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Article de méthode

Séquençage multi-locus pour le typage de contrainte de Toxoplasma gondii

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DOI :

10.3791/70645

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26 mai 2026

 , 
1Department of Biosciences, Durham University, 2Department of Parasitology, Faculty of Veterinary Medicine, New Valley University

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour identifier et génotyper rapidement les souches de Toxoplasma gondii en utilisant le séquençage nanopore portable de marqueurs génétiques sélectionnés, permettant une identification évolutive et ciblée des souches dans des isolats maintenus en laboratoire, avec une application potentielle future dans des contextes de surveillance.

Résumé

Toxoplasma gondii est un parasite apicomplexe réparti mondialement, caractérisé par une diversité génétique importante, nécessitant des approches moléculaires précises pour la discrimination des souches. L’objectif de ce protocole est d’établir un flux de travail reproductible pour le génotypage multi-locus ciblé d’isolats de T. gondii en culture. La procédure implique la propagation in vitro de souches représentatives de type I (RH) et de type II (ME49), l’extraction d’ADN génomique, l’amplification spécifique au locus des gènes SAG2 et SAG3 , ainsi que des analyses basées sur le séquençage pour détecter les polymorphismes à nucléotides simples (SNP) et les événements d’insertion/délétion (INDEL). Les données de séquençage sont traitées pour générer des séquences consensuelles à haute confiance et pour effectuer un alignement comparatif afin d’identifier les polymorphismes spécifiques à chaque souche. L’application de ce flux de travail aux souches archétypales a démontré une grande efficacité de cartographie, une profondeur de lecture constante entre les loci cibles, et une récupération précise des tailles attendues des amplicons, confirmant une détection fiable de la variation génétique au niveau du locus. Bien qu’une assignation complète de génotypes nécessite l’inclusion de marqueurs standardisés supplémentaires, ce protocole offre un cadre évolutif et reproductible pour la caractérisation génétique ciblée des isolats de T. gondii maintenus en laboratoire et soutient une analyse cohérente de séquences multi-locs.

Introduction

Toxoplasma gondii est un parasite apicomplexe réparti dans le monde entier et une menace zoonotique majeure d’origine alimentaire et aquatique, capable d’infecter pratiquement tous les animaux à sang chaud, les félins servant d’hôtesdéfinitifs 1. L’infection chez l’humain et l’animal survient fréquemment par l’ingestion de kystes tissulaires ou d’oocystes sporulés, et la capacité du parasite à alterner entre les stades tachyzoïte et bradyzoïte permet une persistance à long terme dans les tissus neuraux et musculaires, contribuant à la transmission à la fois par la viande et environnementale 2,3.

Bien que trois lignées clonales (types I, II et III) dominent en Europe et en Amérique du Nord, une grande diversité génétique, incluant des souches atypiques et recombinantes, a été documentée à l’échelle mondiale, notamment dans les régions dotées de riches réservoirsfauniques. Une discrimination précise des souches est donc essentielle pour élucider la dynamique de transmission, étudier les épidémies et comprendre l’épidémiologie régionale. Les approches traditionnelles de génotypage telles que la PCR-RFLP, le typage de séquences multi-locus basé sur Sanger (MLST) et l’analyse par microsatellites ont largement contribué à notre compréhension de la structure des populations de T. gondii , mais sont limitées en résolution, en débit et en capacité à détecter la variation intra-génotype. Ces approches nécessitent souvent plusieurs réactions distinctes et peuvent échouer à détecter des insertions, des délétions ou des haplotypes complexes au sein des locipolymorphes 1. Le séquençage de nouvelle génération (NGS) à lecture courte a amélioré la détection des variants rares tout en restant limité dans l’identification des changements structurelscomplexes 4.

Les plateformes de séquençage à longue lecture, en particulier Oxford Nanopore Technologies, offrent désormais la capacité de générer des lectures continues et de haute précision, adaptées à la résolution de variantes structurales et de loci5 hautement polymorphes. Leur portabilité, leur capacité d’analyse en temps réel et leur compatibilité avec les flux de travail basés sur amplicon en font des outils prometteurs pour les applications de terrain et les enquêtes surles épidémies 6. Malgré ces avantages, les flux de travail standardisés multi-locus à longue lecture pour le génotypage de routine de T. gondii restent limités.

