tension de l’amplitude, de la durée et de l’intervalle inter-impulsions souhaitées (par exemple, les schémas PPF [facilitation par impulsions en paire] et PPD [dépression par impulsions en paire]).
   2. Ouvre le logiciel de capture vidéo. Sélectionnez les réglages appropriés de l’appareil photo et de l’objectif objectif. Réglez le taux d’images par seconde à au moins 20 images/s et confirmez qu’il reste stable pendant l’enregistrement.
   3. Dans le logiciel d’acquisition de données, réglez la fréquence d’échantillonnage à au moins 5 kHz pour le signal actuel.
   4. Cliquez sur Acquérir > nouveau protocole pour en créer un autre, ou sur Acquérir > Modifier le protocole pour modifier un protocole existant. Dans l’onglet Mode acquisition, sélectionnez Stimulation épisodique. Mets les courses/essai à 1 et les balayages/course à 1.
   5. Réglez la durée du balayage à 4 s de plus que la durée totale de l’expérience. Pour un protocole STP de 120 s (60 s PPF + 60 s PPD), réglez la durée du balayage à 124 s pour permettre une ligne de base de 2 s avant et après le stimulus.
   6. Dans l’onglet Entrées , assignez le canal d’enregistrement à l’entrée actuelle. Dans l’onglet Sorties , attribuez le canal de stimulation à la tension de sortie contrôlant les électrodes.
   7. Ouvre l’onglet Forme d’onde . Dans la colonne A, réglez Type à Étape, Premier Niveau à 0 mV, et Première Durée à 2000 ms pour définir une base de pré-stimulation.
   8. Dans la colonne B (PPF), définissez Type à Step. Spécifiez l’amplitude de tension souhaitée (par exemple, +100 mV), la durée de l’impulsion (par exemple, 100 ms) et le taux de train pour définir l’intervalle inter-impulsions correspondant au cycle de travail cible (par exemple, 90,9 %).
   9. Dans la colonne C (PPD), on règle de manière similaire Type à Step avec la même amplitude et durée d’impulsion, mais en augmentant le Train Rate ou l’intervalle d’interimpulsions pour obtenir le cycle de travail plus bas souhaité (par exemple, 28,6 %).
   10. Dans la colonne D, configurez une base post-stimulation identique à la colonne A (0 mV, 2000 ms).
       REMARQUE : Si la durée totale de toutes les époques dans l’onglet Forme d’onde dépasse la durée de balayage dans l’onglet Mode/Débit , augmentez légèrement la durée de balayage jusqu’à ce que l’erreur disparaisse.
   11. Sauvegardez le protocole avec un nom descriptif (par exemple, « STP_120s »).
   12. Commencez l’enregistrement vidéo, puis lancez immédiatement l’acquisition/stimulation électrique en cliquant sur le bouton cercle rouge « Enregistrer » pour enregistrer les données. Sinon, configurez un déclencheur numérique de sorte que l’activation de la stimulation déclenche simultanément l’enregistrement vidéo et l’acquisition électrique.
   13. Pour les 60 premiers s de stimulation (PPF), la réponse au courant mesurée augmente généralement à partir de la première impulsion et peut atteindre un plateau visible de t = 60 s, tandis que pour les 60 derniers s de stimulation (PPD), la réponse au courant mesurée diminue généralement (Figure 5). À la fin du protocole, arrêtez simultanément l’acquisition électrique et l’enregistrement vidéo.
2. Expériences à canal unique
   1. Sur le panneau avant de l’amplificateur à pince de patch, réglez l’interrupteur d’entrée de commande externe sur OFF. Réglez la tension de maintien à +200 mV. Réglez le filtre passe-bas intégré de l’amplificateur à 1 kHz. Dans le logiciel d’acquisition, réglez la fréquence d’échantillonnage à 10–50 kHz et sélectionnez un mode d’enregistrement continu « sans interruption ».
      REMARQUE : Des taux d’échantillonnage élevés peuvent réduire le rapport signal/bruit des données acquises. Utiliser des taux d’échantillonnage plus élevés lors de la résolution de transitions rapides de gating ou d’états de scintillement de courte durée est important. Les durées de vie ouvertes moyennes de la gramicidine A sont généralement comprises entre 0,1 s et 10 s, tandis que les états de scintillement peuvent se produire sur des échelles de temps sub-ms et μs ; par conséquent, des taux d’échantillonnage de ~50 kHz peuvent être nécessaires pour capturer de tels^{événements 36}. L’analyse d’idéalisation monocanal ultérieure avec JSMURF permet une détection robuste des événements sur des enregistrements avec des rapports signal/bruit variables³⁷.
   2. Sans commande externe appliquée, commencez à enregistrer le signal courant de base. Sur l’amplificateur, basculez la commande de tension de OFF à « + » pour appliquer une tension DC de +200 mV sur le DIB.
   3. Record de ~15 s pour capturer des événements à canal unique tout en limitant la dérive de base. À la concentration molaire lipide :gA de 1:5×^10-6_, le courant enregistré apparaît en escalier en raison de la formation et de l’élimination des événements de guidage de conductance des canaux.
   4. Avant d’arrêter l’enregistrement, basculez la commande Voltage de « + » à OFF. Arrêtez l’acquisition de données et enregistrez l’enregistrement avec un nom de fichier descriptif (par exemple, « DIB_C16_postPPF_200mV.abf »).
      REMARQUE : Les enregistrements à canal unique de durée définie peuvent également être réalisés via une stimulation épisodique programmée, avec une amplitude et une durée fixes comme décrit à la Section 8 pour le PPF/PPD. Pour les expériences « post-PPF » à canal unique, la stimulation épisodique avec une tension continue de +200 mV est immédiatement ajoutée après les 60 s de PPF.

