Développement d’un modèle de fusion intersoique caudal de rat : une étude pilote de faisabilité

Résumé

Cette étude a démontré la faisabilité technique d’un modèle pilote de fusion intersomaire caudale utilisant la fixation postérieure de la cage et de la plaque. L’analyse histomorphométrique à 12 semaines a confirmé un pontage osseux continu et des schémas distincts de maturation osseuse intra-cage. Ce modèle technique sert de base préliminaire pour de futures études à grande échelle.

Résumé

Les vertèbres caudales du rat sont largement utilisées dans la recherche sur la régénération osseuse et la fusion vertébrale comme sites pratiques pour tester les matériaux et implants des greffes osseuses. Les modèles précédents de fusion de la queue de rat ont permis la fusion intervertébrale par ablation de disques et greffe osseuse, ou avec des dispositifs de fixation externes. Néanmoins, aucun modèle de petit animal n’a été développé utilisant une cage de fusion intersomaire analogue à celle utilisée cliniquement. Il a été émis l’hypothèse qu’un environnement de fusion osseuse valorisable pourrait être établi sans complications neurologiques en réalisant une insertion postérieure dans la cage imitant des procédures cliniques, complétées par une fixation de plaques, dans les vertèbres caudales du rat. Cette étude pilote préliminaire (n = 1) visait à évaluer la faisabilité technique. Une approche chirurgicale a été développée dans laquelle une cage miniaturisée en titane était précisément insérée dans l’espace discal réséqué entre les vertèbres caudales adjacentes, en reflétant étroitement la procédure chirurgicale humaine. Le titane a été choisi pour la cage en raison de son usage clinique généralisé et de sa biocompatibilité. Les premiers résultats ont démontré la faisabilité technique de cette approche. La cage implantée maintenait la hauteur du disque et l’alignement de la colonne vertébrale. Une croissance osseuse progressive à travers la cage a été observée, aboutissant à un pontage osseux confirmé et continu à travers l’espace intervertébral à 12 semaines post-opératoire. La présence d’une structure trabéculaire continue et l’absence de tissu fibreux intermédiaire ont été confirmées radiologiquement et histologiquement. Dans l’ensemble, ce modèle de fusion de queue de rat basé sur une cage offre une plateforme prometteuse pour évaluer de nouveaux biomatériaux et étudier les mécanismes de fusion osseuse intervertébrale. Cependant, l’absence d’un groupe témoin et d’une analyse statistique, due à la conception à sujet unique, limite la généralisation de ces résultats et nécessite une validation supplémentaire.

Introduction

La fusion interordiaire est un traitement chirurgical reconnu pour divers troubles de la colonne vertébrale, notamment l’instabilité, la spondylolisthése et les maladies dégénératives ; Notamment, il a évolué sur environ 70 ans en tant que procédure^{standard 1,2}. La procédure consiste à retirer le disque intervertébral et à insérer une cage ou une greffe osseuse pour favoriser la fusion solide entre les vertèbres^{adjacentes 3,4}. De plus, l’ajout d’instruments postérieurs avec des cages réduit les taux de pseudarthrose et élargit ses indications^{cliniques 5}. Néanmoins, des complications telles que la pseudarthrose et l’affaissement de la cage restent des défis cliniques importants, nécessitant le développement fiable de modèles précliniques pour évaluer de nouveaux matériaux et des facteurs favorisant^{la fusion 6,7}.

Les rats ont été largement utilisés dans la recherche sur la fusion vertébrale en raison de leur faisabilité économique, de leur reproduction rapide, de leur guérison rapide et de leur facilité de^{manipulation 8,9}. Néanmoins, les modèles existants de fusion intercocédentaire chez les rats présentent des limites importantes. Plus précisément, l’approche de fusion intersomaire antérieure lombaire (ALIF) chez les rats nécessite une manipulation majeure des vaisseaux et organes abdominaux, ce qui entraîne une forte invasive chirurgicale et des risques importants de^{complications 10,11}. L’approche de la fusion intersonaire lombaire postérieure (PLIF) comporte un risque inévitable de lésion neurologique en raison des canaux spinaux et des éléments neuronaux extrêmement petits, rendant la rétraction neuronale presque^{impossible 12}. Par conséquent, la plupart des études sur le rat se sont limitées à la fusion postérolatérale (PLF), qui échoue structurellement à étudier les mécanismes de fusion osseuse dans la cage, un aspect critique dans les contextes^{cliniques 13}. De plus, bien que des modèles caudaux existent, ils manquent d’un système d’évaluation qui intègre une cage intersomptique de type clinique avec la fixation postérieure de la plaque.

