Dépistage assisté par ordinateur des ingrédients actifs et validation du médicament contre la fièvre et la toux

Résumé

Ici, nous avons construit un réseau multidimensionnel de « composant-cible-voie de maladie », intégrant le dépistage en pharmacologie en réseau, le docking moléculaire et la validation de modèles murins induits par LPS. En établissant des paramètres clés clairs, elle permet d’identifier efficacement les composantes actives de la médecine ethnique Tong, du Lengyuxiao Tang, et de vérifier un processus répétable.

Résumé

Pour filtrer et vérifier systématiquement les composants actifs de la médecine ethnique Dong Lengyuxiao Tang (LYXT ; Semen Pharbitidis, Verbena officinalis L. et Zingiber officinale Roscoe) pour traiter la fièvre et la toux, ce schéma a établi un processus méthodologique intégrant la prédiction de la pharmacologie en réseau et la vérification expérimentale. Tout d’abord, en utilisant la base de données et la plateforme d’analyse de pharmacologie des systèmes de médecine traditionnelle chinoise (TCMSP), avec une biodisponibilité orale (OB) ≥ 30 % et une ressemblance de médicament (DL) ≥ 0,18 comme critères, les principaux composants actifs de LYXT ont été dépistés, et les cibles associées pour la fièvre et la toux ont été collectées à partir de plusieurs bases de données de maladies. Par la suite, le réseau d’interactions « composant-cible-maladie » a été construit et, grâce à une analyse topologique et à l’enrichissement des voies de l’ontologie des gènes (GO) et de l’encyclopédie des gènes et génomes de Kyoto (KEGG), les cibles d’action principales (CYP3A4, POR) et les voies de signalisation clés (voie MAPK) ont été identifiées. La technologie d’amarrage moléculaire a été utilisée pour vérifier la capacité de liaison des composants clés aux cibles centrales. Enfin, un modèle murin de bronchite chronique a été établi par instillation intranasale de lipopolysaccharides (LPS), et l’efficacité anti-inflammatoire in vivo des principaux composants actifs prévus a été vérifiée. Les résultats ont montré que des composants tels que le β-carotène et le saparenol, criblés par la pharmacologie en réseau, présentaient des degrés variables d’effets anti-inflammatoires dans les expériences animales, et que leurs mécanismes pouvaient impliquer l’inhibition de la voie de signalisation MAPK/p38. Ce schéma fournit un exemple reproductible pour le dépistage et la recherche sur les mécanismes des composants actifs dans les médecines ethniques traditionnelles.

Introduction

La médecine Dong est un système ethnomédical inscrit dans le cadre de la médecine traditionnelle chinoise (MTC), pratiqué par le groupe ethnique Dong au Guizhou, au Hunan et au Guangxi. Il représente leur savoir empirique cumulé, développé au fil des générations. Ce système intègre la phytothérapie, l’acupuncture, la fixation osseuse, le massage, la thérapie alimentaire et les pratiques spirituelles. Ses caractéristiques distinctes découlent de l’isolement géographique historique du groupe et de la tradition orale, qui ont favorisé une pharmacopée unique, fondée sur la pratique, adaptée à l’environnement local et aux croyances culturelles.

La fièvre persistante, une affection qui se développe lorsque le corps ne peut pas contrôler sa température, est un signe que le corps est dysfonctionnel et une fonction vitale de l’autoprotection des cellules^{humaines 1}. De nombreuses méthodes différentes existent pour le traitement des médicaments de chauffage de la nationalité Dong. Parmi eux, la fièvre est classée en fièvre interne et fièvre externe. La fièvre interne désigne la chaleur causée par des maladies internes, et la fièvre externe désigne la chaleur générée par le froid ou un^{traumatisme 2}. La fièvre exogène affecte généralement la fonction^{gastro-intestinale 3}. Les médecins nationaux de Dong utilisent un traitement antipyrétique contre le froid pour traiter la fièvre. Parmi les diverses prescriptions de médicaments Dong, le Lengyuxiao Tang (LYXT) est une décoction standard utilisée pour la fièvre et la douleur, comprenant du Semen Pharbitidis, du Verbena officinalis L. et du Zingiber officinale Roscoe, qui sont constamment pilés et mélangés à de^{l’eau 4}. Il est principalement utilisé pour la fièvre et les maux de tête causés par un rhume.