9. Extrapolation de la surface membranaire et du flux

1. À la fin de chaque expérience d’ensemble (STP, LTP/LTD), déplacez lentement une électrode latéralement avec les micromanipulateurs pour détacher le DIB.
2. Desserrez le support d’électrode du micromanipulateur et faites tourner l’électrode dans son support de ~45° de sorte que le fil d’argent de 125 μm soit placé dans le plan d’imagerie.
3. Ajustez la hauteur de l’électrode jusqu’à ce que le fil soit nettement net sous le microscope. Capturez une image fixe ou une capture d’écran du fil argenté focalisé avec le logiciel de la caméra. Sauvegardez l’image à l’échelle pour une calibration ultérieure de la taille des pixels en millimètres.
4. Traiter les traces de courant enregistrées selon les procédures décrites dans la réf. 28 afin d’obtenir des données courantes en fonction du temps continues et sans artefact (Figure 6A).
5. Déterminez la correspondance frame-time en divisant les indices d’images par la fréquence d’images mesurée et en les associant aux horodatages d’acquisition.
6. Importez l’image d’étalonnage de l’échelle et les images d’expérience dans un logiciel d’analyse d’images.
7. Utilisez le diamètre du fil connu (125 μm) à partir de l’image d’étalonnage de l’échelle pour définir l’échelle spatiale à l’aide de la fonction d’étalonnage logiciel (Analyser > Régler l’échelle).
8. Pour les calculs de flux pour chaque expérience, choisissez N points temporels couvrant la période totale de stimulation (par exemple, 30 points temporels sur l’expérience de 120 s). Assurez-vous que le premier point de temps corresponde à la première impulsion de stimulus.
9. À chaque point temporel, mesurez le diamètre du DIB en traçant une ligne à travers l’intersection des bords bicouches et en enregistrant sa longueur en unités calibrées.
10. Convertir chaque diamètre mesuré en surface de membrane (A), en supposant une géométrie circulaire ou en utilisant le facteur d’échelle géométrique ellipse approprié pour la configuration lipide-huile spécifique. Utilisez les zones résultantes pour évaluer l’évolution de la surface membranaire au fil du temps selon les conditions expérimentales (Figure 6B).
11. Pour chaque point temporel, divisez la valeur de courant correspondante par la surface pour obtenir le flux (I/A). Divisez tous les N points de données de flux par la première valeur de flux pour obtenir un flux normalisé à la première impulsion, (I/A) / (I₀/A_0), lorsque l’analyse de flux normalisée est souhaitée (Figure 6C).
12. Tracer flux ou flux normalisé vs temps ou nombre d’impulsions vs temps. Analyse de flux répétée pour toutes les expériences d’ensemble (STP, LTP/LTD) (Figure 6D).
13. Interprétez les élévations persistantes du flux ou du flux normalisé par rapport à la première impulsion pendant la DPP ou au-delà de 2 minutes comme une conduction améliorée, tandis que les retours à la base ou les diminutions en dessous de la valeur de la première impulsion indiquent une conduction déprimée. Utilisez les échelles de temps résultantes pour classer les réponses en comportements de type plasticité à court terme (<2 min) ou de type potentialisation / dépression à long terme (> ~5 min).