La colonne caudale des rats offre des avantages uniques en recherche sur la fusion intersonaire. Les disques caudaux présentent de fortes similitudes géométriques, compositionnelles et mécaniques avec les disques lombaires humains, ce qui les rend de plus en plus populaires dans la recherche sur les^{disques 14,15}. De plus, la chirurgie caudale de la colonne vertébrale offre un accès chirurgical facile, un rapport qualité-prix et une récupération postopératoire rapide, comparé aux approches^{lombaires 16}. Cependant, à ce jour, aucune étude n’a signalé une insertion réussie de la cage postérieure dans la colonne caudale du rat, avec une évaluation histologique détaillée de la formation osseuse à l’intérieur et autour de la cage.

L’évaluation histologique, en particulier de l’histomorphométrie osseuse non calcifiée, reste la référence pour l’évaluation de l’osséointégration et de la fusion^{osseuse 17,18}. Plus précisément, il permet une analyse quantitative de paramètres critiques de formation osseuse, notamment le volume osseuse/volume tissulaire (BV/TV), le nombre trabéculaire et l’épaisseur trabéculaire, tout en permettant une évaluation qualitative de la maturité osseuse en distinguant le tissage de l’os^{lamellaire 19,20}. Une telle évaluation histomorphométrique détaillée peut révéler les schémas d’ostéoconduction spatiale et temporale à l’intérieur de la cage et aux interfaces^{cage-vertèbre 21,22}. Néanmoins, une évaluation histomorphométrique complète de l’ostéoconduction en cage dans les modèles de rats fait défaut.

Cette étude visait à développer un modèle pilote de fusion intersomaire caudale de rat utilisant l’insertion postérieure de la cage et la fixation supplémentaire de plaques afin de démontrer sa faisabilité technique. Cette étude présente une technique chirurgicale détaillée et une évaluation histologique complète de la formation osseuse à l’intérieur de la cage et aux interfaces des plaques vertébrales. Il a été émis l’hypothèse qu’un environnement de fusion osseuse valorisable pourrait être établi sans complications neurologiques en réalisant une insertion postérieure dans la cage imitant des procédures cliniques, complétées par une fixation de plaques, dans les vertèbres caudales du rat. Ce modèle offre une plateforme efficace pour évaluer les matériaux de fusion intercosensorique et, dans la littérature existante, représente une exploration technique initiale du placement postérieur réussi en cage en utilisant l’évaluation histomorphométrique de l’ostéoconduction dans un modèle de rat.

Protocole

Toutes les expériences animales ont été menées conformément aux protocoles approuvés par le Comité de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Jikei (numéro d’approbation 2023–034C1). Cette étude a été conçue comme une étude pilote de faisabilité. Pour évaluer la viabilité technique de cette insertion postérieure très délicate et nouvelle dans la colonne caudale du rat avant une validation à grande échelle, un seul animal (n = 1) a été utilisé, conformément aux directives éthiques, afin de minimiser l’utilisation lors de l’évaluation technique initiale. Les rats mâles de Sprague-Dawley (SD) ont été sélectionnés comme souche standard pour la recherche sur la fusion spinale. Les critères d’inclusion concernaient des mâles en bonne santé âgés de 8 à 10 semaines, pesant entre 200 et 250 g, afin de garantir que la hauteur du disque intervertébral (1,8 à 2,2 mm) soit compatible avec la cage de 2 mm. Les animaux présentant > perte de poids de 10 % pendant la période d’acclimatation, une activité réduite ou des déformations visibles de la queue ont été exclus. Pour cette étude, un rat mâle de Sprague–Dawley (8 semaines, pesant 221,8 g ; Japan SLC, Shizuoka, Japon) a été utilisé. L’animal était hébergé dans un environnement contrôlé à 25°C et avec une humidité relative de 50 % (plage autorisée de 30 à 70 %) avec un cycle clair/obscur de 12 heures, et bénéficiait d’un accès à l’eau et d’un régime alimentaire standard pour rongeurs. Les rats étaient hébergés dans des cages à fond solide équipées de matériaux de nidification et de bâtons à mâcher pour enrichir l’environnement. Une période d’acclimatation de 3 jours a été mise en place avant l’intervention. Pour empêcher les compagnons de cage de ronger les implants caudaux, le rat a été maintenu dans des conditions de logement unique tout au long de l’étude, ce qui a été un facteur critique dans cette conception expérimentale.