Pour combler cette lacune, nous avons mis en place un flux de travail évolutif de séquençage d’amplicons à longue lecture ciblant deux loci polymorphes (Figure 1). Combinée à un pipeline de polissage consensuel et d’appels de variantes, cette approche permet une détection précise des SNP et INDEL, en soutenant la discrimination au niveau de la déformation. Le protocole convient aux laboratoires équipés pour l’amplification PCR et le séquençage en lecture longue, et a été validé à l’aide d’isolats en culture. Bien que l’adaptation à des échantillons cliniques ou environnementaux primaires puisse être réalisable, de telles applications nécessitent une optimisation et une validation supplémentaires. Dans l’ensemble, ce flux de travail fournit un cadre structuré pour la caractérisation moléculaire ciblée et peut soutenir des investigations épidémiologiques.

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Protocole

Cette étude a utilisé des souches parasites de laboratoire établies et des lignées cellulaires de fibroblastes humains obtenues commercialement. Aucun sujet humain ou animal n’était directement impliqué.

REMARQUE : Sauf indication contraire, les tampons et réactifs utilisés dans ce protocole sont fournis dans les kits commerciaux listés dans le tableau des matériaux.

1. Sélection des biomarqueurs

  1. Téléchargez les séquences génomiques de SAG2 et SAG3 au format FASTA depuis la base de données génomique ToxoDB (https://toxodb.org/toxo/app).
  2. Effectuez des alignements de séquences par paires à l’aide d’EMBOSS Water (https://www.ebi.ac.uk/jdispatcher/psa/emboss_water).
  3. Sélectionnez des régions d’amplicons ≤1 600 paires de bases (pb) pour minimiser le temps de séquençage et garantir une amplification PCR efficace.
  4. Assurez-vous que chaque région contient des SNP informatifs ou des polymorphismes INDEL pour la différenciation des souches.

2. Culture et récolte des tachyzoïtes de Toxoplasma gondii

  1. Maintien des cultures cellulaires hôtes
    1. Obtenez des fibroblastes du prépuce humain (HFF) auprès d’une source commerciale certifiée et cultivez-les dans un milieu de croissance complet composé du Médium Eagle modifié de Dulbecco, complété avec 10 % de sérum bovin fœtal et 1 % de pénicilline-streptomycine.
    2. Incuber des cultures à 37 °C avec 5 % de CO₂ dans un incubateur humidifié.
  2. Entretien et extension des lignes parasites.
    1. Infecter les monocouches de fibroblastes à 80–90 % de confluence en utilisant des tachyzoïtes à une multiplicité d’infections de 1 à 3 parasites par cellule hôte. Pour une fiole de T25 contenant environ 1 ×10 6 fibroblastes, ajoutez 1 à 3 × 106 tachyzoïtes.
    2. Examinez les cultures quotidiennement à l’aide d’un microscope à lumière inversée à un grossissement de 20× ou 40×. Identifier la lyse de la cellule hôte en observant une perturbation massive de la monocouche.
      REMARQUE : N’utilisez pas de cultures de fibroblastes au-delà du passage 20 pour éviter les artefacts liés à la culture.
    3. Prélèvement de tachyzoïtes.
      1. Prélever des cultures lorsque ≥ 90 % de la lyse des cellules hôtes est visible.
      2. Centrifugez à 1 300 × g pendant 10 minutes à 4 °C.
      3. Résuspendez le pellet dans un sérum stérile tamponné phosphate de 10 mL par pipetage doux, puis centrifugez à nouveau à 1 300 × g pendant 10 minutes à 4 °C. Répétez encore une fois.