10. Analyse monocanal

1. Importez des enregistrements bruts à canal unique dans un environnement d’analyse préféré ou l’interface clampSeg et consultez^{le point 37} pour des descriptions complètes et des explications des fonctions logicielles.
2. Appliquer un filtre passe-bas numérique correspondant au filtre d’acquisition expérimental (par exemple, Bessel à 1 kHz).
3. Configuration des paramètres.
   1. Définissez alpha (α) = 0,05, définissant le niveau de confiance statistique tel que chaque étape détectée ait <5 % de probabilité d’être une fluctuation aléatoire du bruit.
   2. Spécifiez 5 000 à 10 000 itérations de Monte Carlo par segment de 1 s pour estimer la distribution du bruit et améliorer la robustesse statistique de la détection d’événements.
      REMARQUE : Utilisez un traitement computationnel parallèle par « chunks » de 1 s si possible afin de réduire le temps d’analyse.
   3. Exécutez l’algorithme JSMURF sur la piste de courant filtrée.
4. Validation du modèle.
   1. Superposez la trace de conductance idéalisée (ondes carrées) sur la piste de courant filtrée et confirmez visuellement que les transitions en escalier coïncident avec des changements brusques du signal expérimental.
   2. Utilisez les caractéristiques connues du filtre passe-bas pour générer une reconstruction convolutive de la piste idéalisée et superposez-la sur la piste^{brute 37}. Confirmez que le signal reconstruit correspond étroitement à l’enveloppe de synchronisation et d’amplitude du courant enregistré.
5. Quantification de la conductance et des durées de vie.
   1. Définissons le plateau stable le plus bas dans la trace idéalisée comme l’état de base fermé. Identifier l’amplitude du premier plateau non nul comme la conductance primaire à l’état ouvert (niveau à canal unique).
   2. Classez les multiples entiers supérieurs de cette amplitude comme des états ouverts multi-canaux (2+, 3+, etc.). Identifiez les plateaux intermédiaires stables mais inférieurs aux étendues ouvertes complètes comme états de sous-conductance.
   3. Extraire l’amplitude et la durée de chaque événement de la piste idéalisée et les mettre en bining pour générer des histogrammes d’amplitude conductance et des histogrammes à durée de vie.
6. Histogrammes d’amplitude et distributions sur la durée de vie
   1. Comparez les histogrammes idéalisés conductance-amplitude avec les histogrammes d’amplitude générés directement à partir des données filtrées. Confirmez que les histogrammes idéalisés affichent des pics plus nets et mieux séparés correspondant aux états de conductance^{discrets 37}.
   2. Pour chaque condition expérimentale, on calcule la fonction de survie N(t)/N(0), où N(0) est le nombre total d’événements ouverts (plein et sous-conductance) et N(t) est le nombre d’événements dont la durée est supérieure à t. Excluez les intervalles d’état fermé de cette analyse.
   3. Tracez N(t)/N(0) en fonction du temps et ajustez les fonctions de désintégration exponentielle en utilisant une routine de moindres carrés non linéaires dans un logiciel préféré.
   4. Interprétez les décalages à droite des pics de distribution de conductance dans les histogrammes d’amplitude comme une conductivité accrue, des constantes de temps de désintégration plus longues dans N(t)/N(0) versus les graphiques temporels comme une stabilité accrue à l’état ouvert, et les distributions décalées à gauche comme des durées de vie plus courtes des canaux.
      REMARQUE : Minimisez les perturbations environnementales telles que les courants d’air, les vibrations et les objets en mouvement à proximité. Évitez de vous appuyer sur la table optique et éloignez les conversations de la configuration expérimentale. Gardez les téléphones portables, tablettes, ordinateurs portables et autres appareils électroniques personnels à au moins 1,5 m de la cage de Faraday pour réduire les interférences électromagnétiques. Utilisez un réservoir d’huile optiquement clair et optimisez l’illumination et le contraste du microscope pour affiner les bords des gouttelettes et des bicouches. Acquérir et/ou exporter des vidéos en niveaux de gris si cela améliore le contraste des frontières et simplifie les mesures manuelles du diamètre DIB. Pour les expériences ne cherchant pas à étudier les effets de la température, assurez-vous que l’environnement du laboratoire, le support de microscope et l’huile soient maintenus à 21–22 °C.

Results

Installation expérimentale DIB
Le système d’enregistrement est logé dans une cage de Faraday sur une table anti-vibration, avec des données électriques et vidéo acquises par deux ordinateurs distincts (Figure 1A), bien qu’un seul ordinateur avec capacité écran partagé puisse être utilisé. L’environnement d’échantillonnage DIB se compose de deux électrodes recouvertes d’agarose immergées dans un volume défini d’huile d’alcane (Figure 1B). Figure 1C présente un schéma des connexions électriques et optiques essentielles pour la configuration expérimentale décrite dans ce manuscrit.

Figure 1 : Installation expérimentale. (A) Table antivibration et boîtier de cage de Faraday avec composants majeurs indiqués, incluant amplificateur, numériseur, filtre à bruit, générateurs de fonctions et interface double ordinateur pour l’acquisition électrique et vidéo. (B) Vue de dessus de l’environnement de l’échantillon DIB et des électrodes. (C) Schéma des connexions électriques et optiques associées à la configuration expérimentale décrite dans ce manuscrit. Tous les composants individuels partagent un terrain commun dans le bâtiment du laboratoire. Toutes les expériences ont été réalisées à température ambiante (21–22 °C). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Préparation et contrôle qualité des électrodes Ag/AgCl
La fusion de la pointe de fil d’argent forme une boule sphérique (Figure 2A) ; les fondus de mauvaise qualité apparaissent oblongs ou irréguliers. La chloration dans l’eau de Javel produit une surface Ag/AgCl brun-gris terne (Figure 2B). Un enduit fin et uniforme d’agarose, de l’ordre de dizaines de micromètres d’épaisseur sur la boule, est essentiel pour un soutien stable des gouttelettes et un couplage électrochimique à faible impédance, tandis qu’un revêtement inégal entraîne une mauvaise fixation des gouttelettes (Figure 2C).

Figure 2 : Préparation des électrodes. (A) Images de microscope de fondues d’électrodes de bonne ou médiocre qualité. (B) Comparaison des têtes d’électrodes non chlorées et chlorées. (C) Exemples de revêtements en agarose de bonne ou de mauvaise qualité. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 3 : Installation des électrodes. (A) Vue de dessus de l’alignement d’angle d’électrode monté. (B) Vue latérale comparant les gouttelettes non affaissées immédiatement après le chargement du LUV avec les gouttelettes affaissantes après la formation de la monocouche. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Positionnement des électrodes et comportement de relâchement des gouttelettes
Les vues de dessus montrent un positionnement angulaire approprié des électrodes pour minimiser la distorsion optique (Figure 3A). Les vues latérales comparent les gouttelettes non affaissantes (immédiatement après le chargement de la solution LUV) et les gouttelettes recouvertes de lipides (après 5 minutes) (Figure 3B). Les gouttelettes affaissées utilisées pour former un DIB présentent une réponse physique retardée au mouvement en raison d’une diminution significative de la tension superficielle due aux monocouches lipidiques, confirmant visuellement la formation d’une gouttelette aqueuse en suspension entièrement recouverte d’une monocouche lipidique. Après l’établissement de l’affaissement, la stimulation des ondes triangulaires est utilisée pour fournir une confirmation électrique de la formation et de la stabilité^{de la bicouche 35}.