Préparation des vis et plaques

Les matériaux de fixation interne ont été préparés avant la procédure chirurgicale. Les vis en acier inoxydable disponibles dans le commerce (diamètre d’origine : 1,2 mm, longueur : 14 mm) ont été coupées à une longueur précise de 6 mm à l’aide d’un coupe-fil (Figure 1A). Ces vis ont été stérilisées par autoclavage à vapeur standard à 121 °C pendant 20 minutes. Dans une plaque de fixation interne en polyoxyméthylène (POM) (18 mm de longueur, 3 mm de largeur, 1 mm d’épaisseur), des trous de vis d’un diamètre de 1,2 mm ont été percés à intervalles de 12 mm à l’aide d’une perceuse manuelle (Figure 1B–D). Par la suite, les coins des plaques POM ont été arrondis à l’aide d’un coupe-fil pour minimiser l’irritation des tissus mous environnants (Figure 1E). Les plaques ont été stérilisées à l’aide de gaz oxyde d’éthylène (EtO) ou de plasma gazeux peroxyde d’hydrogène, compte tenu de la sensibilité thermique du polymère. La cage en titane présente une structure en treillis interconnectée avec des canaux longitudinaux mesurant entre 300 et 500 μm de diamètre. Sa surface a été préparée à l’aide de la technologie lamellaire 3D titane pour obtenir une rugosité micro-surface de 3 à 5 μm, ce qui facilite la croissance osseuse directe.

Anesthésie et intervention chirurgicale

Aucun jeûne préopératoire n’a été effectué pour éviter un stress métabolique inutile. L’anesthésie a été induite via un mélange triple d’anesthésie composé de médétomidine (0,15 mg/kg), midazolam (2 mg/kg) et butorphanol (2,5 mg/kg), administré par injection sous-cutanée dans le dos à l’aide d’une aiguille²³ calibre 25. Un plan chirurgical d’anesthésie adéquat a été évalué toutes les 15 minutes en confirmant la perte du réflexe de retrait de la pédale (pincée de l’orteil), en maintenant les muqueuses roses et en surveillant la fréquence respiratoire (70–110 respirations/min). La procédure chirurgicale de fusion intersonaire des vertèbres caudales a ensuite été réalisée. L’animal a été placé en position couchée (Figure 2A), et toute la queue a été désinfectée selon un protocole de frottage alterné en trois cycles (70 % d’éthanol, frottage povidone-iode et 70 % d’éthanol) afin d’assurer un champ stérile. Pour identifier les vertèbres cibles, une palpation manuelle a été réalisée en partant du sacrum distalement. La première articulation mobile a été identifiée comme la jonction sacrum-CO1, et le segment immédiatement distal a été désigné comme Co2, définissant le site cible Co2–Co3. Une incision longitudinale d’environ 2 cm a été réalisée sur la face dorsale, s’étendant de la deuxième à la troisième vertèbre caudale (Co2–Co3) (Figure 2B), pour exposer la face postérieure de chaque vertèbre. Pendant l’exposition, il a été pris soin d’identifier et d’éviter les dommages à la veine caudale dorsale ; La dissection contondante et l’électrocautérisation bipolaire ont été utilisées pour gérer les saignements mineurs. Pour préparer le site de fusion, l’annulus fibrosus entre les vertèbres de CO2 et Co3 a été incisé à l’aide d’un scalpel (Figure 2C). L’annulus fibrosus et le noyau pulpeux ont ensuite été méticuleusement retirés par curettage à l’aide d’une curette et de petites pinces (Figure 2D). Cette étape a été réalisée sous grossissement chirurgical puissant (≥3,5x). L’exhaustivité de l’ablation a été objectivement définie par la confirmation visuelle d’un saignement ponctué (le signe de la « plaque terminale sanglante ») et l’absence totale de tissu mou résiduel. Les dommages inacceptables à la plaque terminale étaient définis comme des érosions profondes impliquant > 25 % de la surface totale ou une pénétration dans l’os boucleur > 0,5 mm. Une cage en titane (section transversale de 2 × 2 mm, hauteur de 2 mm) (Figure 2E) a ensuite été insérée profondément dans l’espace intervertébral jusqu’à atteindre un arrêt physique et que le contact complet avec les deux plaques terminales soit confirmé visuellement, créant un ajustement ferme par interférence (Figure 2F, 2G).