3. Extraction de l’ADN génomique et génération d’amplicons

  1. Extraire l’ADN génomique à l’aide d’un kit de purification génomique à colonnede silice 7. ADN éluté dans un tampon d’élution de 50 μL.
  2. Mesurez la concentration d’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre à microvolume.
  3. Conserver l’ADN à 4 °C pour le court terme ou à −20 °C pour le stockage à long terme.
  4. Préparez les réactions PCR à l’aide d’un mélange maître ADN polymérases de haute fidélité, d’amorces spécifiques au locus (Tableau supplémentaire 1) et de l’eau sans nucléase.
  5. Effectuer une amplification PCR à l’aide d’un cycleur thermique calibré dans les conditions de cycle suivantes : (a) dénaturation initiale à 98 °C pendant 30 s, (b) 35 cycles à 98 °C pendant 10 s ; recuit spécifique au locus : 60 °C pour SAG2, 68 °C pour SAG3, 30 s ; 72 °C pendant 20 s, (c) Extension finale : 72 °C pendant 2 minutes.
  6. Vérifiez les produits PCR par électrophorèse sur un gel d’agarose à 1,5 %.
  7. Purifiez les produits PCR à l’aide d’un système de filtration PCR à colonne et d’extraction par gel selon les instructions dufabricant 8. L’ADN élué dans 15 à 20 μL de tampon d’élution.
    REMARQUE : L’efficacité et le rendement de la PCR peuvent être réduits par une faible qualité du gabarit d’ADN, une concentration ou des conditions de réaction sous-optimales. Si le rendement de l’amplicon est faible, vérifiez l’intégrité du gabarit d’ADN à l’aide d’électrophorèse sur gel d’agarose, ainsi que la concentration et la pureté, à l’aide d’un spectrophotomètre. Les températures de recuit PCR et les concentrations d’amorces doivent également être optimisées pour les paires d’amorces utilisées, et le nombre du cycle PCR doit être augmenté si nécessaire.