Cependant, les composants actifs de LYXT et leurs mécanismes moléculaires sous-jacents restent mal compris. Pour combler cette lacune, la présente étude a utilisé une approche de pharmacologie en réseau afin de prédire les principes actifs potentiels et les cibles. Pour valider ces prédictions, un modèle murin bien établi induit par les lipopolysaccharides (LPS) d’inflammation pulmonaire a été sélectionné, car il imite les réponses inflammatoires clés associées à la fièvre et à la toux, y compris l’infiltration leucocytaire et la production de cytokines pro-inflammatoires.

Au cours de la découverte de médicaments, diverses études ont révélé que les composés peuvent interagir avec plusieurs cibles protéiques. Ainsi, le paradigme « un médicament, une cible biologique » évolue vers un paradigme de pharmacologie systémique. Un composé qui interagit avec plusieurs protéines cibles biologiques de virus ou de bactéries peut fournir des effets pharmacologiques^{utiles 5}. L’analyse pharmacologique en réseau est un moyen réalisable et efficace d’atténuer le processus coûteux et long de découverte de médicaments. Il peut nous aider à mieux comprendre les interactions entre les médicaments, à prédire les mécanismes responsables de la maladie, à suggérer des membres alternatifs pour les effets pharmacologiques souhaités sans effets secondaires, et à prédire les bioactivités de la médecine traditionnelle. Des approches chimioinformatiques, le docking moléculaire et la modélisation basée sur les données ont été appliquées avec succès pour prédire les bioactivités et analyser les mécanismes. Ces méthodes facilitent la découverte rapide de composés antiviraux et antibactériens à potentiel clinique, et sont également utilisées pour expliquer l’efficacité et les effets indésirables des^{médicaments 6}. Par exemple, le mésylate d’imatinib, une petite molécule, est un inhibiteur de l’agent causal de la leucémie myéloïde chronique, la protéine de fusion Bcr-Abl, mais il bloque également l’activité de plusieurs tyrosines kinases telles qu’Abl, Kit et PDGFR⁷. Par conséquent, la recherche sur l’identification des médicaments et de leurs cibles reste cruciale pour potentiellement traiter les maladies, ce qui nous aide à comprendre les mécanismes par lesquels les composés médicamenteux agissent pour traiter les maladies au niveau moléculaire. La modélisation computationnelle et l’analyse de réseaux peuvent dépister avec précision les médicaments et cibles potentiels, et l’analyse d’interaction multiplicative peut fournir une base théorique et des conseils pratiques pour la vérification expérimentale. Dans cet article, en utilisant l’outil de recherche pour le retrival des gènes/protéines interactifs (STRING), la base de données pour l’annotation, la visualisation et la découverte intégrée (DAVID), ainsi que d’autres bases de données, combinées à l’analyse dynamique des ontologies géniques (GO) et à l’analyse des voies, les données concernant les principes actifs et les protéines d’action apparentées du médicament Dong LYXT contre la fièvre et la toux ont été collectées, et le mécanisme du traitement combiné des ingrédients actifs a été exploré. qui peut fournir une référence théorique spécifique pour des recherches ultérieures sur le médicament Dong LYXT, propose une stratégie reproductible pour explorer les mécanismes pharmacologiques des formules ethnomédicinales et offre des perspectives sur le développement de nouveaux agents anti-inflammatoires.

Protocole

Le programme d’expérimentation animale a été examiné par le Comité d’éthique des animaux expérimentaux de l’Université de Lanzhou (D2024-292). Elle est conforme aux principes de protection animale, de bien-être animal et d’éthique, ainsi qu’aux dispositions pertinentes de l’éthique nationale expérimentale du bien-être animal.

