Article de méthode

Dispositif millifluidique en culture continue pour l’étude d’Escherichia coli dans des conditions nutritives faibles et fluctuantes

DOI :

10.3791/70652

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7 juillet 2026

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1Department of Civil, Environmental and Geomatic Engineering, Institute of Environmental Engineering, ETH Zurich, 2Department of Mechanical Engineering, Ulsan National Institute of Science and Technology (UNIST), 3Department of Plant and Environmental Sciences, Institute of Life Sciences, The Hebrew University of Jerusalem, 4Department of Water Resources and Drinking Water, Swiss Federal Institute of Aquatic Science and Technology (Eawag)

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous présentons un protocole pour le dispositif de culture continue millifluidique (MCCD), qui permet la culture de populations bactériennes sous des conditions constantes de pauvres nutriments (jusqu’à des centaines de concentrations nanomolaires) ou des fluctuations temporelles de nutriments sur une échelle de temps intime.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les habitats microbiens dans la nature se caractérisent souvent par de faibles concentrations de nutriments mixtes, une hétérogénéité spatiale et des fluctuations temporelles. Cependant, les méthodes traditionnelles de culture en laboratoire ne parviennent pas à reproduire ces conditions. Les cultures en lots ne peuvent pas soutenir la croissance dans des environnements pauvres en nutriments, tandis que les chémosétats maintiennent une croissance stable avec un seul nutriment limitant, mais sont difficiles à mettre en œuvre lorsque l’objectif est de maintenir des concentrations définies faibles de mélanges nutritifs ou d’introduire des fluctuations rapides. Les systèmes microfluidiques génèrent des environnements dynamiques mais produisent une biomasse insuffisante pour des analyses omiques au niveau de la population. Pour remédier à ces limitations, nous introduisons le dispositif de culture millifluidique continue (MCCD), une plateforme polyvalente pour étudier les réponses microbiennes à des conditions nutritives stables et fluctuantes. Le MCCD abrite des populations bactériennes à l’intérieur d’un filtre Sterivex (membrane filtrante poreuse de fluorure de polyvinylidène [PVDF] à 0,45 μm), où un flux continu de milieu maintient des conditions de culture stables tout en empêchant la déplétion des nutriments. Un système de électrovannes à trois voies, contrôlé via un logiciel Matlab personnalisé, permet des fluctuations précises des nutriments à l’échelle de la minute. Ce protocole fournit un guide étape par étape pour faire fonctionner le MCCD en deux modes : (1) des conditions constantes pauvres en nutriments et (2) des conditions fluctuantes de nutriments. Grâce à ce système, Escherichia coli a grandi de façon exponentielle dans un mélange d’acides aminés et de nucléobases présents à des dizaines à des centaines de concentrations nanomolaires, atteignant des concentrations cellulaires de l’ordre de 109 cellules/mL. En recréant des caractéristiques clés des habitats microbiens naturels, le MCCD permet l’étude de la croissance bactérienne et de la physiologie dans des conditions contrôlées mais écologiquement pertinentes chez E. coli et d’autres espèces microbiennes.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les bactéries dans les habitats naturels rencontrent un paysage nutritif qui varie souvent en composition et concentration, et peut fluctuer sur une large plage de temps1, 2, 3, 4. Dans des environnements tels que l’océan5, le sol3 et l’intestin6, la croissance microbienne est fréquemment limitée par un ou plusieurs nutriments essentiels, et la disponibilité des nutriments peut varier en raison de processus physiques, chimiques etbiologiques 4. Ces mélanges de nutriments et leurs fluctuations stimulent les stratégies microbiennes de survie et de croissance, façonnant les réponses à différents niveaux d’organisation biologique4.

Les adaptations microbiennes à la dynamique des nutriments se produisent au niveau de la communauté, de la population et de cellules uniques. Au niveau de la communauté, les fluctuations peuvent favoriser la coexistence desespèces 7, coordonner la composition de la communauté et l’activité métabolique avec la variationtemporelle 8, et créer des opportunités pour que de nouvelles espèces colonisent9. Au niveau de la population, l’évolution des conditions nutritives peut accélérer l’évolution en sélectionnant pour des changements génétiques10 ou induire une variabilité phénotypique, y compris les stratégies de couverturede paris 11, qui améliorent la survie dans des conditions imprévisibles. Au niveau unicellulaire, les bactéries ajustent leur physiologie en réponse à l’environnement nutritif12,13. Un exemple récemment rapporté est une physiologie spécifique qui confère aux bactéries un avantage de croissance dans des conditionsfluctuantes 14. Parce que les bactéries rencontrent fréquemment des limitations de nutriments, étudier leur réponse à des conditions faibles et variables en nutriments — tant en tant que cellules individuelles qu’au sein de populations ou communautés — est essentiel pour comprendre leur comportement dans leur environnement naturel.

Les chémosétats sont bien adaptés pour étudier la croissance sous la limitation d’un seul nutriment, mais sont difficiles à utiliser lorsque l’objectif est de contrôler la concentration de plusieurs nutriments dans des mélanges à faible concentration. Les chémostats ont été des outils précieux pour étudier l’adaptation bactérienne à la limitation des nutriments en offrant un environnement bien contrôlé et stable. Cependant, leur fonctionnement les limite intrinsèquement à des conditions où la croissance est limitée par un seul élément nutritif essentiel. Dans un chimiotate, le taux de dilution est ajusté de sorte que la croissance cellulaire équilibre l’apport d’un nutriment limitant, fixant ainsi le taux de croissance plutôt que les concentrations individuellesde 15. Ce cadre ne se généralise pas facilement aux environnements contenant des mélanges de nutriments substituables — tels que plusieurs sources de carbone — car le taux de dilution ne contrôle que le taux global de croissance, et non les concentrations de chaque composant dans lemilieu 16,17. En conséquence, les concentrations de nutriments individuels et leurs schémas de co-utilisation émergent de l’utilisation microbienne plutôt que d’être prescrits à l’externe16,17.