4. Préparation à la bibliothèque pour le séquençage de lecture longue

  1. Réparation de fin et déroulement dA
    1. Décongelez tous les réactifs et mélangez soigneusement par vortex. Diluez l’échantillon témoin d’ADN avec 10,5 μL de tampon d’élution lors de la première utilisation uniquement et conservez-le sur glace.
      REMARQUE : Toujours utiliser soigneusement les billes magnétiques vortex avant chaque utilisation.
      ATTENTION : Ne faites pas de vortex avec le mélange enzymatique End-Prep ; Mélangez doucement en pipetteant.
    2. Pipettez 200 fmol (~130 ng pour un fragment de 1 kb) de chaque échantillon d’ADN dans des tubes PCR de 0,2 mL et ajustez le volume à 11,5 μL avec de l’eau sans nucléase.
    3. Ajoutez 1 μL d’échantillon témoin d’ADN dilué par tube et mélangez en pipettant 10 à 20 fois.
    4. Préparez un master mix de préparation finale par échantillon contenant 1,75 μL de tampon de réaction et 0,75 μL de mélange enzymatique (y compris 5 % d’excès).
    5. Ajoutez 2,5 μL de master mix à chaque échantillon, mélangez doucement puis réduisez brièvement la tourne.
    6. Incubez dans un thermocycleur à 20 °C pendant 5 minutes, puis à 65 °C pendant 5 minutes.
  2. Purification de l’ADN préparé à l’extrémité
    1. Transférez la réaction de 15 μL dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL à faible liaison à l’ADN.
    2. Ajoutez des billes magnétiques resuspendues de 15 μL, mélangez doucement et faites tourner brièvement.
    3. Incubez les échantillons sur un mélangeur rotateur pendant 5 minutes à température ambiante.
    4. Préparez de l’éthanol frais à 80 % pour le lavage.
    5. Placez les tubes sur un support magnétique jusqu’à ce que les billes se transforment en pellets et retirez soigneusement le surnageant.
    6. Lavez les billes deux fois avec 200 μL d’éthanol à 80 %.
      REMARQUE : Laissez les billes se transformer complètement, puis retirez soigneusement l’éthanol.
    7. Des perles sèches à l’air pendant ~30 s ; Évitez de trop sécher pour éviter les fissures.
    8. Resuspendez les billes dans de 10 μL d’eau sans nucléase et incubez pendant 2 minutes à température ambiante.
    9. Placez les tubes sur une grille magnétique et transférez 10 μL d’éluate dans un tube de microcentrifuge propre à faible liaison à l’ADN.
    10. Mesurez la concentration d’ADN à l’aide de 1 μL sur un spectrophotomètre.
  3. Code-barres natif
    1. Décongeler le mélange maître Ligase blunt/TA, EDTA, tampon de fragments courts (SFB) et codes-barres natifs (NB01–NB24).
    2. Attribuez des codes-barres individuels aux échantillons 1 à 24.
    3. Assemblez la réaction de code-barres avec de l’ADN préparé à l’extrémité de 7,5 μL, un code-barres natif de 2,5 μL et un mélange maître Ligase Blunt/TA de 10 μL
    4. Mélangez soigneusement en pipettant 10 à 20 fois.
    5. Incubez pendant 20 minutes à température ambiante et terminez la réaction avec 4 μL d’EDTA, mélangez soigneusement en pipettant, puis centrifugez brièvement.
    6. A mis des échantillons en code-barres dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL à faible liaison à l’ADN. Ajoutez des billes magnétiques à 0,4× du volume total d’échantillons regroupés (par exemple, ajoutez 230 μL de billes à 575 μL d’ADN regroupé). Mélangez soigneusement en pipettant, puis incubez sur un mélangeur à rotation à température ambiante pendant 10 minutes.
    7. Lavez les billes avec 700 μL de tampon à fragments courts (SFB). Faites tourner les billes pour les resuspendre, puis ramenez l’échantillon sur la grille magnétique et laissez les billes se transformer. Retirez le tampon à l’aide d’une pipette, puis jetez-le.
    8. Répétez l’étape précédente.
    9. Faites tourner et remettez le tube sur le support magnétique. Pipette tout tampon résiduel.
    10. Retirez le tube de la grille magnétique et resuspendez la pellete dans 35 μL d’eau sans nucléase en faisant un léger flick.
    11. Incubez à 37 °C pendant 10 minutes avec un mélange intermittent, puis transférez l’éluate dans un tube de microcentrifuge propre à faible liaison à l’ADN.
  4. Ligation de l’adaptateur et nettoyage de la bibliothèque
    1. Assembler la réaction de ligation avec de l’ADN codé à barres regroupé de 30 μL, un adaptateur natif de 5 μL, un tampon de ligation de 10 μL (5×) et une ligase d’ADN T4 de 5 μL.
    2. Mélangez soigneusement la réaction en pipettant doucement et en faisant brièvement tourner vers le bas. Incubez la réaction pendant 20 minutes à température ambiante.
    3. Ajoutez 20 μL de billes magnétiques en suspension à la réaction et mélangez en pipettant. Incubez sur un mélangeur rotatif pendant 10 minutes à température ambiante.
    4. Faites tourner l’échantillon et la pastille sur le support magnétique. Garde le tube sur l’aimant et enlève la pipette du surnageant.
    5. Lavez les billes en ajoutant un tampon à fragments courts (SFB) de 125 μL. Faites tourner les billes pour les resuspendre, faites tourner vers le bas, puis remettez le tube sur la grille magnétique et laissez les billes se transformer. Retirez le surnageant à l’aide d’une pipette, puis jetez-le.
    6. Répétez l’étape précédente.
    7. Descendez et remettez le tube sur l’aimant. Pipette tout surnageant résiduel. Retirez le tube du support magnétique et resuspendez le pellet dans un tampon d’élution (EB) de 15 μL.
    8. Centrifugez et éclovez pendant 10 minutes à 37°C. Agitez l’échantillon toutes les 2 minutes en le faisant légèrement pendant 10 secondes pour encourager l’élution de l’ADN.
    9. Pelletez les billes sur un aimant jusqu’à ce que l’éluat soit clair et incolore, pendant au moins 1 minute.
    10. Retirer et conserver 15 μL d’éluate contenant la bibliothèque d’ADN dans un tube de microcentrifuge propre de 1,5 mL à faible liaison à l’ADN.
    11. Quantifiez la bibliothèque finale à l’aide d’un spectrophotomètre.