1. Préparation de la base de données et du logiciel

1. Dépistage des principes actifs et collecte des gènes cibles
   1. Accédez à la base de données et à la plateforme d’analyse pharmacologique du système TCM (TCMSP) (https://tcmsp-e.com/) et effectuez des recherches séparées en utilisant les noms latins de chaque plante dans la formulation LYXT, à savoir Semen Pharbitidis, Verbena officinalis L. et Zingiber officinale Roscoe, comme mots-clés pour récupérer tous les composés chimiques associés à chaque plante.
   2. Appliquer les critères de dépistage pour filtrer les composés récupérés pour chaque plante comme suit : pour Verbena officinalis L., fixer la biodisponibilité orale (OB) ≥ 30,1 % et la ressemblance avec le médicament (DL) ≥ 0,12 ; pour Zingiber officinale Roscoe, fixer OB ≥ 60 % et DL ≥ 0,13 ; pour le sperme pharbitidis, fixez l’OB ≥ 16,93 % et la DL ≥ 0,50. Ensuite, fusionnez les listes filtrées de composés des trois herbes et supprimez les entrées dupliquées basées sur des identifiants TCMSP uniques pour générer la liste finale des composés actifs dans LYXT.
   3. Exportez toutes les protéines cibles associées à ces composés actifs depuis la base de données TCMSP sous forme d’un tableau contenant les identifiants des composés et les noms des protéines cibles, puis importez cette liste de protéines cibles dans la base de données UniProt (https://www.uniprot.org/).
   4. Utilisez l’outil de cartographie UniProtKB ID pour convertir tous les noms de protéines cibles en symboles officiels de gènes humains avec le jeu de directions de correspondance du nom de protéine au nom du gène, et supprimez toute entrée sans symbole de gène valide afin de générer la liste finale des gènes cibles associés aux composants actifs de LYXT.
2. Collecte et analyse des gènes cibles de la maladie
   1. Téléchargez les gènes liés à la fièvre et à la toux depuis la base de données GeneCards (www.genecards.org) en recherchant séparément avec les mots-clés « fièvre » et « toux », conservez les gènes avec un score de pertinence ≥ 5, et fusionnez les résultats des deux recherches dans la base de données.
   2. Téléchargez les gènes liés à la fièvre et à la toux depuis la base de données thérapeutique cible (TTD) (db.idrblab.net/ttd) en recherchant séparément avec les mots-clés « fièvre » et « toux », téléchargez tous les gènes cibles associés, et fusionnez les résultats des deux recherches dans la base de données.
   3. Téléchargez les gènes liés à la fièvre et à la toux depuis la base de données PharmGkb (www.pharmgkb.org) en recherchant séparément avec les mots-clés « fièvre » et « toux », téléchargez tous les gènes associés, puis fusionnez les résultats des deux recherches dans la base de données.
   4. Téléchargez les gènes liés à la fièvre et à la toux depuis la base de données Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) (www.omim.org) en recherchant séparément avec les mots-clés « fièvre » et « toux », téléchargez tous les gènes associés, et fusionnez les résultats des deux recherches dans la base de données.
   5. Téléchargez les gènes liés à la fièvre et à la toux depuis la base de données DrugBank (go.drugbank.com)⁸ en recherchant séparément avec les mots-clés « fièvre » et « toux », téléchargez tous les gènes associés, et fusionnez les résultats des deux recherches dans la base de données.
   6. Fusionner les listes génétiques obtenues dans les cinq bases de données en une seule liste complète et supprimer les symboles génétiques dupliqués pour générer la liste finale des gènes cibles liés à la fièvre et à la toux.
   7. Comparez la liste des cibles de la maladie de l’étape 1.2.6 avec la liste des gènes cibles de la composante active LYXT de l’étape 1.1.4 pour sélectionner les gènes qui se chevauchent et qui sont communs aux deux listes, puis exportez cette liste de gènes chevauchants sous forme de fichier CSV.
3. Conversion de la DI et analyse de la section transversale
   1. Chargez la liste de gènes chevauchants de l’étape 1.2.7 dans l’environnement R et accédez au site web de DAVID (https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp).
   2. Téléchargez la liste des gènes qui se chevauchent sur DAVID avec l’espèce réglée sur Homo sapiens et le type de liste sur le symbole du gène, puis exécutez l’outil d’annotation fonctionnelle pour effectuer l’analyse de la section transversale.
   3. Convertir les identifiants de symbole des protéines qui s’intersectent en identifiants d’ensemble en utilisant la fonction de conversion d’identifiant génique au sein de DAVID, avec la direction de conversion définie du symbole du gène vers l’identifiant d’ensemble.
   4. Exportez la liste d’ensemble convertie ainsi que les symboles géniques originaux sous forme de fichier CSV pour une analyse d’enrichissement en aval.