De plus, bien que des fluctuations nutritives puissent être induites dans les chémostats, des fluctuations rapides ou des décalages uniques à l’échelle de quelques minutes sont difficiles à atteindre en raison des volumes généralement élevés de culture. Les dispositifs microfluidiques se sont imposés comme des outils puissants pour créer des environnements nutritifs précis à faible concentration etfluctuants 14. Associées à la microscopie vidéo, elles permettent de mesurer la croissance des cellules uniques. Bien que les systèmes microfluidiques permettent de quantifier l’expression de protéines sélectionnées à l’aide de rapporteurs fluorescents, contrairement aux chémostrats, les dispositifs microfluidiques typiques sont trop petits pour produire la biomasse nécessaire à des analyses omiques, par exemple pour étudier le protéome d’une population bactérienne. Pour combler cet écart, nous avons développé le dispositif de culture continue millifluidique (MCCD).

Le MCCD permet la croissance bactérienne dans des conditions nutritives contrôlées, y compris des conditions constantes pauvres en nutriments avec un épuisement minimal ou nul, ainsi que des conditions nutritives fluctuantes, grâce à un système de culture à flux continu capable de générer suffisamment de biomasse pour des analyses en aval. Le MCCD utilise un filtre PVDF de 0,45 μm comme récipient de culture, dans lequel le milieu est continuellement rempli par une pompe péristaltique délivrant un milieu frais depuis un réservoir (Figure 1A). La membrane poreuse du filtre retient les bactéries tout en permettant un flux prescrit de nutriments, ce qui empêche la déplétion des nutriments même à de faibles concentrations (de plusieurs centaines de nanomolaires à micromolaires). Parce que la biomasse est retenue tandis que le milieu frais circule continuellement à travers l’appareil, le MCCD partage des similitudes avec les rétentostats18, dans lesquels les cellules sont retenues pendant le renouvellement du milieu. Cependant, le MCCD diffère des rétentostats classiques par son architecture et son mode d’administration des nutriments. Le rétentostat fonctionne généralement comme un réacteur en vrac agité, où les cellules sont suspendues dans un volume de culture bien mélangé. Dans de telles conditions, la disponibilité des nutriments dépend de l’équilibre entre mélange, diffusion et absorption cellulaire, et une déplétion locale ou des gradients peuvent survenir, en particulier à faibles concentrations de nutriments et à de fortes densités cellulaires. En revanche, dans le MCCD, les cellules s’assemblent directement sur la membrane à l’intérieur de la cartouche Sterivex de petit volume, formant des couches de seulement quelques cellules d’épaisseur qui sont continuellement exposées à un milieu en mouvement. Aucun mélange actif n’est imposé à l’intérieur de la cartouche ; au lieu de cela, le milieu est homogénéisé en amont et livré par un débit continu. Les nutriments sont fournis par un transport convectif à travers les couches cellulaires minces, et comme la distance de diffusion est faible et le débit élevé, les gradients locaux de nutriments sont minimisés. En conséquence, les conditions nutritives ressenties par la population sont principalement déterminées par la composition du milieu entrant, permettant des conditions pauvres en nutriments plus constantes et bien définies que celles possibles dans les systèmes de rétention agités.

figure-introduction-1
Figure 1 : Le dispositif de culture millifluidique continue (MCCD) pour la culture bactérienne dans des conditions nutritives de faible concentration ou fluctuantes. (A) Schéma du MCCD pour des conditions nutritives constantes. Une pompe péristaltique entraîne le flux d’un milieu frais depuis un réservoir à travers un filtre PVDF de 0,45 μm contenant des cellules bactériennes. La membrane poreuse du filtre retient les bactéries tout en laissant passer le milieu à travers. Le flux continu du milieu maintient des conditions nutritives constantes à l’intérieur du filtre, même à des concentrations très faibles. (B) Schéma du MCCD pour les fluctuations des conditions nutritives. Une électrovanne à trois voies contrôlée par logiciel, en amont de la pompe péristaltique, alterne l’apport du milieu entre deux réservoirs (par exemple, concentration élevée en nutriments, CÉlevé, et faible concentration en nutriments, CBasse). Le logiciel contrôle la position du plongeur de la vanne pour déterminer la source d’entrée active. (C) Assemblage fluidique pour des conditions nutritives constantes. Un bouchon avec trois tubes en silicone qui le traversent scelle la bouteille contenant un médium frais. Un tube est relié à un filtre de ventilation pour l’aération, tandis que les deux autres transportent le milieu vers les filtres. Des raccords Luer barbe-mâle relient ces tubes au tube péristaltique, et relient chaque tube péristaltique à un clapet anti-retour unidirectionnel, servant de point d’entrée au filtre. La sortie du filtre est également équipée d’un clapet anti-retour unidirectionnel. L’image montre deux échantillons, chacun contenu dans un seul filtre. (D) Assemblage fluidique pour les fluctuations des conditions nutritives. La plateforme métallique abrite le microcontrôleur et les composants électroniques contrôlant deux électrovannes via un logiciel MATLAB personnalisé. Des raccords filetés-à-barbes relient à la fois les entrées et sorties des électrovannes au tube. Chaque valve possède deux entrées pour les deux milieux alternatifs : ici un milieu à haute concentration nutritive, C High, tubes rouges marqués, et un milieu à faible concentration nutrimentaire, CLow, tubulaires bleus. Les supports sont contenus dans des bouteilles bouchées avec un filtre d’évent, comme dans (C). Les sorties des électrovannes se connectent aux filtres via un tube péristaltique, comme dans l’ensemble à régime permanent (C). L’image montre deux échantillons, chacun contenu dans un seul filtre. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

De plus, l’intégration d’une électrovanne à trois voies contrôlée par logiciel, en amont du filtre Sterivex, permet à l’utilisateur de commuter le débit du milieu entre deux milieux contenus dans différents réservoirs (Figure 1B). Ainsi, l’appareil peut être utilisé pour étudier la réponse des bactéries à un environnement stable à une condition nutritive constante (y compris à faible concentration), soit à des fluctuations nutritives, avec des échelles de fluctuation de plusieurs minutes ou plus.