Figure 4 : Formation de la bicouche à l’interface des gouttelettes. (A) Séquence en accéléré montrant la formation et l’expansion de la bicouche après le contact des gouttelettes. (B) Réflexion interne de la membrane utilisée pour l’estimation du diamètre et de la surface de la bicouche. L’imagerie DIB est réalisée en dessous de l’installation à l’aide d’un microscope inversé. Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Formation et mesure de la surface de la DIB
Des images séquentielles capturent un « zipping » spontané en deux couches et une expansion de surface lorsque deux gouttelettes affaissées sont touchées (Figure 4A). Les réflexions ovales intérieures brillantes au contact des gouttelettes sont utilisées pour estimer le diamètre de la bicouche et, par extension, la surface membranaire au fil du temps (Figure 4B).

Figure 5 : Protocole STP — stimulation et réponse. Les réponses représentatives du courant lors de la facilitation par impulsions appariées (PPF, 0–60 s, rouge) et de la dépression par impulsions appariées (PPD, 60–120 s, bleu) sont affichées (en haut), ainsi que le protocole de stimulation correspondant (en bas). Les impulsions PPF et PPD durent 100 ms avec des temps OFF de 10 ms et 250 ms respectivement, ce qui donne des cycles de travail de 90,9 % et 28,6 %. La facilitation correspond à une augmentation nette du courant ionique ; La dépression correspond à une diminution nette. Les réponses actuelles ne sont enregistrées que pendant les périodes ON ; Pour la visualisation, les données entre les impulsions sont interpolées afin de mettre en évidence les tendances globales du courant. Les schémas des impulsions, les durées et le nombre d’impulsions dans les phases PPF et PPD ne sont pas tracés à l’échelle et sont illustrés à des fins de visualisation. Données représentatives de réponse courante reproduites de Podar PT et al.,²⁵ sous CC BY-NC-ND 4.0. Copyright © 2025 : L(s) auteur(s). Publié par PNAS. Schéma de stimulation modifié pour le présent manuscrit. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Protocole de stimulation électrique pour induire un comportement de type plasticité à court terme (type STP)
Les schémas de stimulation notés ici représentent la facilitation des impulsions appariées (PPF) et la dépression (PPD) par analogie avec la terminologie des neurosciences, similaires à Koner et Najem^28,29. La facilitation par impulsions appariées (PPF ; 0–60 s) et la dépression par impulsions appariées (PPD ; 60–120 s) sont délivrées par impulsions de 100 ms avec des temps OFF de 10 ms et 250 ms respectivement, correspondant à des cycles de travail de 90,9 % pour la PPF et 28,6 % pour la DPP. Le panel supérieur montre les réponses représentatives du courant pendant les périodes d’ON, tandis que le panel inférieur montre le schéma de stimulation.

Courant, aire et flux ionique lors de la STP et de la stimulation à long terme qui s’ensuit
Le courant normalisé (I/_{I 0}) pour les bicouches DPhPC dopées à gA dans les huiles C16 et C12/C16 est indiqué pendant la PPF et la PPD (Figure 6A). La normalisation de la surface de membrane (A/_{A 0}) mesurée à 30 points temporels révèle une évolution similaire de la surface dans les deux conditions pétrolières malgré des courants différents (Figure 6B). Les données pour le courant et la surface normalisés sont représentées respectivement par la moyenne ± nuages et barres de S.D., sur 28 DIB indépendants par état pétrolier. Le flux normalisé, J/_{J 0} = (I/_{I 0})/(A/_{A 0}), sépare les variations de conductance indépendantes de la surface et est cohérent avec des variations de conduction membranaire au-delà de la simple expansion de surface (Figure 6C). Cependant, ces changements peuvent refléter des contributions à la fois de la conductance à canal unique et du nombre de canaux conducteurs actifs. Une stimulation prolongée de la DPP jusqu’à 30 minutes produit un comportement prolongé de type dépression (LTD) dans les membranes C16 mais maintient un flux élevé, compatible avec un comportement de type LTP dans les membranes C12/C16 (Figure 6D). Ensemble, ces données montrent que la composition membranaire module à la fois les variations de plasticité à court et à long terme, similaires à des changements de flux ionique.