2. Dépistage des ingrédients actifs essentiels et des protéines cibles

1. Construction de réseaux à cibles composées
   1. Chargez la liste des gènes qui s’intersectent de l’étape 1.2.7 et la liste des gènes cibles des composants actifs LYXT de l’étape 1.1.4 dans l’environnement R, puis effectuez une analyse comparative pour identifier les composés associés à la fois aux gènes cibles et aux gènes qui s’intersectent.
   2. Importez les données de relation composé-cible dans la version 3.8.1 de Cytoscape et générez le schéma réseau « LYXT-Fièvre et cible de toux » pour visualiser les interactions entre les principes actifs et leurs cibles associées.
2. Acquisition de données sur l’interaction protéine-protéine
   1. Importez le fichier d’identification génique pour l’intersection des cibles d’ingrédients actifs LYXT et des cibles fièvre et toux obtenues à l’étape 2.1.1 dans la base de données STRING à https://stringdb.org/, sélectionnez Homo sapiens comme espèce, et plusieurs protéines comme méthode de traitement des données.
   2. Filtrez les interactions protéine-protéine en fixant le seuil de confiance à ≥ 0,90 et en isolant les protéines à très faible corrélation, puis générez un fichier TSV contenant les données d’interaction filtrées pour une analyse en aval.
3. Confirmation de l’analyse d’intersection
   1. Utilisez le langage R pour analyser l’intersection entre les protéines cibles des principes actifs et celles de la fièvre et de la toux, confirmant ainsi le chevauchement des gènes identifiés à l’étape 1.2.7.
   2. Préparez cet ensemble de gènes chevauchants confirmés pour une analyse ultérieure du réseau d’interaction protéine-protéine (IPP).

3. Dépistage des protéines cibles clés

1. Visualisation du réseau PPI
   1. Importez les données d’interaction filtrées de l’étape 2.2.2 dans la version 3.8.1 de Cytoscape et utilisez l’outil de visualisation du réseau pour dessiner le diagramme réseau PPI.
   2. Installez et ouvrez le plugin CytoNCA dans Cytoscape, puis utilisez ce plugin pour effectuer une analyse topologique en calculant les paramètres suivants pour chaque nœud du réseau : centralité des degrés (DC), centralité entre les deux (BC), centralité de proximité (CC), centralité des vecteurs propres (EC), centralité du réseau (NC) et connectivité moyenne locale (LAC).
2. Identification des protéines cibles clés par criblage à base de médiane
   1. Exportez la table des paramètres topologiques calculés depuis CytoNCA sous forme de fichier CSV contenant tous les identifiants de nœuds ainsi que leurs valeurs correspondantes DC, BC, CC, EC, NC et LAC.
   2. Calculez la valeur médiane de centralité des degrés (DC) sur tous les nœuds du réseau et identifiez tous les nœuds dont la DC est supérieure à deux fois la valeur médiane.
   3. Calculez les valeurs médianes de centralité de proximité (CC) et de centralité entre les nœuds (BC) entre tous les nœuds du réseau, puis, à partir des nœuds identifiés à l’étape 3.2.2, ne conservez que les nœuds qui satisfont simultanément CC supérieur à la valeur médiane et BC supérieur à la valeur médiane, en suivant l’approche de sélection décrite par Kibble et ^al.9.
3. Compilation finale de la cible clé
   1. Compiler les identifiants des nœuds conservés de l’étape 3.2.3 dans une liste des protéines cibles clés et exporter cette liste sous forme de fichier CSV.
   2. Appliquer cette règle de dépistage basée sur la médiane (DC supérieure à deux fois la médiane, CC supérieure à la médiane, et BC supérieure à la médiane) comme seul critère pour l’identification des cibles clés dans tout le manuscrit, assurant la cohérence avec l’approche de dépistage unifiée établie dans le protocole.