Ce protocole décrit l’assemblage et le fonctionnement du MCCD pour étudier les bactéries dans des conditions pauvres en nutriments et en fluctuations. À titre d’exemple, ce protocole fournit un guide étape par étape pour mener une expérience de croissance utilisant Escherichia coli NCM3722 dans deux modes de fonctionnement du MCCD : des conditions constantes pauvres en nutriments et des conditions nutritives fluctuantes. La configuration MCCD peut être facilement adaptée à d’autres conditions nutritives et espèces microbiennes, ce qui en fait une plateforme polyvalente pour étudier la physiologie bactérienne dans des environnements nutritifs typiques de ceux rencontrés dans la nature.

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Protocole

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1. Croissance bactérienne dans des conditions nutritives constantes

REMARQUE : Ce protocole décrit la procédure pour réaliser une courbe de croissance d’E. coli NCM3722 dans une condition très diluée à Milieu Riche Défini (« faible RDM »). Cette courbe de croissance dure 12 heures, avec un échantillon prélevé toutes les 2 heures (soit un total de 6 points temporels). Le principe clé de ce protocole est que chaque point temporel correspond à un seul filtre Sterivex (désordonné appelé filtre PVDF 0,45 μm). Pour collecter un échantillon, la culture à l’intérieur du filtre est récupérée en centrifugant la tête en bas, le nombre de cellules est quantifié, et le filtre est jeté. Chaque filtre PVDF de 0,45 μm ne produit qu’un seul échantillon. La préparation de l’expérience nécessite la définition de trois paramètres expérimentaux clés : le débit de la pompe péristaltique, la durée de l’expérience et le nombre souhaité d’échantillons (c’est-à-dire le nombre de filtres PVDF de 0,45 μm). Réglez le débit initial à 2 mL/min. Ajustez ce paramètre selon les besoins (par exemple, augmenter le débit pour maintenir l’apport d’un nutriment très dilué).