Figure 6 : Courant, aire et flux ionique calculé des DIB lors de la STP et la transition vers LTP/LTD. (A) Courant normalisé (I/I₀) pendant la PPF (0–60 s, fond blanc) et PPD (60–120 s, fond gris) pour les membranes DPhPC dopées à gA dans les huiles C16 (orange) et C12/C16 (bleu), chaque condition comprenant n = 28 DIB formés indépendamment. (B) Des surfaces membranaires normalisées (A/A₀), mesurées à 30 points temporels, montrant des trajectoires d’aires comparables malgré des réponses courantes différentes ; les données sont indiquées en moyenne ± S.D. sur le même n = 28 DIB indépendants par état d’huile. (C) Le flux normalisé, J/J₀ = (I/I₀)/(A/A₀)), est calculé à partir des mesures correspondantes de courant et de surface, mettant en évidence les changements de conductance au-delà des effets de surface. (D) Comportement à long terme sous stimulation prolongée de la DPP : après les 120 s STP initiaux (ombre grise), les DIB ont été soumis à 30 minutes de PPD avec des impulsions ON = 100 ms et OFF = 250 ms (rouge solide/vert) ou 30 s (orange/gris). Le flux se désintègre jusqu’à ou en dessous de la base dans les membranes de C16, indiquant un comportement de type LTD, mais reste élevé dans les membranes C12/C16, indiquant un comportement persistant de type LTP. Les régions ombragées représentent l’erreur propagée à partir de I/I₀ et A/A₀. Des ensembles de données PPD étendu dans (D) ont été obtenus à partir de n = 6 DIB indépendants par condition d’huile pour le protocole 120 s, suivis de 3 DIB par condition PPD étendue. Tous les points de données sont connectés uniquement à des fins de visualisation. Les panneaux A, B et D ont été reproduits sous CC BY-NC-ND 4.0. Copyright © 2025 : L(s) auteur(s). Publié par PNAS. Le panneau C a été nouvellement généré pour le présent manuscrit à partir des données rapportées par Podar PT et al.^,25. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Trace de courant représentative à canal unique de 15 s provenant d’un DIB dopé à gA formé dans de l’huile C16 après stimulation PPF
La piste inclut le signal brut capturé à 50 kHz avec un filtre passe-bas de 1 kHz, une piste à 8 pôles filtrée par Bessel à 250 Hz, et l’ajustement idéalisé de JSMURF. Le niveau stable le plus bas définit l’état fermé, et les niveaux supérieurs correspondent à des événements monocanaux, multicanaux et sous-conductance. Ces traces fournissent la base pour l’analyse de l’amplitude de conductance et de la durée de vie. L’exemple de temps de séjour dans l’état de conductance indiqué représente la durée d’un niveau de conductance spécifique, dont l’amplitude et la durée reflètent la contribution combinée de multiples événements simultanés de pleine et/ou sous-conductance.

Amplitude de conductance et distributions de durée de vie
Les histogrammes d’amplitude de conductance pour les membranes C16 et C12/C16 (figures 7A–B) comparent les conditions pré-PPF et post-PPF à un rapport molaire DPhPC :gA de 1:5×^10-6. Les approximations gaussiennes ci-dessous indiquent des décalages des pics moyens de conductance après PPF et résolvent des pics distincts correspondant à la sous-conductance et aux états multi-canaux. Des comparaisons statistiques des distributions de conductance ont été réalisées sur des données regroupées au niveau des événements à l’aide du test t de Welch et du test U de Mann-Whitney (α = 0,05), chaque condition comprenant 3 enregistrements DIB indépendants et N pour un état de conductance donné indiquant le nombre total d’événements détectés regroupés sur ces enregistrements. Les distributions de probabilité au cours de la vie, N(t)/N(0), avant et après (Figure 7C–D) montrent que les membranes C12/C16 développent des distributions de conductance à queues plus longues et des durées de vie modifiées par rapport à C16, indiquant des changements dans la stabilité du canal. Les données histogrammes sont représentatives de la trace filtrée de 15 s (trace rouge) acquise pour chaque condition. Les distributions de durée de vie de l’état de conductance ont été générées à partir de 3 enregistrements DIB indépendants par condition ; Les courbes pointillées désignent les réplications individuelles, et les courbes solides désignent les ajustements exponentiels globaux entre N(t) / N(0) et t.

Figure 7 : Histogrammes d’amplitude de conductance et distributions de temps de séjour de l’état de conductance. Les histogrammes d’amplitude de conductance pour l’activité gA dans les membranes (A) C16 et (B) C12/C16 comparent les conditions pré-PPF (gris) et post-PPF (orange / bleu) à un rapport molaire de 5 × 10-6 gA :lipides. Les approximations gaussiennes sous les histogrammes indiquent des décalages des pics moyens de conductance et des écarts-types pour les états à canal unique et multi-canal. Les décalages de conductance moyenne après PPF sont indiqués par des lignes pointillées (noir = avant PPF ; bleu/orange = post-PPF) et des flèches. Chaque condition représente 3 enregistrements DIB indépendants. Des comparaisons statistiques des distributions de conductance ont été réalisées sur des données regroupées au niveau des événements à l’aide du test t de Welch et du test U de Mann-Whitney (α = 0,05), où N pour un état de conductance donné désigne le nombre total d’événements détectés sommés sur ces trois enregistrements. Les événements de sous-conductance ont également été inclus dans l’analyse, avec des distributions de sous-conductance représentatives indiquées à gauche du premier pic à l’état ouvert pour chaque condition membranaire. Les distributions de probabilité à vie des événements d’état de conductance dans les membranes C16 (C) et C12/C16 (D) avant (orange / bleu) et après la stimulation PPF (orange foncé / bleu foncé) à 5×^10-6 M gA :lipides correspondent aux analyses de conductance montrées à la figure 7A–B. Ici, N(t) représente le nombre cumulé d’événements complets et de sous-conductance dont la durée est supérieure au temps t. Les lignes pointillées indiquent les distributions de durée de vie à partir de réplications individuelles (n = 3 DIB indépendants par condition), et les inserts solides montrent des ajustements exponentiels globaux réalisés à l’aide d’un logiciel d’ajustement de courbes non linéaires. Les cases A–D reproduites de Podar PT et al.,²⁵ et compilées pour le présent manuscrit sous CC BY-NC-ND 4.0. Copyright © 2025 : L(s) auteur(s). Publié par PNAS. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 8 : Sonde du comportement monocanal — trace de réponse courante pour les DIB dans le C16 après stimulation PPF. (A) Exemple de trace courante 15 s montrant des données brutes (bleu), filtré avec un filtre passe-bas Bessel 8 pôles 250 Hz (rouge), et la trace idéalisée (verte) utilisée pour identifier les états de conductance. Le niveau stable le plus bas définit l’état de base « fermé ». (B) Niveaux représentatifs de sous-conductance détectés entre le^2e et le^3e niveau de conductance complète, corroborés par des pics intermédiaires distincts dans l’histogramme d’amplitude (voir Figure 7A, orange). Les temps de présence de conductance sont extraits de la durée de chaque niveau de conductance identifié (à l’exclusion de l’état fermé) pour générer des distributions de vie N(t)/N(0). Reproduit de Podar PT et al.,²⁵ sous CC BY-NC-ND 4.0. Copyright © 2025 : L(s) auteur(s). Publié par PNAS. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Après la PPF, les membranes C12/C16 présentent un décalage marqué vers la droite dans les distributions d’amplitude de conductance, indiquant une conductance à canal unique accrue, accompagnée d’un décalage vers la gauche dans les distributions de durée de vie de l’état de conductance, cohérent avec des temps d’ouverture plus courts. Ces changements sont cohérents avec un amincissement électromécanique de la bicouche C12/C16 pendant la PPF, comme le confirment les mesures mécaniques et d’épaisseur directes rapportées dans la réf. 25, ce qui diminue la barrière énergétique au transport d’ions via gA et augmente le débit ionique par ouverture tout en réduisant la stabilité du canal. En revanche, les membranes de C16 présentent des changements minimes dans les deux distributions, soulignant leur adaptabilité structurelle limitée. Ensemble, ces résultats démontrent que la plateforme DIB capture à la fois des corrélats d’ensemble et à canal unique de l’adaptation électromécanique de la membrane, y compris les variations de conduction ionique de type STP et LTP/LTD résultant d’une dynamique dépendante de la composition de la membrane (Figure 8).