4. Analyse d’enrichissement GO et analyse des voies KEGG

1. Analyse d’enrichissement fonctionnel à l’aide de la base de données DAVID
   1. Suivant la méthode décrite par Tanabe et ^al.10, téléchargez la liste des gènes intersectants de l’étape 1.3.4 au format du symbole génique dans la base de données DAVID à https://david.ncifcrf.gov/, mettez l’espèce sur Homo sapiens, et le type de liste sur le symbole du gène.
   2. Effectuez une analyse d’enrichissement GO en sélectionnant GOTERM_BP_DIRECT pour le processus biologique, GOTERM_CC_DIRECT pour la composante cellulaire et GOTERM_MF_DIRECT pour la fonction moléculaire, et réalisez une analyse d’enrichissement des voies KEGG en sélectionnant KEGG_PATHWAY.
   3. Fixez le seuil de signification à p < 0,05 et appliquez la correction du taux de fausse découverte de Benjamini-Hochberg (FDR) pour plusieurs tests, puis téléchargez les résultats de l’enrichissement sous forme de fichiers CSV contenant les noms de termes, le nombre de gènes, les valeurs p, les valeurs p ajustées FDR et les gènes associés.
2. Génération de graphiques à bulles via la plateforme cloud OmicShare
   1. Importez les résultats d’enrichissement GO de l’étape 4.1.3 dans la plateforme cloud OmicShare à https://www.omicshare.com/tools et sélectionnez l’outil de graphique bulles d’enrichissement GO.
   2. Téléchargez le fichier de résultats contenant les noms des termes, le nombre de gènes et les valeurs p, puis configurez l’outil pour afficher les 20 termes les plus bas avec les valeurs p les plus basses.
   3. Régler l’axe des x pour représenter le rapport d’enrichissement, l’axe des y pour lister les termes GO, la taille de la bulle pour représenter le nombre de gènes, et la couleur de la bulle pour représenter la valeur p.
   4. Générez le graphique des bulles et téléchargez-le sous forme d’image haute résolution.
3. Visualisation des chemins KEGG utilisant le cartographe KEGG
   1. Triez les résultats d’enrichissement des voies KEGG par valeur p dans l’ordre croissant et sélectionnez les 20 voies principales avec les plus petites valeurs p.
   2. Pour chaque voie sélectionnée, accédez à la base de données KEGG à https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html pour obtenir le diagramme de voie.
   3. Identifiez les protéines cibles de la liste de gènes intersectantes présentes dans chaque voie en croisant avec les ensembles de gènes des voies issues des résultats d’enrichissement.
   4. Accédez à l’outil cartographie KEGG à https://www.kegg.jp/kegg/mapper/, sélectionnez la fonction Voie des couleurs , entrez la liste des symboles de gènes qui s’intersectent et l’identifiant de la voie KEGG, et générez un diagramme des voies codées par couleur avec les protéines cibles identifiées mises en surbrillance en rouge.
   5. Compiler toutes les sorties d’analyse d’enrichissement, y compris les fichiers CSV d’enrichissement GO pour trois catégories, le fichier CSV d’enrichissement des voies KEGG, l’image du diagramme à bulles, et les diagrammes de voies codés par couleur pour les 20 principales voies, puis exportez ces fichiers pour une analyse en aval.

5. Vérification par amarrage moléculaire

1. Téléchargez les structures 3D des protéines vitales (telles que CYP3A4 et POR identifiées comme cibles clés dans l’analyse du réseau) depuis la base de données PDB du RCSB à https://www.rcsb.org/, en sélectionnant des structures avec une résolution ≤ 2,5 Å de Homo sapiens contenant un ligand co-cristallisé pour définir le site actif, et téléchargez les fichiers de données structurales des composés actifs (y compris le bêta-carotène, spathulenol, et bêta-sitostérol) de la base de données PubChem au format SDF.
2. Préparez les structures protéiques à l’aide d’AutoDockTools en retirant les molécules d’eau et le ligand co-cristallisé, en ajoutant des hydrogènes polaires et en assignant des charges de Gasteiger, puis enregistrez les protéines préparées au format PDBQT, convertissez les fichiers SDF du composé en format PDB avec Open Babel, détectez les liaisons rotatives pour chaque ligand dans AutoDockTools, et enregistrez les ligands au format PDBQT.
3. Définir la boîte de la grille d’amarrage avec des dimensions de 60 × 60 × 60 Å centrée sur les coordonnées du site de liaison du ligand co-cristallisé, puis effectuer un amarrage moléculaire en utilisant AutoDock Vina avec l’exhaustivité réglée à 8 et num_modes à 10 pour générer 10 poses de liaison pour chaque paire ligand-protéine.
4. Importez les fichiers d’amarrage résultants et leurs fichiers cibles correspondants dans PyMOL, identifiez et enregistrez le modèle d’amarrage avec la plus faible énergie de liaison (valeur la plus négative) comme pose représentative.
5. Ensuite, soumettez ce modèle à la base de données PLIP à https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/ pour analyser les interactions entre les petites molécules et les protéines, y compris les liaisons hydrogène, les interactions hydrophobes, l’empilement π et les ponts de sel.
6. Calculez et compilez les énergies de liaison de tous les composants actifs de LYXT contre les protéines cibles associées à la fièvre et à la toux, puis générez un tableau résumé contenant les noms des composés, les protéines cibles, les énergies de liaison (kcal/mol) et les types clés d’interactions pour la présentation dans la section résultats.
   REMARQUE : Le script R utilisé pour l’analyse de pharmacologie de réseau est disponible dans le fichier supplémentaire 1.