  1. Préparation du support et des matériaux
    REMARQUE : Puisque chaque filtre correspond à un seul échantillon temporel, le temps d’exécution expérimental de chaque filtre PVDF à 0,45 μm varie selon son temps de collecte (par exemple, 2 h pour le premier point temporel, 4 h pour le second, etc.).
    1. Estimez le volume de médium de culture requis en utilisant la formule
      figure-protocol-1,
      où n est le nombre d’échantillons (filtres PVDF de 0,45 μm), Q est le débit (en mL/min), et ti est le temps d’exécution expérimental (en minutes) pour chaque échantillon.
    2. Multipliez par 1,2 pour inclure un volume supplémentaire de 20 % afin de tenir compte de la variation du débit. Pour cet exemple, calculez
      figure-protocol-2
    3. Arrondi le volume calculé à la hausse (par exemple, préparer 6 200 mL dans cet exemple).
    4. Préparez le matériau pour la stérilisation (voir Tableau 1).
      REMARQUE : Préparez et stérilisez les matériaux la veille de l’expérience afin d’assurer leur préparation et de minimiser les retards. Autoclave ces matériaux, à l’exception des soupapes Luer unidirectionnelles ; Stérilisez les valves avec 70 % d’éthanol.
      1. Reliez les deux extrémités de six tubes péristaltiques en silicone à des raccords en plastique « Male Luer to Barb » en insérant l’extrémité Barb du raccord dans le tube. Couvrez les extrémités mâles du Luer avec du papier aluminium pour éviter toute contamination.
        REMARQUE : Six tubes péristaltiques sont préparés car l’expérience utilise six filtres PVDF de 0,45 μm. Tous les tubes seront ensuite montés sur la même tête de pompe péristaltique afin que tous les filtres reçoivent un débit identique.
      2. Placez le tube dans un contenant fermé et stérilisable.
      3. Placez les filtres de ventilation dans un contenant fermé et stérilisable.
      4. Placez les bouchons en tube avec des tubes en silicone qui traversent les bouchons à l’intérieur d’un contenant fermé et stérilisable.
        REMARQUE : Les bouchons de bouteilles en tube utilisés dans ce protocole sont équipés de trois tubes qui traversent les bouchons : deux tubes de diamètre égal pour délivrer le milieu vers les filtres PVDF de 0,45 μm, et un troisième tube de diamètre plus large. Ces tubes sont solidement fixés aux capuchons et ne peuvent pas être retirés.
      5. Immergez 12 clapets anti-retour Luer unidirectionnels dans une solution à 70 % d’éthanol et laissez-les stériliser toute la nuit.
        NOTE : (POINT DE PAUSE) Les matériaux stérilisés peuvent être conservés immergés et scellés à température ambiante jusqu’à 24 heures avant l’expérience. Avant utilisation, retirez les valves de l’éthanol et rincez avec de l’eau ultra-pure stérile pour éliminer les résidus d’éthanol. Alternativement, les clapets anti-retour peuvent être imprimés en 3D à l’aide de matériaux autoclavables pour permettre la stérilisation par autoclavage plutôt que par traitement à l’éthanol.
    5. Autoclave les tubes péristaltiques, les filtres d’aération, les bouchons de bouteilles, le cylindre gradué et les bouteilles en utilisant des réglages standards de laboratoire.
    6. Préparez 6 200 mL de milieux à faible richesse définie (RDM ; voir Tableau des matériaux) en mélangeant les réactifs listés dans le Tableau 2.
      REMARQUE : Préparez le milieu le jour de l’expérience, pendant la période d’attente d’environ 5 heures suivant le début de la pré-culture (voir étape 1.2.1). Cela permet de conserver la fraîcheur moyenne et de minimiser le risque de contamination.
  2. Préparation d’une pré-culture bactérienne
    REMARQUE : Utilisez une pré-culture en phase exponentielle pour commencer l’expérience. Durant cette phase, les bactéries croissent à un rythme constant, synthétisant les constituants cellulaires de manière équilibrée et se divisant à une masse cellulaire définie. Utilisez des cellules en phase exponentielle pour minimiser la variabilité et standardiser l’état physiologique de départ.
    1. La veille de l’expérience, préparez une culture (ON) pour la nuit comme suit : inoculez 3 mL de RDM complet avec un stock congelé de glycérol d’E. coli NCM3722 dans un tube de culture stérile de 15 mL. Incubez la culture toute la nuit (~16 h) à 37 °C avec un secouement à 200 tr/min dans un incubateur secouant.
      NOTE : (POINT DE PAUSE) Une fois la culture ON dans l’incubateur, aucune autre étape n’est suivie ce jour-là. Reprenez le protocole le lendemain en passant à l’étape 1.2.2.
    2. Le jour de l’expérience, préparez la pré-culture comme suit : ajouter 6 μL de culture ON à 6 mL de RDM complet. Divisez également en deux tubes de culture de 15 mL et étiquetez les tubes comme A et B. Incubez les deux tubes à 37 °C en secouant à 200 tr/min.
      REMARQUE : La pré-culture nécessite généralement environ 5 h pour atteindre la phase exponentielle (OD600 ≈ 0,5). Utilisez cette période pour préparer le milieu frais (voir étape 1.1.6). Ne pas passer à l’étape 1.2.3 tant que OD600 n’atteint pas environ 0,5.
    3. Surveillez la densité optique (OD) à 600 nm à l’aide du tube B. Poursuivez l’expérience lorsque OD600 atteint environ 0,5, indiquant une croissance exponentielle en RDM complet pour E. coli NCM3722 (voir section 1.4).
      REMARQUE : Commencez l’expérience avec des cellules à phase exponentielle afin d’améliorer la reproductibilité et de standardiser les conditions de départ.
  3. Préparation d’une expérience dans le MCCD avec des conditions nutritives constantes
    REMARQUE : Effectuez les étapes 1.3.1 à 1.3.5 à l’intérieur d’un cabinet de biosécurité stérile immédiatement après le début de la croissance de la pré-culture.
    1. Allouez le volume moyen total à chaque bouteille.
      REMARQUE : Utilisez les bouteilles comme réservoirs moyens. Utilisez des bouchons de bouteille équipés de deux tubes à débit moyen, chaque tube délivrant un moyen à un filtre PVDF de 0,45 μm. Allouer le volume total du médium (préparé à l’étape 1.1.6) entre les bouteilles en fonction de la quantité requise par chaque échantillon temporel (c’est-à-dire chaque filtre PVDF de 0,45 μm) au cours de l’expérience.
      1. Utilisez la formule fournie à l’étape 1.1.1 pour déterminer le volume de milieu nécessaire à chaque filtre PVDF de 0,45 μm. Par exemple, en utilisant les termes suivants :
        figure-protocol-3
        Les volumes moyens totaux requis pour chaque moment, dans l’ordre chronologique, sont de 288, 576, 864, 1152, 1440 et 1728 mL.