5. Préparation des cellules de flux et séquençage des nanopores

  1. Préparation de la cellule de flux
    1. Inspectez la cellule à flux et confirmez la présence de pores actifs ≥80.
    2. Préparez le mélange d’amorçage en combinant 117 μL de solution de rinçage avec 3 μL de solution de liaison dans un tube de microcentrifuge pour un volume total de 120 μL. Mélangez doucement en pipettant pour éviter l’introduction de bulles d’air. Chargez lentement tout le mélange d’amorçage de 120 μL dans la prise d’amorçage de la cellule de flux, en veillant à ce qu’aucune bulle d’air ne soit introduite lors du chargement.
  2. Chargement et séquençage de la bibliothèque
    1. Préparez le mélange de séquençage en combinant 15 μL de tampon de séquençage (SB), 10 μL de billes de bibliothèque (LIB) et 5 μL de bibliothèque d’ADN. Mélangez doucement en pipotant 3 à 5 fois pour éviter d’introduire des bulles. Le mélange de séquençage de 30 μL obtenu est prêt à être chargé ou peut être ajusté à 45 μL si nécessaire.
    2. Chargez lentement 30 à 45 μL du mélange de séquençage dans le port de l’échantillon de la cellule de flux en distribuant la solution dans le sens des gouttes.
      ATTENTION : Évitez d’introduire des bulles d’air et ne laissez pas la pointe de la pipette toucher la membrane. Fermez solidement le port de chargement après la distribution.
    3. Commencez à séquencer avec l’appel de base en temps réel activé et surveillez l’activité des pores.
    4. Poursuivre le séquençage jusqu’à ce que ≥500× couverture par amplicon soit atteinte (recommandée ≥1000×), afin d’assurer une profondeur de lecture suffisante pour un appel de base précis, une génération fiable de séquences par consensus et une détection confiante des variantes basse fréquence.
      REMARQUE : Si une faible couverture de séquençage est apparente, assurez-vous d’une entrée d’amplicons de haute qualité à la concentration requise, suffisamment de pores de cellules de flux actives, et prolongez le séquençage pour atteindre la couverture recommandée.

6. Traitement des données et analyse de variantes

  1. Appels de base et démultiplexage
    1. Effectuer des appels de base à haute précision à l’aide d’un logiciel d’appel de base associé à la plateforme avec des réglages de haute précision par défaut pour générer des fichiers FASTQ par échantillon. Le démultiplex lit par code-barres et ne conserve que les lectures en passant les filtres de contrôle qualité.
  2. Cartographie de lecture et traitement BAM
    1. Téléchargez le Toxoplasma gondii reference genome assembly GCF_000006565.2 (TGA4) depuis la base de données du génome du National Center for Biotechnology Information (NCBI). Extraire le chromosome VIII (NC_031476.1) pour l’analyse du SAG2 et le chromosome XII (NC_031480.1) pour l’analyse du SAG3 . Indexez les séquences de référence à l’aide de SAMtools et générez un indice d’alignement à l’aide d’un constructeur d’index d’alignement à lecture longue.
    2. Map se lit vers le génome de référence indexé à l’aide d’un algorithme d’alignement à longue lecture optimisé pour les données de séquençage nanopore (par exemple, preset pour la cartographie en lecture longue ; -ax map-ont).
    3. Convertissez la sortie d’alignement en format BAM, triez et indexez les fichiers BAM à l’aide de SAMtools. Ajoutez des informations de groupe de lecture à chaque fichier BAM en utilisant les outils Picard. Calculez la couverture moyenne par lieu à l’aide des statistiques de profondeur et générez des statistiques cartographiques à l’aide de métriques flagstat.
  3. Génération de séquences consensuelles
    1. Générez des séquences de consensus par amplicon en utilisant un algorithme de polissage par consensus basé sur un réseau de neurones avec des paramètres par défaut. Exportez les séquences de consensus au format FASTA pour l’analyse en aval.
    2. Effectuer un alignement basé sur des références et une analyse comparative de séquences à l’aide de bases de données génomiques accessibles au public. Visualisez les alignements de lecture et les positions polymorphes à l’aide d’un logiciel de visualisation du génome.
  4. Appel variant
    1. Effectuer la détection de variantes à l’aide d’un algorithme d’appel de variantes basé sur le consensus. Séparer les polymorphismes mononucléotidiques (SNP) et les événements d’insertion/délétion (INDELs) à l’aide d’outils de sélection de variantes (Fichier Supplémentaire 1).
    2. Appliquez des seuils de filtrage de qualité. Pour les SNP, les variantes de filtres avec par exemple QD < 2.0, FS > 60.0, ou MQ < 40.0. Pour les INDEL, les variantes de filtre avec par exemple QD < 2.0 ou FS > 200.0.
    3. Compressez et indexez les fichiers VCF filtrés à l’aide d’outils de traitement VCF standards. Générez des statistiques variantes à l’aide des utilitaires de résumé VCF.
  5. Affectation du génotype
    1. Extraire des variantes spécifiques au locus des régions SAG2 et SAG3 et comparer les profils polymorphes aux séquences de souche de référence pour assigner des génotypes de T. gondii .