Fixation et fermeture de la plaie

Pour faciliter la fixation des plaques, la surface osseuse autour des emplacements de trous désignés dans les vertèbres de CO2 et Co3 a été aplatie à l’aide d’une fraiseuse électrique portable fonctionnant à 7 800 tr/min équipée d’une meule sphérique de type lime de 2,0 mm (Figure 2H). Les trous en os étaient percés individuellement à des intervalles correspondant aux trous de vis de la plaque de fixation interne en plastique à l’aide d’une perceuse manuelle équipée d’un foret de 1,2 mm de diamètre (Figure 2I). Deux vis en acier inoxydable de 6 mm ont ensuite été préchargées dans les trous. de la plaque en plastique (Figure 2J). Les vis étaient insérées à un angle de 90° à une profondeur standardisée de 5 mm avec un espacement centre-centre de 12 mm (Figure 2K). Enfin, l’incision cutanée a été fermée avec des points de suture en nylon 4-0, et la queue a été désinfectée à nouveau avec 70 % d’éthanol pour compléter la procédure.

Prise en charge postopératoire et euthanasie

Pendant la phase de récupération immédiate (jour 0), l’animal était surveillé toutes les 15 minutes, et la température rectale était maintenue jusqu’à atteindre une position sternale couchée complète et une déplacement intentionnel. Pour l’évaluation à long terme (semaines 1 à 12), un système de notation quotidien basé sur le score de condition corporelle (BCS), le statut de toilettage et l’activité générale a été mis en place, ainsi qu’une surveillance quotidienne du site chirurgical pour infection ou déhiscence. Un repas humide a été fourni sur le sol de la cage pendant les 48 premières heures. Le poids corporel était mesuré chaque semaine. Les critères humains pour l’euthanasie précoce étaient strictement définis comme suit : perte de poids ≥20 %, BCS ≤2,0, incapacité persistante à atteindre la nourriture/l’eau > 12 heures, signes de douleur/dyspnée sévère, ou complications graves du site chirurgical (par exemple, nécrose). Les animaux répondant à ces critères ont été euthanasiés de manière humaine dans les 24 heures. Les soins postopératoires comprenaient l’administration de céfalexine (15 mg/kg) par voie intramusculaire immédiatement après l’opération et à 24 heures postopératoires pour prévenir l’infection. Pour l’analgésie, le carprofène (2 mg/kg) a été administré par voie sous-cutanée immédiatement après l’opération et à 12, 24 et 48 heures post-opératoires, pour un total de quatre doses. À 12 semaines après l’implantation, le rat a été euthanasié par overdose d’isoflurane. Le segment de la deuxième à la troisième vertèbre caudale a ensuite été prélevé en bloc et fixé à 70 % d’éthanol.

Recommandations de formation, dépannage et taille de l’échantillon. Pour faciliter l’adoption réussie de ce protocole exigeant, les nouveaux opérateurs doivent effectuer 3 à 5 procédures d’entraînement sur des cadavres de rats, atteignant la maîtrise lorsque trois placements consécutifs ne montrent aucune déformation radiographique. Les dépannages courants incluent la pré-mesure de la hauteur du disque par radiographie pour optimiser la sélection de la taille de la cage et la revérification de la planévitabilité dorsale de l’os pour éviter la migration de la cage. Si l’achat de vis est insuffisant, il est recommandé d’utiliser des vitesses de forage plus basses. Pour les futures études de validation, une taille minimale d’échantillon de n = 6 à 10 par groupe est recommandée (avec un ajout supplémentaire de 10 à 20 % pour l’attrition) afin d’atteindre une puissance statistique suffisante. De plus, les études futures doivent intégrer des groupes témoins (par exemple, cage vide ou autogreffe) afin de valider la performance du biomatériau.