      2. Répartir les volumes moyens calculés entre les bouteilles, en regroupant les volumes nécessaires pour deux points temporels en une seule bouteille. Par exemple : ~900 mL dans une bouteille de 1 L (pour les points de temps 1 et 2), ~2 100 mL dans une bouteille de 2,5 L (pour les points de temps 3 et 4), ~3200 mL du médium dans une bouteille de 4 L (pour les points de temps 5 et 6).
    2. Scellez chaque bouteille avec des bouchons tubulaires (Figure 1C). Serrez les bouchons solidement pour éviter les fuites.
    3. Connectez un filtre de ventilation de 0,2 μm au tube en silicone le plus large s’étendant depuis le bouchon tubulaire (Figure 1C). Cela permet un échange d’air stérile pendant l’expérience.
    4. Fixez une extrémité de chaque tube péristaltique (avec les raccords déjà fixés ; voir section 1.1.4 sur la préparation du matériau) aux tubes en silicone de plus petit diamètre s’étendant depuis les bouchons tubulaires (Figure 1C). Assurez-vous de connexions sécurisées pour maintenir la stérilité. Laissez le couvercle en aluminium sur le raccord de verrouillage mâle libre du Luer jusqu’au début de l’expérience pour éviter toute contamination.
    5. Placez les bouteilles avec leurs tubes assemblés et la pompe péristaltique dans un incubateur réglé à 37 °C. Fixez le tube dans les canaux de la tête de pompe péristaltique.
      REMARQUE : Tous les tubes péristaltiques sont montés sur la même tête de pompe qu’une seule pompe péristaltique, de sorte que tous les filtres PVDF de 0,45 μm reçoivent un milieu provenant d’une même pompe. L’utilisation d’une seule pompe garantit que le débit est identique entre les filtres et évite la variabilité pouvant résulter des différences entre les pompes.
  4. Protocole d’une expérience dans le MCCD avec des conditions nutritives constantes
    1. Diluez la pré-culture (OD = 0,5) à 1:10 en ajoutant 600 μL de pré-culture à 5,4 mL de RDM frais faible.
    2. À l’aide d’une pipette de 1 mL, introduisez 1 mL de pré-culture diluée dans chacun des six filtres PVDF de 0,45 μm.
    3. Rincez les clapets anti-retour unidirectionnels avec de l’eau ultrapure autoclavée et fixez-en un à chaque extrémité de chaque filtre PVDF de 0,45 μm.
    4. Retirez les couvercles en aluminium des raccords du tube péristaltique.
    5. Reliez chacun des six filtres PVDF de 0,45 μm à un raccord Luer mâle sur le tube péristaltique (Figure 1C).
    6. Réglez le débit à 2 mL/min sur la pompe péristaltique et lancez le débit. Définissez ce moment comme le temps 0.
    7. Placez un récipient à déchets sous les filtres PVDF de 0,45 μm pour collecter l’écoulement d’évacuation.
      REMARQUE : La figure 2A montre l’ensemble complet de l’expérience à l’intérieur de la boîte de l’incubateur.
  5. Collecte d’échantillons
    1. Après 2 heures, débranchez l’un des deux filtres PVDF de 0,45 μm reliés à la bouteille de 1 L.
    2. Dévissez les clapets anti-retour unidirectionnels et placez le filtre PVDF à 0,45 μm dans un tube centrifugeuse de 50 mL avec l’entrée orientée vers le bas.
    3. Centrifugez le tube de centrifugeuse contenant le filtre PVDF à 0,45 μm à 2 000 × g pendant 2 minutes.
    4. À l’aide d’un coupe-tuyaux, appliquez une pression douce sur l’enveloppe en plastique à l’extrémité la plus proche de la sortie pour ouvrir le filtre PVDF de 0,45 μm.
      REMARQUE : Désinfectez le découpe-tuyaux avant l’utilisation (par exemple, en essuyant avec 70 % d’éthanol) pour éviter toute contamination lors de l’ouverture du filtre PVDF à 0,45 μm.
    5. Relâchez le cylindre intérieur contenant la membrane poreuse et jetez la section du filtre qui soutient la membrane.
    6. Rincez les parois internes de l’enveloppe de filtre PVDF de 0,45 μm (celles perpendiculaires à la direction d’écoulement) avec le milieu de culture recueilli dans le tube centrifugeuse.
      REMARQUE : Cette étape garantit que toutes les cellules piégées sur les parois lors de la centrifugation sont collectées.
    7. Mesurez le volume total collecté à l’aide d’une pipette sérologique de 5 mL.
    8. Aux points temporels suivants (4 h, 6 h, 8 h, 10 h et 12 h), débranchez les filtres PVDF correspondants de 0,45 μm et répétez les étapes 1,5.2–1.5.6. Suivez cet ordre précis :
      1. À 4 heures, débranchez le second filtre PVDF de 0,45 μm relié à la bouteille de 1 L.
      2. À 6 h et 8 h, débranchez les filtres PVDF de 0,45 μm reliés à la bouteille de 2,5 L.
      3. À 10 h et 12 h, débranchez les filtres PVDF de 0,45 μm reliés à la bouteille de 4 L.
        REMARQUE : Suivez cet ordre pour faire correspondre les points de temps d’échantillonnage aux volumes moyens distribués à l’étape 1.3.1.
  6. Analyses en aval
    1. Prenez trois aliquotes de 100 μL de chaque échantillon et fixez-les avec du glutaraldéhyde jusqu’à une concentration finale de 1,5 %.
      ATTENTION : Le glutaraldéhyde est toxique, un irritant puissant et un sensibilisateur potentiel. Manipulez à l’intérieur d’une hotte chimique tout en portant un équipement de protection individuelle approprié (blouse de laboratoire, gants en nitrile et lunettes de sécurité). Évitez le contact cutané et l’inhalation. Éliminer les déchets contenant du glutaraldéhyde conformément à la réglementation institutionnelle sur les déchets chimiques dangereux.
    2. Utilisez les échantillons fixes pour compter le nombre de cellules par microlitre avec la cytométrie en flux après marquage avec un colorant d’ADN fluorescent.
      ATTENTION : Les colorants d’ADN fluorescents peuvent être mutagèniques. Portez des gants et jetez les déchets contenant des colorants conformément aux réglementations institutionnelles sur la biosécurité.
      REMARQUE : En alternative à la coloration de l’ADN et à la cytométrie en flux, les densités cellulaires peuvent être estimées en plaquant un petit volume de l’échantillon sur des plaques d’agar riches à milieu (par exemple, LB agar) et en comptant les unités formant des colonies (UFC).
    3. Multipliez le nombre de cellules par microlitre par le volume total mesuré à l’étape 1.5.7 pour calculer le nombre total de cellules contenues dans le filtre PVDF de 0,45 μm.
    4. Centrifugez le volume restant dans des tubes microcentrifuge de 1,5 mL à 10 000 × g pendant 4 minutes.
    5. Retirez le surnageant.
    6. Stockez les granulés de cellules à -80 °C pour des analyses futures (par exemple, transcriptomique).

