Isolement des cellules uniques des embryons précoces de Xenopus et tri par taille

Résumé

Nous décrivons une méthode pour isoler des cellules individuelles provenant des embryons précoces de Xenopus laevis et les trier par taille cellulaire.

Résumé

L’embryogenèse précoce nécessite une diminution exponentielle de la taille cellulaire, tandis que l’embryon reste constant en taille aux premiers stades de développement. L’importance fonctionnelle et les mécanismes par lesquels la taille des cellules influencent le développement embryonnaire restent largement peu étudiés. L’embryon précoce de Xenopus offre un système unique pour combler ces lacunes majeures. Comparé à d’autres organismes modèles, l’embryon précoce de Xenopus est extrêmement grand et présente un gradient de taille cellulaire, allant des petites cellules au pôle animal aux grandes cellules au pôle végétal, couvrant l’ensemble de l’embryon à des stades autour de la transition médiane de la blastule. Ici, nous décrivons un protocole pour dissocier les cellules uniques des embryons précoces de Xenopus et les trier par taille à l’aide de passoires cellulaires avec des pores en maille variables. Selon l’imagerie et les mesures de taille, les cellules triées se situent dans la plage de taille attendue et peuvent être utilisées pour l’analyse ou le séquençage des cellules vivantes, ou fixes pour l’imagerie. Ce système apportera un nouvel éclairage sur la révélation des mécanismes régulateurs dépendants de la taille lors du développement précoce.

Introduction

Le changement de taille cellulaire est une caractéristique courante de l’embryogenèse précoce, lorsque l’œuf fécondé subit plusieurs cycles de clivage, générant un nombre croissant de cellules. Bien que l’on sache beaucoup sur le rôle de la taille cellulaire comme paramètre majeur contrôlant les fonctions^{cellulaires 1,2,3}, la manière dont la taille cellulaire influence le développement précoce reste moins connue. Des travaux récents sur divers systèmes embryonnaires modèles suggèrent que la taille cellulaire régule l’activation du génome zygotique (ZGA)⁴ et la spécification du destin cellulaire⁵, soutenant un rôle important de la taille cellulaire dans les décisions de^{développement 6,7}.

L’embryon précoce de Xenopus est un modèle important pour étudier la prise de décision développementale régulée par la taille cellulaire. Parce que l’embryon précoce de Xenopus est grand (~1,2 mm de diamètre), il est facile de manipuler physiquement sa taille, ce qui le rend utile pour évaluer les conséquences directes du changement de taille cellulaire. Par exemple, des mini-embryons de tailles variées peuvent être générés par constriction d’embryons à cellule 1 à l’aide des boucles^{capillaires 4,8}, démontrant la ZGA^{dépendant de la dose 4}. De plus, l’embryon précoce de Xenopus contient un gradient de tailles cellulaires le long de l’axe animal-végétal, avec les plus petites cellules au pôle animal et les plus grandes cellules au pôle végétal, ce qui montre une différence de plus de 100 fois dans le volume⁴. Il est important de noter qu’en visualisant et quantifiant directement les transcrits naissants dans des cellules uniques d’embryons montés entiers, nous avons identifié un seuil de taille cellulaire qui régule^{ZGA 4}. De plus, l’isolement des cellules individuelles provenant des embryons précoces de Xenopus et leur tri par taille ont confirmé l’importance du seuil de taille cellulaire^{ZGA 4}.

Nous décrivons ici les procédures détaillées pour isoler les cellules individuelles des embryons précoces de Xenopus laevis et les trier par taille. Les embryons précoces de Xenopus peuvent être dissociés en cellules individuelles en les incubant dans un milieu libre de Ca²⁺, Mg²⁺ (CMFM⁾⁹, et ces cellules uniques peuvent ensuite être triées à l’aide de filtres cellulaires avec des pores de maille variable. Les cellules triées peuvent être purifiées et utilisées dans diverses applications, notamment l’analyse des cellules vivantes, le séquençage ou les tests d’imagerie.

Protocole

Les travaux sur les animaux décrits ici ont été approuvés par le Comité de soins et d’utilisation des animaux institutionnels (IACUC) de l’Université de Caroline du Sud.

1. Préparation de la solution

REMARQUE : Avant de commencer le protocole, préparez les solutions suivantes.

1. Préparez 20× MMR : mélangez 100 mM HEPES, 2 mM EDTA, 2 M NaCl, 40 mM KCl, 20 mM_{MgCl 2} et 40 mM_{CaCl 2}. Ajustez le pH à 7,8 avec NaOH. Autoclave et stockage à température ambiante.
2. Préparez un milieu libre Ca²⁺, Mg²⁺ (CMFM) : mélangez 50,3 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 9,2 mM_{Na 2HPO 4}, 0,9 mM_{KH 2}PO₄, 2,4 mM_{NaHCO 3} et 1,0 mM EDTA. Ajustez le pH à 7,4, si nécessaire. Autoclave et stockage à température ambiante.
3. Préparez un gel d’agarose à 1,5 % dans une boîte de Petri de 60 mm : ajoutez 0,75 g d’agarose à 50 mL de CMFM. Chauffez pour dissoudre l’agarose dans un four à micro-ondes. Ajoutez 5 à 10 mL de gel d’agarose pour recouvrir une fine couche dans une boîte de Petri de 60 mm.
4. Préparez un milieu à gradient de densité (wt/vol)/CMFM : ajoutez lentement 15 g de milieu à gradient de densité dans 100 mL de CMFM. Pour faciliter la dissolution, chauffez et remuez sur une plaque jusqu’à ce que le milieu à gradient de densité soit complètement dissous. Gardez la solution à 4 °C jusqu’à utilisation.
5. Préparer 4 % de PFA/1× MEM : Mélanger 1 flacon (10 mL) de stock de paraformdéhyde à 16 % et 4 mL de 10 × de MEM (1000 mM de pH 7,4 MOPS, 20 mM d’EGTA et 10 mM de_{MgSO 4}). Ajoutez de l’eau ultrapure à 40 mL.
   REMARQUE : Pour obtenir des embryons de Xénopus , suivez un protocole standard pour réaliser la fécondation in vitro (FIV) (par exemple, voir Sive et al., 2007)¹⁰. L’embryon devrait être à 0,1× MMR prêt à être utilisé.