Discussion

En termes pratiques, cette méthode offre trois capacités expérimentales clés : variation contrôlable de la composition des deux couches via la composition lipidique et la phase huileuse, un suivi optique et électrique simultané de la restructuration des membranes, et l’accès à un régime de surface membranaire qui fait le pont entre l’électrophysiologie à canal unique et la mécanique des membranes^mésoscale 14,15,20,21,25 . Ces caractéristiques rendent la méthode particulièrement utile pour les études structure-fonction dans les systèmes à membranes simplifiées où l’électromécanique membranaire, plutôt que la complexité cellulaire complète, est la perspective expérimentale d’intérêt 14,15,20,21,25,39.

Ce protocole décrit l’assemblage et l’analyse de DIB dopés à la gramicidine A dans les huiles d’alcanes afin d’étudier la capacité des membranes lipidiques à se restructurer sous stimulation électrique physiologiquement^pertinente 14,15,25,35,38. Comparée aux techniques de serrage de patch²¹, la plateforme DIB interroge les patchs membranaires d’ordres de grandeur plus grands tout en maintenant une résolution suffisante pour capturer des événements discrets à canaux^ioniques 14,15,19,20,21,28,38 . Cette capacité est particulièrement précieuse pour résoudre le remodelage électromécanique mésoscale (par exemple, comme l’électromouillage et l’électrocompression) et le lier au comportement des canaux microscopiques qui donnent collectivement naissance à des phénotypes de conductance membranaire de type STP, LTP et LTD sous stimulation physiologiquement^inspirée 13,25,27,38 . Le système DIB actuel n’est pas destiné à reproduire la complexité moléculaire des synapses^biologiques 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . En conséquence, des termes tels que STP, LTP, LTD, PPF et PPD sont utilisés dans un sens descriptif et analogique pour désigner des augmentations et diminutions de la conduction ionique membranaire à court ou long terme selon des protocoles de stimulation définis. Les principales conclusions de ce travail sont donc interprétées de manière la plus directe en termes d’électromécanique membranaire, d’adaptation de conductance et de restructuration hors équilibre dépendante de la composition dans les DIBs, ce qui peut offrir des analogies conceptuelles utiles et des perspectives physiques sur la plasticité synaptique sans impliquer une équivalence mécanistique avec les circuits neuronaux ou la régulation synaptique^biochimique 10,11,25,38.

Plusieurs étapes techniques sont cruciales pour obtenir des résultats reproductibles. Une préparation soigneuse de l’électrode Ag/AgCl, incluant une fusion uniforme de la pointe sphérique en argent, une chloration complète et un revêtement fin et uniforme d’agarose, assure une fixation stable des gouttelettes et un couplage électrochimique à faible^{impédance 20,35}. La confirmation visuelle de l’affaissement des gouttelettes et la bonne orientation des électrodes minimisent la distorsion optique lors de l’enregistrement vidéo et améliorent la précision des mesures de la surface membranaire. L’étalonnage post-acquisition à l’échelle utilisant le diamètre connu du fil d’argent offre une conversion robuste pixel-mm, essentielle pour un calcul fiable de la surface de membrane et du flux d’ions. Dans ce travail, la conductance membranaire (flux) est définie comme le courant par unité de surface (I/A), et comme la surface du DIB varie lors de l’électromouillage, une quantification précise du flux nécessite des mesures de courant et de surface bicouche adaptées^{dans le temps 13,25,27,35}.