figure-protocol-4
Figure 2 : Assemblage expérimental du MCCD. (A) Photographie de l’installation MCCD pour des conditions nutritives constantes. L’installation est logée dans une boîte incubatrice pour maintenir une température constante, avec un récipient à déchets recueillant le milieu de passage à l’eau. (B) Photographie de l’installation MCCD pour les fluctuations des conditions nutritives. La bouteille étiquetée avec du ruban rouge contient un milieu à haute concentration nutritive (CÉlevé), tandis que la bouteille avec du ruban bleu contient un milieu à faible concentration en nutriments (CFaibles). La plateforme métallique au centre soutient les composants qui contrôlent les fluctuations des nutriments, correspondant à celles décrites à la Figure 1D. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

2. Croissance bactérienne dans des conditions à nutriments fluctuants

  1. Assemblage d’un contrôleur pour une électrovanne
    REMARQUE : Contrôlez la valve électrosolénoïde à trois voies à l’aide d’un circuit de commutation basé sur un microcontrôleur connecté à un ordinateur utilisant une interface graphique (GUI) personnalisée développée dans MATLAB.
    1. Assemblez le circuit de commande de la vanne solénoïde (Figure 3A).
      1. Connectez une broche de sortie numérique du microcontrôleur à la base d’un transistor NPN via une résistance de 1 kΩ.
      2. Connectez le collecteur du transistor à la borne négative de la électrovanne.
      3. Connectez l’émetteur du transistor à la terre.
      4. Connectez la borne positive de la solénoïde à une alimentation externe en courant continu compatible avec la tension de la vanne.
      5. Placez une diode sur les bornes du solénoïde. Reliez le côté rayé de la diode à la conduite d’alimentation positive.
        REMARQUE : La diode supprime les pics de tension générés lorsque le solénoïde est éteint.
    2. Fixez des raccords en plastique « Fileté à la barbe de tuyau » aux électrovannes, en assurant que l’extrémité de la barbille s’étende vers l’extérieur.
    3. Installez MATLAB R2022b ou une version ultérieure sur un ordinateur avec connectivité USB.
    4. Installez le package de support MATLAB nécessaire pour la communication série avec le matériel du microcontrôleur.
    5. Connectez la carte microcontrôleur à l’ordinateur à l’aide d’un câble USB pour établir une communication série.
    6. Ouvrez l’interface graphique basée sur MATLAB utilisée pour générer des conditions nutritives fluctuantes dans le MCCD (disponible dans le lien https://github.com/juanitaLara/MCCD).
    7. Vérifiez la connexion entre les électrovannes et la plateforme MATLAB GUI :
      1. Ouvrez la plateforme GUI dans Matlab et cliquez sur le bouton Connect (Figure 3B). Attendez que le message que le contrôleur connecté apparaisse avec succès dans la fenêtre de commandes.
      2. Saisissez une valeur pour le pas de temps (par exemple, 5 s pour les phases Haut et Bas) sous le panneau d’opérations automatisées .
      3. Observez les électrovannes et écoutez le bruit de clic qu’elles produisent lors du passage entre les deux supports.
      4. À l’aide d’une montre, vérifiez que les électrovannes commutent exactement à l’intervalle spécifié (par exemple, tous les 5 s).
        REMARQUE : Effectuez cette vérification avant chaque expérience pour confirmer la communication et la commutation correcte des valves. (POINT DE PAUSE) Après vérification du fonctionnement de la valve électrogéniale, le système peut rester assemblé à l’intérieur de l’incubateur pendant plusieurs heures avant de commencer l’expérience.
  2. Préparation des supports et des matériaux
    REMARQUE : Ce protocole consiste à alterner les conditions nutritionnelles entre une GDR faible et élevée sur une période d'1 h (30 minutes en RDM élevée suivies de 30 minutes en RDM faible). L’expérience se déroule sur trois heures de fluctuations, avec deux échantillons prélevés : (1) à 3 h 1 min (phase RDM élevée, immédiatement après le passage de basse à élevée), et (2) à 3 h 31 min (phase RDM basse, immédiatement après le passage de haute à basse).
    1. Estimer les volumes requis de milieux de culture par phases expérimentales.
      1. D’abord, calculez les volumes nécessaires pour les 3 premières heures (trois périodes complètes de fluctuation) :
        faible volume RDM = 1,2 × 2[mL/min] × 90[min] × 2[filtres PVDF 0,45 μm] = 432[mL]
        volume RDM élevé =1,2 × 2[mL/min] × 90[min] × 2[filtres PVDF 0,45 μm] = 432[mL]
      2. Calculez le volume nécessaire pour la phase finale de 30 minutes :
        volume RDM élevé = 1,2 × 2[mL/min] × 30[min] × 1[filtres PVDF 0,45 μm] = 72[mL]
      3. Arrondi les volumes à des valeurs pratiques (par exemple, 500 mL de RDM faible et 600 mL de RDM élevé).
    2. Préparez les matériaux pour la stérilisation à l’autoclave (voir Tableau 3) en suivant les étapes 1.1.4 à 1.1.5.
      REMARQUE : Préparez et stérilisez les matériaux la veille de l’expérience afin d’assurer leur préparation et de minimiser les retards le jour de l’expérience (étapes 2.2.3 et 2.2.4). Cette configuration, comparée aux expériences à nutriments constants, nécessite des tubes supplémentaires pour relier directement les bouteilles de média à la vanne solénoïde (Figure 1B,D). Ces tubes ne nécessitent qu’un seul raccord « Barb vers Luer mâle », car les raccords de la soupape solénoïde sont préassemblés. Couvrez les extrémités de ces tubes avec du papier aluminium avant d’autoclaver.
    3. Stérilisez le tube péristaltique préparé, les filtres de ventilation, les bouchons, le cylindre gradué et les bouteilles dans un autoclave.
    4. Immergez 4 clapets anti-retenue Luer unidirectionnels dans une solution à 70 % d’éthanol et laissez-les stériliser toute la nuit.
      NOTE : (POINT DE PAUSE) Les clapets anti-retour stérilisés peuvent rester immergés dans l’éthanol toute la nuit et conservés scellés à température ambiante jusqu’à 24 heures. Avant utilisation, rincez les valves avec de l’eau Milli-Q stérile.
    5. Nettoyez et stérilisez les électrovannes en les rinçant avec de l’éthanol à 70 % 3 à 5 fois, puis de l’eau ultrapure 3 à 5 fois.
    6. Le jour de l’expérience, pendant la période d’attente d’environ 5 heures suivant la préparation pré-culture (voir étape 2.3), préparez 500 mL de RDM faible et 600 mL de RDM élevé en mélangeant les réactifs listés dans le tableau 4.
      REMARQUE : Préparer le support le jour de l’expérience garantit la fraîcheur et minimise les risques de contamination.
  3. Préparation d’une pré-culture bactérienne
    1. Suivez les étapes décrites à l’étape 1.2.
  4. Préparation d’une expérience dans le MCCD avec des conditions nutrimentaires fluctuantes
    REMARQUE : Effectuez les étapes 2.4.1–2.4.4 à l’intérieur d’un cabinet de biosécurité stérile immédiatement après le début de la croissance de la pré-culture.
    1. Placez chaque médium dans une bouteille de 1 L.
    2. Scellez les bouteilles avec des bouchons préassemblés équipés de trois ports et de tubes en silicone préinstallés. Serrez les bouchons solidement pour éviter les fuites.
    3. Connectez un filtre de ventilation de 0,2 μm au large tube en silicone qui s’étend depuis l’un des ports de chaque bouchon.
    4. Reliez le « tuyau d’admission » (montré à la Figure 1D) aux tubes en silicone s’étendant depuis les bouchons tubulaires avant de le connecter aux électrovannes :
      1. Fixez une extrémité du tube en silicone (avec un seul raccord attaché) au tube qui s’étend depuis le bouchon de bouteille RDM bas.
      2. Laissez le couvercle en aluminium sur le raccord libre Male Luer lock jusqu’à ce que les bouteilles soient acheminées à l’incubateur pour éviter toute contamination.
      3. Répétez l’étape 2.4.4.1 pour la bouteille à haut débit de RDM.
    5. Placez les bouteilles avec leur « tuyau d’admission » assemblé, la pompe péristaltique et les électrovannes avec le contrôleur à l’intérieur d’un incubateur réglé à 37 °C.
    6. Reliez le « tube d’admission » (fixé à l’étape 2.4.4) aux entrées des solénoïdes de la manière suivante :
      1. Reliez les deux tubes de la bouteille à faible RDM à l’une des deux entrées de chaque électrovanne (tubes marqués avec du ruban bleu dans la Figure 1D).
      2. Reliez les deux tubes de la bouteille à haute fréquence de débit à l’une des deux entrées de chaque électrovanne (tubes marqués de ruban rouge dans la Figure 1D).
    7. Connectez un tube en silicone compatible pompe péristaltique (avec un seul raccord) à la sortie de chaque électrovanne (Figure 1D). Laissez le couvercle en aluminium sur le raccord libre du verrou Luer mâle jusqu’à ce que l’expérience commence à maintenir sa stérilité.
  5. Protocole d’une expérience dans le MCCD avec des conditions de nutriments fluctuants
    1. Vérifiez la connexion entre les électrovannes et le logiciel Matlab en effectuant l’étape 2.1.7.
    2. Saisissez les valeurs de pas de temps souhaitées pour les fluctuations dans la plateforme graphique de Matlab : Entrez des pas de temps de 1800 s en RDM élevé (30 min) et 1800 s en RDM faible (30 min).
    3. Sélectionnez Faible sous le menu Start pour commencer dans la condition RDM faible (Figure 3).
    4. Semez les deux filtres PVDF de 0,45 μm comme décrit à l’étape 1.4.
    5. Commencez l’expérience.
      REMARQUE : La figure 2B illustre l’ensemble fluidique complet de cette expérience.
  6. Collecte d’échantillons
    1. Prélève des échantillons comme à l’étape 1.5. Récoltez le premier filtre PVDF à 0,45 μm à 3 h 1 min et le second à 3 h 31 min.
      REMARQUE : Débranchez d’abord l’un ou l’autre des filtres ; Les deux filtres sont alimentés par le même support.
  7. Analyses en aval
    1. Suivez les étapes décrites à l’étape 1.6 pour compter le nombre de cellules via cytométrie en flux et pour traiter et stocker des échantillons pour des analyses en aval (par exemple, transcriptomique).