Analyse radiographique et histologique

La tomodensitométrie (CT) et la radiographie numérique ont été réalisées à l’aide d’un système de micro-CT avec une tension tubulaire de 80 kV et un courant de 0,1 mA. Un filtre en aluminium de 1,0 mm d’épaisseur a été utilisé lors de l’acquisition pour minimiser les artefacts de durcissement du faisceau causés par l’implant en titane. Pour l’évaluation longitudinale, l’imagerie in vivo a été réalisée à 1 et 4 semaines postopératoires avec une taille voxel de 120 μm. L’imagerie ex vivo a été réalisée à 12 semaines postopératoires avec un porte-échantillon de 24 mm avec une taille voxel de 24 μm. Les données CT et les images radiographiques ont été reconstituées à l’aide d’un algorithme de rétroprojection filtré standard et analysées à l’aide d’un viseur DICOM. Des critères quantitatifs ont été définis pour évaluer l’union osseuse. Radiologiquement, la fusion réussie a été confirmée lorsqu’une structure trabéculaire continue reliant les plaques vertébrales crânienne et caudale a été observée sur au moins trois tranches consécutives lors de la micro-CT. Un seuil global de 700 unités de Hounsfield (HU) a été appliqué lors de la segmentation d’image. Histomorphométriquement, un ratio BV/TV de 70 % ou plus dans la cage était considéré comme le seuil pour l’accomplissement spatial physique et la fusion. Histologiquement, l’union osseuse était définie par un pontage osseux complet entre le côté crânien et caudal sans interposition de tissu fibreux. Pour l’analyse histologique, un marquage séquentiel au fluorochrome a été réalisé par injection sous-cutanée de calcéine (8 mg/kg) deux jours avant l’euthanasie afin d’identifier la répartition spatiale de la minéralisation active au point terminal de 12 semaines. Les vertèbres caudales excisées ont été fixées à 70 % d’éthanol pendant 7 jours et colorées en bloc avec une teinture osseuse de Villanueva. Les spécimens ont été déshydratés par des grades croissants d’éthanol, intégrés dans la résine méthacrylate de méthyle, et sectionnés en sagittalement au centre géométrique précis de la cage, comme déterminé par un guidage Micro-CT pré-sectionné, à l’aide d’un microtome à scie diamantée. Des échantillons de sol non calcifiés (5 μm d’épaisseur) ont été préparés à l’Institut d’Histomorphométrie Osseuse d’Ito (Niigata, Japon). Les images ont été prises à l’aide d’un microscope en champ clair et d’un microscope laser confocal pour la fusion de fluorescence. Un examen supplémentaire a été effectué au microscope à lumière polarisée, et une analyse histomorphométrique a été réalisée à l’aide d’un analyseur d’images informatisé. La Région d’Intérêt (ROI) était définie comme le volume interne total de la cage, à l’exclusion des montants métalliques, et était subdivisée en ROI intracage crânienne et caudale. Le tissu osseux a été identifié par sa couleur violette/magenta sous la coloration de Villanueva. L’os lamellaire (Lm.V) se caractérisait par sa structure lamellaire très organisée et parallèle sous la lumière polarisée, tandis que l’os tissé (Wo.V) présentait des motifs fibreux désorganisés.

Résultats

Poids corporel (Tableau 1)

Le poids corporel a été mesuré jusqu’à 12 semaines après l’opération, montrant une augmentation régulière (de 221,8 g à 346,8 g), indiquant une homéostasie physiologique et soutenant indirectement l’absence de détresse chronique sévère. Cela a été confirmé par des évaluations multimodales quotidiennes confirmant une activité normale et une cicatrisation simple des plaies.

Blessure (Fig...