Cette approche permet également des lectures complémentaires au niveau de l’ensemble et à canal unique au sein de la même plateforme^{14, 15, 20, 25, 35, 38}. Au niveau de l’ensemble, les enregistrements vidéo et électriques synchronisés quantifient les changements dynamiques de surface (électrowetting) et de courant, à partir desquels le flux ionique (courant/surface) est dérivé. Sous stimulation électrique, les membranes sont poussées vers des états stationnaires hors équilibre (NESS) où la restructuration membranaire dépendante de la composition génère des réponses de type plasticité à court terme, qui peuvent évoluer vers un comportement de potentialisation ou de dépression sur de longues périodes (min^{)25,26,28,29,30,31,32,33,38}. Au niveau monocanal, l’analyse consiste à idéaliser les traces de courant en niveaux de conductance par étapes (états fermé, monocanal, multicanal et sous-conductance). Les outils traditionnels d’idéalisation à ondes carrées ne résolvent généralement qu’un nombre limité de niveaux discrets ; pour des données plus complexes ou bruyantes, des méthodes d’idéalisation sans modèle telles que JSMURF sont^{préférées 37}. Des potentiels de maintien DC brèves analysés avec JSMURF fournissent une détection d’événements statistiquement rigoureuse sous un bruit hétérogène, produisant des histogrammes conductance-amplitude (niveaux entiers et sous-conductance) et des distributions N(t)/N(0) sur toute la durée de vie. Superposer des histogrammes d’amplitude idéalisés et filtrés permet la validation croisée visuelle et quantitative des affectations d’état de conductance, tandis que les reconstructions convoluées (pistes idéalisées passant par le filtre passe-bas connu) confirment les choix de paramètres et la fidélité des événements³⁷.

La composition de la membrane, ajustée ici à travers la phase huileuse environnante (par exemple, C16 vs C12/C16), devrait moduler la viscoélasticité et la capacité de restructuration des deux couches sous stimulation électrique, conformément aux mesures directes rapportées dans des travaux^précédents 22,25,39. Des membranes plus souples devraient montrer un amincissement plus important causé par la CE et une meilleure correspondance hydrophobe avec le gA pendant les PPF ^22,23,25, ce qui conduit à une conductance et une facilitation à canal unique accrues, pouvant se stabiliser comme un comportement de type ^{LTP 25,38}. Inversement, les membranes plus rigides présentent une réactivité structurelle limitée, des changements de conductance plus faibles lors de la PPF et de la PPD, et une tendance à la LTD sous pulsations prolongées. Ces résultats dépendants de la composition mettent en lumière comment les propriétés matérielles prédisposent les membranes à des régimes distincts et fonctionnellement pertinents à long terme 22,23,25,39.

La plateforme DIB présente également d’importantes^{limitations 21}. L’interprétation mécaniste avancée ici est que les différences de composition pétrolière modifient les propriétés des matériaux en bicouches et leur susceptibilité à la restructuration électromécanique, ce qui module à son tour la conduction gramicidine^A 22,23,25. Cette interprétation est soutenue par l’étude précédente, qui a directement mesuré la viscoélasticité de la membrane, la tension interfaciale, ainsi que les variations dynamiques d’épaisseur de la membrane sous ces conditions et la^{stimulation 22}. Dans le présent travail, cependant, ces propriétés du matériau n’ont pas été mesurées simultanément dans chaque expérience et sont donc utilisées ici pour soutenir les différentes réponses structurelles et mécaniques à la stimulation électrique des membranes dans les environnements C16 et C12/C16, plutôt que pour établir de manière indépendante l’interprétation mécaniste des données. De plus, le courant et le flux d’ensemble peuvent refléter à la fois des variations de conductance à canal unique et des variations du nombre de canaux conducteurs, qui peuvent varier avec la surface membranaire, la diffusion peptidique et la dimérisation en conditions hors équilibre 17,18,22,23. La phase pétrolière environnante peut également s’infiltrer ou se retirer dynamiquement du noyau bicouche lors de la stimulation, contribuant à la dérive de base dans les enregistrements à canal unique et aux changements progressifs de la composition membranaire au^{fil du temps 13,21,25}. Ensemble, ces facteurs limitent l’utilisation d’enregistrements à tension constante de longue durée pour définir les propriétés des membranes statiques et soulignent que les DIB se comportent comme des systèmes ouverts et dynamiques plutôt que comme des membranes à équilibre^fermé 13,21,25. Ainsi, bien que le protocole actuel capture des changements de conduction dépendants de la stimulation, similaires à la plasticité, sur les échelles de temps expérimentales^{prévues 25,38}, de futures études combinant des mesures mécaniques directes avec des enregistrements électriques et optiques simultanés, potentiellement en parallèle avec l’imagerie à molécule unique basée sur la fluorescence, seront nécessaires pour résoudre plus pleinement les contributions respectives de la restructuration membranaire, de la conductance des canaux et de la population des canaux^21,25.

Les modes de défaillance courants incluent une fixation instable des goutteles, un affaissement incomplet des goutteles, une coalescence prématurée des gouttelettes lors de la formation de la bicouche, et une mauvaise définition optique du bord de la bicouche lors de l’analyse de la surface. L’attachement instable des gouttelettes est souvent causé par une géométrie irrégulière de la boule argentée ou un revêtement d’agarose irrégulier et peut être réduit en vérifiant la symétrie de la boule et en maintenant une coquille d’agarose lisse. Le chargement des électrodes nécessite également le dépôt manuel de gouttelettes aqueuses de la taille d’un nanolitre sur une tête d’électrode submillimétrique, ce qui exige une coordination main-œil et une perception de la profondeur importantes à travers des milieux de différents indices de réfraction (air vs pétrole). En conséquence, la pointe de la pipette peut involontairement entrer en contact avec la coque d’agarose ou manquer la tête de l’électrode lors de la délivrance. Des techniques d’amélioration de la stabilité telles que l’appui aux poignets, l’avancement lent de la pipette dans l’huile et la retenue de la respiration, combinées à une pratique répétée, peuvent améliorer la maîtrise de la charge. De plus, un affaissement incomplet ou une formation retardée de monocouches peut résulter d’une hétérogénéité vésiculaire, d’une variation de température ou d’une topographie d’agarose, et peut être amélioré en augmentant le temps d’attente après dépôt de^gouttelettes 15,20,35. La coalescence lors de la formation de la bicouche est fréquemment associée à une surface de contact excessive ou à une stimulation électrique trop agressive (> ± 200 mV) et peut être atténuée en utilisant des zones de contact initiales de gouttelettes plus petites, permettant un temps supplémentaire pour la stabilisation monocouche, et en vérifiant la réponse de capacité à onde triangulaire à faible amplitude avant l’impulsion 25,35,38.