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Résultats

L’ADN génomique de Toxoplasma gondii a été amplifié avec succès par réaction en chaîne par polymérase (PCR) ciblant deux marqueurs génétiques : SAG2 et SAG3 (Figure 2). Après purification, les produits PCR ont produit des bandes distinctes des tailles attendues lors de l’électrophorèse en gel d’agarose, correspondant à 639 pb (SAG2) et 1158 pb (SAG3). La clarté et la consistance de ces bandes ont confirmé l’amplif...

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Discussion

Cette étude démontre l’utilité du séquençage Oxford Nanopore à lecture longue combinée à une approche multi-locus ciblée pour un génotypage rapide et fiable de Toxoplasma gondii. En nous concentrant sur deux loci antigéniques de surface bien caractérisés, SAG2 et SAG3, nous établissons une preuve de concept pour le séquençage multi-locus basé sur Oxford Nanopore grâce à des analyses comparatives des souches RH (Type I) et ME49 (Type II), démontrant la capacité ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

Ce travail a été financé par le ministère égyptien de l’Enseignement supérieur et de la Recherche scientifique, représenté par le Bureau égyptien des affaires culturelles et éducatives à Londres, et par l’UKRI MRC (MR/X502947/1). La figure 1 a été créée avec BioRender.com

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Agarose powderThermo Fisher Scientific16500100Pour l'électrophorèse sur gel
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific11995065Milieu de culture cellulaire
epi2me-labs/wf-amplicon Nextflow workflow (v1.2.1)Oxford Nanopore Technologies, UKN/AFlux de travail Nextflow pour le traitement et l'analyse des données de séquençage des amplicons nanopores; la version 1.2.1 a été utilisée pour une analyse reproductible des données MinION.
epi2me-labs/wf-alignment Nextflow workflow (v1.2.3)Oxford Nanopore Technologies, UKN/AFlux de travail Nextflow pour l'alignement des lectures de séquençage nanopores sur des séquences de référence et la visualisation intégrée utilisant IGV; la version 1.2.3 a été utilisée pour une analyse reproductible des données MinION.
Ethyl alcohol, pureMerck Life Science51976-500ML-FPour le nettoyage des billes
Fetal bovine serum (FBS)Sigma-AldrichMFCD00132239Supplément pour la culture cellulaire
Flow Cell Wash KitOxford Nanopore TechnologiesEXP-WSH004Nettoyage de la cellule de flux
GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder (10 kb)Thermo Fisher ScientificSM1331Confirmation de la taille
HFF-1 human foreskin fibroblast cell lineAmerican Type Culture Collection (ATCC)SCRC-1041Fibroblastes dermiques humains isolés de prépuce néonatal; utilisés pour la propagation des parasites
MinION Flow Cell (R10.4.1)Oxford Nanopore TechnologiesFLO-MIN114Cellule de flux pour le séquençage
MinION Mk1B Sequencing DeviceOxford Nanopore Technologies, UKMIN-101BSéquenceur nanopores; le séquençage a été effectué à l'aide du logiciel MinKNOW (v25.09.16) pour le contrôle de l'appareil et l'appel de bases en temps réel.
MinKNOW SoftwareOxford Nanopore Technologies, UKN/ALogiciel utilisé pour le contrôle de l'appareil MinION Mk1B, le séquençage en temps réel et l'appel de bases; version 25.09.16.
Native Barcoding Kit 24 V14Oxford Nanopore TechnologiesSQK-NBD114.24Barcode pour les échantillons multiplexés
NEB Blunt/TA Ligase Master MixNew England BiolabsM0367Ligation d'ADN
NEBNext Quick Ligation ModuleNew England BiolabsE6056Module de ligation d'adaptateurs
NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer (5×)New England BiolabsB6058Utilisé dans la liaison d'ADN
NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing ModuleNew England BiolabsE7546Préparation de la bibliothèque
Nuclease-free waterThermo Fisher ScientificR0581Grade de biologie moléculaire
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit Macherey-Nagel740609.5Purification du produit PCR
Penicillin–Streptomycin (1%)Thermo Fisher Scientific (Gibco)15140-122Mélange antibiotique
Phosphate-buffered saline (PBS)Thermo Fisher Scientific (Gibco)10010023Tampon de lavage
Q5 High-Fidelity 2× Master MixNew England BiolabsM0492SPolymérase haute précision
QIAamp DNA Blood Mini KitQiagen69504Extraction d'ADN
Quick T4 DNA LigaseNew England BiolabsM2200Enzyme de liaison d'adaptateurs
SYBR Safe DNA Gel StainThermo Fisher ScientificS33102Colorant de coloration d'ADN
TriTrack DNA Loading Dye (6×)Thermo Fisher ScientificR1161Chargement des échantillons dans le gel
Trypsin–EDTA (0.25%)Thermo Fisher Scientific (Gibco)25200056Pour le passage des HFF
1× TAE ou 1× TBE buffer——Tampon de migration
2× PCR premix——Mélange prêt pour PCR