figure-protocol-5
Figure 3 : Contrôleur des électrovannes pour imposer des fluctuations de nutriments. (A) Schéma de câblage du circuit électronique utilisé pour contrôler la électrovanne. Le circuit se compose d’une carte microcontrôleur, d’un transistor utilisé comme élément de commutation, d’une résistance reliée à la base du transistor, et d’une diode à reculer de rebond placée sur la valve solénoïde pour protéger le circuit des pics de tension générés lors de la commutation de la valve. Le microcontrôleur contrôle le transistor, qui à son tour bascule l’alimentation vers la vanne solénoïde. Adapté avec permission de la réf. 20. (B) Après avoir connecté la carte microcontrôleur à l’ordinateur exécutant l’interface graphique et à une source d’alimentation avec la tension requise par les électrovannes, la communication est établie en cliquant sur le bouton Connecter. Les soupapes peuvent être actionnées manuellement via le panneau d’opération manuelle, où l’utilisateur sélectionne le milieu à piloter (par exemple, « Haut » ou « Faible »). Alternativement, le panneau d’Opération Automatisée permet à l’utilisateur de spécifier le moyen initial et les pas de temps (en secondes) pour chaque phase (Haut et Bas), et de commencer l’opération en cliquant sur le bouton Start. Le Moniteur en temps réel affiche une fonction par pas (0 = Bas, 1 = Haut) sur le temps, indiquant quel milieu circulait à travers les électrovannes vers les filtres au cours des secondes précédentes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans cette étude, nous avons utilisé le MCCD pour quantifier le taux de croissance de l’E. coli NCM3722 sous des conditions constantes de faibles nutriments à trois concentrations de RDM. Ces concentrations ont été dérivées de la formule du milieu riche défini (RDM) décrite parNeidhardt 19, avec les suppléments d’acides aminés et de nucléobases dilués respectivement à 0,5 %, 0,25 % et 0,01 % de la formulation originale.