Malgré ces contraintes, la plateforme DIB est hautement réglable, évolutive et^{reproductible} 14,15,20,21,25,35,38,40, et elle complète l’électrophysiologie centrée sur les protéines en isolant la contribution de la mécanique lipidique à la conduction 22,23,25. En unifiant les mesures d’ensemble et de canal unique dans un seul système, ce protocole offre une voie pratique pour disséquer comment le travail électrique et la viscoélasticité membranaire se combinent pour produire un comportement conducteur synaptique (semblable à STP, LTP et LTD) dans un modèle contrôlable de bas en^{haut 25,29,30,31,32,33,38}. Ainsi, la méthodologie offre une base pour l’exploration systématique des règles d’apprentissage dépendantes de la composition dans les membranes et pour quantifier comment les forces mécaniques et électriques couplent les protéines membranaires à leur bicouche hôte à travers les échelles temporelles^{et spatiales} 21,22,23,25 . Collectivement, ces capacités positionnent les DIB comme un cadre puissant pour déconstruire des comportements neurobiologiques complexes en mécanismes biophysiques manipulables et^testables 10,11,25,38.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-diphytanoy-sn-glycéro-3-phosphocholine (DPhPC)	Lipides polaires avanti	850356P/850356C	Acheté sous forme de poudre lyophilisée (P) ou en chloroforme (C)  ;
Agarose  ;	Sigma-Aldrich	A9539
Agarose (comprimés d’agarose 0,5g)	Référence	A2501	Vous pouvez utiliser soit la poudre, soit les comprimés  ;
Générateur de formes d’onde Agilent Technologies 33522A   ;	Keysight	&ndash ;	Vous pouvez utiliser n’importe quel générateur de formes d’onde avec des sorties câbles BNC
Gaz argon (Ar)	Airgas	AR UHP300 ; 72-402221259-1	Argon comprimé ; Ultra Haute Pureté
Bilan analytique & nbsp ;	Mettler Toledo	Modèle : MS304S/03	Tout bilan analytique de qualité laboratoire avec une précision de 0,0001 g
Amplificateur Axopatch 200B & nbsp ;	Dispositifs moléculaires	&ndash ;
BK Precision 4017B 10 MHz Générateur de balayage/fonction des DDs	Digi-Key	BK4017B-ND
Capillaires en verre borosilicate	Instruments de précision mondiaux	1B100F-4
Suite logicielle Clampex pCLAMP 11	Dispositifs moléculaires	&ndash ;
Système DigiData 1550B	Dispositifs moléculaires	&ndash ;	Cela inclut un mini-extrudeur, 2 seringues, 100 membranes PC, 100 supports filtrants et 1 support/bloc chauffant
Dodécane, 99 %	Sigma-Aldrich	112-40-3
Ensemble d’extrudeurs avec porte/bloc chauffant   ;	Lipides polaires avanti	610000
Logiciels fidjiens	ImageJ	&ndash ;
Congélateur (-80 °C ; C)	Fisher Scientific	Isotemp ; Modèle : 8964 ; N.O. : 828278-21
Verrerie	VWR International	&ndash ;
Gramicidine-A	Millipore Sigma	368020
Hexadécane, 99 %	Sigma-Aldrich	544-76-3
Éliminateur de bruit d’insectes (60Hz)	Systèmes A-M	726300
Système de microscope inversé (Nikon Ti2-A)	Nikon	&ndash ;	Tout microscope inversé ou vertical peut être utilisé
Alcool isopropylique	VWR International	BDH1133-4LP
Support de microélectrodes & nbsp ;	Instruments de précision mondiaux	MEH1S
Micromanipulateurs   ;	Sutter Instrument	MP-285	Des manipulateurs manuels peuvent être utilisés
Caméra de microscope	Olympe	DP74
Microsoft Excel	Microsoft	&ndash ;
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254
Logiciel de caméra de microscope NIS-Elements	Nikon	&ndash ;	Un logiciel de capture de caméra avec capacité de vue en direct et/ou vidéo peut être utilisé. La vue en direct et l’enregistrement simultané de l’écran peuvent être utilisés pour remplacer la capture vidéo.
Film polyvalent de laboratoire Parafilm M	Parafilm	PM999
Boîte de Petri	-	-	Le plat doit être transparent en dessous et idéalement aussi sur la paroi latérale
Chlorure de potassium (KCl)	Sigma-Aldrich	P3911
Gants d’examen en nitrile doux sans poudre   ;	VWR International	CA89-38-272
Réfrigiteur (4 & degrés ; C)	Fisher Scientific	NUMÉRO de TÉLÉPHONE : 97-938-1 ; Modèle n° : 3556FS
Fil d’argent	GoodFellow	147-346-94
Plaque chauffante à brasser	Thermo Scientific & nbsp ;	SP131325