Références

  1. Uzelac, A., Djurkovic-Djakovic, O. Isolation, genotyping and phenotyping Toxoplasma gondii in Europe - A critical perspective. Food Waterborne Parasitol. 40, e00279(2025).
  2. Yaman, Y., Bay, V., Kişi, Y. E. Discovery of host genetic factors through multi-locus GWAS against toxoplasmosis in sheep: addressing one health perspectives. BMC Veterinary Research. 21 (1), 263(2025).
  3. Khedr, A. A., et al. Exploring the role of chitosan and curcumin-loaded chitosan nanoparticles against chronic Toxoplasma infection in experimental mice. Scientific Reports. 15 (1), 41765(2025).
  4. Joeres, M., et al. Genotyping of European Toxoplasma gondii strains by a new high-resolution next-generation sequencing-based method. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 43 (2), 355-371 (2024).
  5. Gohar, Y., et al. Intra-strain genetic heterogeneity in Toxoplasma gondii ME49: Oxford Nanopore long-read sequencing reveals copy number variation in the ROP8-ROP2A locus. BMC Genomics. 26 (1), 1094(2025).
  6. Koutsogiannis, Z., Denny, P. W. Rapid genotyping of Toxoplasma gondii isolates via Nanopore-based multi-locus sequencing. AMB Express. 14 (1), 68(2024).
  7. DNeasy Blood & Tissue Kit Handbook. , QIAGEN. (2023).
  8. User manual PCR clean-up and Gel extraction. , MACHEREY-NAGEL. (2024).
  9. Karst, S. M., et al. High-accuracy long-read amplicon sequences using unique molecular identifiers with Nanopore or PacBio sequencing. Nature Methods. 18 (2), 165-169 (2021).
  10. Yu, P. -L., et al. Next-generation fungal identification using target enrichment and Nanopore sequencing. BMC Genomics. 24 (1), 581(2023).
  11. Vilares, A., et al. Towards a rapid sequencing-based molecular surveillance and mosaicism investigation of Toxoplasma gondii. Parasitology Research. 119 (2), 587-599 (2020).
  12. Fazaeli, A., Ebrahimzadeh, A. A new perspective on and re-assessment of SAG2 locus as the tool for genetic analysis of Toxoplasma gondii isolates. Parasitology Research. 101 (1), 99-104 (2007).
  13. Targa, L. S., et al. Toxoplasma gondii SAG2, SAG3 and GRA6 alleles and single nucleotide polymorphism in congenital infections with known parasite load and clinical outcome. Rev Inst Med Trop Sao Paulo. 65, e8(2023).
  14. Rico-Torres, C. P., et al. Can cloning and sequencing help to genotype positive Toxoplasma gondii clinical samples? Results and validation using SAG3 as a model. Infect Genet Evol. 101, 105283(2022).
  15. Sanchez, S. G., Besteiro, S. The pathogenicity and virulence of Toxoplasma gondii. Virulence. 12 (1), 3095-3114 (2021).

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