Discussion

Ici, un nouveau modèle de fusion intersontaire de la colonne caudale du rat a été établi. Ce modèle consiste à insérer une cage en titane via une approche postérieure complétée par une fixation par plaque et vis. Par la suite, la formation osseuse intracage a été évaluée à l’aide d’une analyse histomorphométrique détaillée. Les caractéristiques distinctives de ce modèle sont triples : 1) il imite étroitement la fusion intersonaire lombaire postérieure clinique ou les procédures de fusion...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
4-0 nylon sutures	Natsume	ER-25-30N2
Bright-field microscope	Keyence. (Osaka, Japan)	BZ-X800
Butorphanol	FUJIFILM	021-19001
Calcein	FUJIFILM	76082
Carprofen	FUJIFILM	037-19761
Cefalexin	FUJIFILM	036-11051
Computerized image analyzer	System Supply Co. (Nagano, Japan)	Histometry RT CSS-840
Confocal laser-scanning microscope for fluorescence merging	Carl Zeiss. (Jena, Germany)	LSM 980
Curette	Natsume	E-8-00
Diamond saw microtome	Leica. (Wetzlar, Germany)	SP1600
Electric drill	TAMIYA	N/A	https://www.amazon.co.jp /%E3%82%BF%E3%83% 9F%E3%83%A4-%E3% 82%AF%E3%83%A1% E3%83%95%E3%83% 88%E3%83%84%E3% 83%BC%E3%83%A3% E3%82%B7%E3%83% AA%E3%83%A9%E3% 82%BA-No-42-%E9%9B %BB%E5%8B%95%E3% 83%8F%E3%83%B3%E3 %83%87%E3%82%A1% E3%83%AA%E3%83%A5 %E3%83%BC%E3%82% BF%E3%83%BC-%E3% 83%9F%E3%83%A9%E3 %83%A2%E3%83%87%E3 %83%AB%E7%94%A8%E5 %B7%A5%E5%85%B7/dp/B 01LZ05WWY/ref=sr_1_2?ad grpid=54785347873&dib=eyJ 2IjoiMSJ9.f61YHQv80N0nxws VOdlrIFtTsQoJICvSb4t4rVt97 FEBWkOo4ilX5O2lZH-5vADU HT9CRXO308QpVFqdBNli0C osd4iBSfSzEcKxP9HMX4DhiI S-Qko5ix33W7FjPQqpgTWbj3 CV_vBytnvfqvSyoGN9IB8445o 5Kc0pjeKPG-SRR3Ixpqr2-FT_ ZgUyWstoyQVFTcv_Rq_K4-E OWnuT41BBYtBh757EOAoBe z2lkCd6Psz99wZxfUuvzRUAH Ecq9QV6EmiT9LAY8dYYq08k aLt7Klqx2k-MdV8XbWRxgKk. 7TWzXBGA1PeNmB4me_Cz4 mMFAKBAv5H3YXAw_HPuLd E&dib_tag=se&hvadid=651687 588880&hvdev=c&hvexpln=0& hvlocphy=1009309&hvnetw=g& hvocijid=5538300633798619650 --&hvqmt=e&hvrand=55383006 33798619650&hvtargid=kwd-33 4267191534&hydadcr=4289_13 319726&jp-ad-ap=0&keywords= %E3%82%BF%E3%83%9F%E3 %83%A4+%E9%9B%BB%E5% 8B%95%E3%83%8F%E3%83% B3%E3%83%87%E3%82%A3% E3%83%89%E3%83% 83%AB&mcid=6b8ff8c984ba3d45 be477b407ef2d1ba&qid=1767395 580&sr=8-2
hand drill	VEAGIA	N/A	https://www.amazon.co.jp/dp/B0D2 9B4W18/ref=sspa_dk_detail_5?pd _rd_i=B0D29B4W18&pd_rd_w=xe kNz&content-id=amzn1.sym.f293b e60-50b7-49bc-95e8-931faf86ed1e &pf_rd_p=f293be60-50b7-49bc-95e8 -931faf86ed1e&pf_rd_r=HPW6B367R QC0VPB7WTTS&pd_rd_wg=E8mAS &pd_rd_r=dbeb0aa7-1bea-4f40-99dd -38bcb05c8234&sp_csd=d2lkZ2V0T mFtZT1zcF9kZXRhaWw&th=1
Medetomidine	FUJIFILM	135-17473
Midazolam	FUJIFILM	135-13791
Pin vise	ANEX	N/A	https://www.amazon.co.jp/%E3%82% A2%E3%83%8D%E3%83%83%E3% 82%AF%E3%82%B9-ANEX-%E3% 83%A9%E3%83%90%E3%83%8D %E3%83%BC%E3%82%B0%E3% 8