Des exp...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les méthodes de culture bactérienne qui capturent la complexité des nutriments des environnements naturels sont essentielles pour faire progresser l’étude de la physiologie microbienne au-delà des conditions de laboratoire simplifiées. Les écosystèmes naturels contiennent des mélanges de nutriments couvrant une large gamme de concentrations, qui ne soutiennent souvent pas des taux de croissance maximaux 1,3,4,21,22,23.

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs déclarent ne pas avoir de conflit d’intérêts.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions avec gratitude le financement d’une bourse d’investigation de l’initiative Gordon and Betty Moore Foundation Symbiosis in Aquatic Systems (GBMF9197 ; https://doi.org/10.37807/GBMF9197), de la Simons Foundation via la collaboration Principles of Microbial Ecosystems (PriME) (subvention 542395FY22), et de la subvention de la Fondation nationale suisse des sciences 205321_207488 à R.S. K.S.L. reconnaît le soutien de l’Institut coréen des sciences fondamentales (Centre national des installations et équipements de recherche ; Grant No. RS2025-00554860) et la Fondation nationale de la recherche de Corée (NRF ; Grant No. RS2025-23523643), tous deux financés par le gouvernement coréen (MSIT), ainsi que par le Fonds de recherche 2025 (1.260002.01) de l’UNIST.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1K Ohm ResistorBC RoboticsELC-021Puissance nominale : 1/6 W
1N4001 DiodeBC RoboticsELC-001Tension inverse CC : 50 V; Courant redressé moyen : 1 A
Tube péristaltique en silicone platine - 3 arrêtsInnofluidSE-TUB-SIL-SSS-2.4*0.8Diamètre intérieur 0,8 mm ; diamètre extérieur 2,4 mm ; compatible avec la pompe péristaltique utilisée
Solénoïde 3 voiesEmerson Electric Co. 0055A301L0T00F312 V CC, 1 W
Feuillage d'aluminiumConvient pour l'autoclavage
Arduino Uno Rev4ArduinoSKU ABX00173
AutoclaveSystecD-200Ou d'une entreprise différente
Bouchon à trois ports - pour flacons de 1 et 2 LNalgene2162-0531Ou d'une entreprise différente (s'assurer qu'ils s'adaptent aux flacons sélectionnés)
Bouchon à trois ports - pour flacon de 4 LNalgene2162-0830Ou d'une entreprise différente (s'assurer qu'ils s'adaptent aux flacons sélectionnés)
Densitomètre cellulaire CO8000WPA biowaveDensitomètre OD
CentrifugeuseEppendorf5804RCentrifugeuse qui convient aux tubes Falcon 50 mL
CentrifugeuseEppendorf5424RCentrifugeuse qui convient aux tubes eppendorf 1,5 et 2 mL
Tube de centrifugation conique - 50 mLFischer Scientific10788561Tube Falcon
Tubes de culture (14 mL, stériles)Greiner bio-oneTubes de culture
ÉthanolSigma Aldrich493511Diluer à 70%
Cytomètre de fluxBeckmanC09756CYTOFlex
Glutaraldéhyde 25%Sigma AldrichG5882Ou d'une entreprise différente
Cylindre gradué - 500 mLNalgene3662-0500 Ou d'une entreprise différente
Boîte d'incubationBoîte d'incubation sur mesure - contacter les auteurs correspondants pour les détails de construction
Pompe péristaltique intelligente LabV1 à faible débitInnofluidSE-LABV1-AMC12(10)Disponible chez Darwin Microfluidics
Adaptateur mâle Luer vers barbeAldrichZ277142Adaptateur mâle Luer vers barbe compatible avec un tuyau de 0,8 mm ID (voir figure 1C)
Adaptateur mâle Luer vers filetéAldrichZ277142Utilisé pour connecter la soupape solénoïde au «tuyau d'entrée» (voir figure 1D)
MatlabMathworksR2022b ou ultérieurLogiciel pour exécuter le logiciel personnalisé pour les soupapes solénoïdes
Kit de milieu défini MOPS EZ RichTeknovaM2105Milieu MOPS pour les entérobactéries
Valve de retenue Luer unidirectionnelleMasterflex30505-92Empêche le reflux dans les réservoirs de milieu
Découpe-tubes - 0-37 mmKS Tools2222051Ou d'une entreprise différente
Set de pipettesFisher Scientific05-403-151Ou d'une entreprise différente
Tube en silicone platine - 1/16 poNalgene8060-0020Diamètre intérieur 1/16 po (1,6 mm); utilisé pour les expériences de nutriments fluctuants
Tube en silicone platine - 1/8 poNalgene8060-0030Diamètre intérieur 1/8 po (3,2 mm); utilisé pour les expériences de nutriments fluctuants
Flacon en copolymère de polypropylène - 1 L Nalgene2126-1000Ou d'une entreprise différente
Flacon en copolymère de polypropylène - 2 LNalgene2126-2000Ou d'une entreprise différente
Flacon en copolymère de polypropylène - 4 LNalgene2126-4000Ou d'une entreprise différente
Pipette sérologique - 5 mLCorningCLS4487Ou d'une entreprise différente
Breadboard sans soudureBC RoboticsPROTO-001
Filtre Sterivex-HV - 0,45 µm PVDFMilliporeSVHV01015
Colorant SYBR Green I pour gel d'acides nucléiquesInvitrogenS7563Colorant d'acides nucléiques pour le comptage cellulaire au cytomètre de flux
Transistor Darlington TIP120BC RoboticsTRN-005
Tubes - 1,5 mLEppendorf3810XTubes pour la centrifugation des cultures cellulaires et le stockage des pellets
Filtre de ventilationMillexSLFG05000Filtre de ventilation hydrophobe 0,2 µm
Récipient à déchetsLa capacité de volume doit être au moins égale au volume total de milieu à utiliser dans l'expérience

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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