2. Dissociation des embryons précoces en cellules uniques

1. Ajoutez ~15 mL de CMFM à une nouvelle boîte de Pétri de 60 mm recouverte d’un gel d’agarose à 1,5 %. Utilisez une pipette de transfert en plastique pour transférer 10 à 100 embryons (selon les besoins expérimentaux) dans le plat. Mettez l’antenne sous un stéréomicroscope.
2. Utilisez une pince à épiler dans les deux mains pour retirer soigneusement la membrane de vitrelline en la retenant à la surface des embryons avec une pince et en la décollant de l’autre. Évitez d’endommager les embryons pendant le processus.
3. Incubez les embryons dévitellinés dans le CMFM pendant ~1 h à température ambiante. Secouez le plat très doucement toutes les 5 minutes pour faciliter la dissociation des cellules. Vérifiez régulièrement jusqu’à ce qu’aucun tas de blastomères ne soit visible (Figure 1).

3. Trier les cellules dissociées par taille

1. Lors de la dissociation des blastomères, immergez les colorants cellulaires (40 μm, 70 μm et 100 μm) dans des boîtes de Petri individuelles remplies de CMFM (Figure 2). Placez les plats dans l’ordre de gauche à droite comme indiqué. Incluez également deux autres plats remplis de CMFM entre les groupes pour un lavage rapide des colorants cellulaires lors de chaque tri.
2. Faites doucement tourner le plat contenant les blastomères isolés pour les enrichir au centre du plat. Transférez soigneusement les blastomères dans le colorateur 40 μm en CMFM.
3. Secouez doucement la passoire plusieurs fois pour laisser les blastomères < 40 μm se déposer à travers la passoire. Ensuite, déplacez rapidement la passoire 40 μm dans la plaque remplie de CMFM pour un lavage rapide. Transférez soigneusement les blastomères dans la tamoire de 40 μm, qui sont > 40 μm, dans la tamoire de 70 μm.
4. Répétez les étapes jusqu’à ce que les blastomères soient triés dans la tamoire de 100 μm.
5. Faites doucement tourner chaque plat avec des blastomères triés pour les enrichir au centre du plat. Transférez soigneusement les blastomères (~4 mL) sur le dessus de 0,5 mL de milieu à gradient de densité à 15 % dans un tube de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) (Figure 3). Évitez de mélanger.
6. Laissez reposer le tube 10 minutes. Les blastomères intacts se déposent au fond par gravité, se séparant des globules de vitellus des blastomères éclatés lors du tri et du transfert (Figure 3).
7. Selon l’objectif des expériences en aval, procéder à l’analyse des cellules vivantes, congeler les blastomères dans de l’azote liquide pour le travail sur l’ARN, ou fixer les blastomères pour l’immunocoloration (Figure 3).

Résultats

Des embryons de Xenopus laevis (n = 50) au stade 9 ont été incubés dans le milieu CMFM pour se dissocier en blastomères uniques selon ce protocole (voir un exemple à la Figure 1). Les blastomères simples dissociés ont été triés séquentiellement à l’aide des filtres cellulaires de 40 μm, 70 μm et 100 μm comme décrit ci-dessus. Le mélange témoin non trié et les blastomères simples triés ont été fixés à 4 % de paraformoldéhyde et imagés au microscope e...

Discussion

La taille cellulaire est fondamentalement importante pour les fonctions^{cellulaires 3}, et son impact sur le développement précoce nécessite une attention plus approfondie dans les systèmes embryonnaires modèles. Nous avons ici décrit les détails pour isoler les cellules individuelles des embryons précoces de Xenopus laevis et trier les cellules par taille à l’aide de filtres cellulaires, ce qui pourrait être applicable pour des études sur la taille cellula...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
16 % de paraformaldéhyde (PFA)	EMS	15710-S	Pour la création de la solution fixative
Plaques de Petri jetables de 60 mm	VWR	25384-092	Pour incuber des embryons
Stereoscopes à zoom ACCU-SCOPE 3075	VWR	470351-130	Pour visualiser les embryons
Agarose	Sigma-Aldrich	A-9414	Pour revêtements de boîtes de Petri
Filtre cellulaire, 100 & micro ; m	VWR	76327-102	Pour trier les cellules par taille
Filtre cellulaire, 40 & micro ; m	VWR	76327-098	Pour trier les cellules par taille
Filtre cellulaire, 70 & micro ; m	VWR	76327-100	Pour trier les cellules par taille
Pipettes de transfert jetables	VWR	414004-035	Pour le transfert d’embryons
Pince à épiler Dumont, Style 5	Sciences de la microscopie électronique	72701-D	Pour retirer la membrane vitelline
Boîte de Petri en verre, 60 et plus de fois ; 15 mm	VWR	75845-542	Pour incuber des embryons