6. Expérience animale

1. Chronologie expérimentale
   1. Acclimatez les animaux pendant une semaine, puis effectuez l’administration de la solution par solution de sérum physiologique ou de solution physiologique le jour 0, administrez des traitements médicamenteux quotidiens du jour 7 au jour 20 pendant 2 semaines, et effectuez l’euthanasie avec prélèvement d’échantillon au jour 21.
2. Acquisition et regroupement des animaux
   1. Achetez 60 mâles adultes C57BL/6 souris pesant 25 ±± 4 g, nourrissez les souris pendant 1 semaine, puis divisez-les aléatoirement en un groupe SAL normal (6 souris) et un groupe lésé par LPS (54 souris).
   2. Au septième jour avant le début du traitement, il faut diviser de manière aléatoire le groupe lésé par LPS en sept sous-groupes avec 6 souris chacun : groupe modèle, groupe positif (dexaméthasone, 50 mg·^kg-1·^d-1), groupe traité LYXT (200 mg·^kg-1·^d-1), groupe bêta-carotène (50 mg·^kg-1·^d-1), groupe spathulénol (50 mg·^kg-1·^d-1), et groupe bêta-sitotérol (50 mg·^kg-1·^d-1).
      REMARQUE : L’administration du traitement et les évaluations des résultats étaient aveugles.
3. Modèle d’inflammation pulmonaire induite par le LPS
   1. Administrez 2 % de pentobarbital sodique par injection intrapéritonéale à une dose de 60 mg/kg pour l’anesthésie. Confirmez une profondeur modérée d’anesthésie en l’absence de réponse de pinçage de la queue. Enfin, sur la base du poids corporel enregistré, calculez le volume d’injection requis de LPS à une concentration de 10 mg/mL.
   2. Préparez-vous à l’administration nasale en prélevant le volume précisément calculé de solution LPS dans la pipette. Tenez fermement la souris en tenant la base de sa queue avec la main droite, tout en utilisant le pouce et l’index de la main gauche pour fixer doucement sa tête par les oreilles.
   3. Expulsez lentement le liquide jusqu’à ce qu’une petite gouttelette (environ 2 μL) se forme à l’extrémité de la pipette. Approchez prudemment la gouttelette de la narine droite de la souris jusqu’à ce qu’elle entre en contact. Soulève immédiatement et rapidement la main gauche vers le haut de 30 à 40 cm, puis remets-la doucement en place avec la souris à la position de départ.
      REMARQUE : Il est nécessaire de prêter attention aux narines de la souris pour maintenir l’état vers le haut.
   4. Utilisez la même méthode pour injecter de petites gouttes de liquide dans la narine gauche de la souris, puis les ajouter successivement dans les narines gauche et droite jusqu’à la fin de l’infusion.
   5. Ensuite, relâche la souris, fixe la souris sur la table avec du ruban adhésif, et garde la position avec l’abdomen relevé et la tête inclinée pendant plus de 4 heures. Après le réveil de la souris, remettez-la dans la cage pour observation, en suivant la méthode décrite par Lorenz et ^al.11.
4. Collecte de liquide de lavage bronchoalvéolaire
   1. Séparez aléatoirement les souris du groupe lésé par LPS en sept groupes : groupe témoin négatif, groupe modèle, groupe positif (dexaméthasone, 50 ^mg.kg-1.d-1), groupe traité par LYXT (200 ^mg.kg-1.d-1), groupe bêta-carotène (50 ^mg.kg-1.d-1), groupe spathulenol (50 ^mg.kg-1.d-1) et groupe bêta-sitostolol (50 ^{mg.kg-1.d-1),} avec six souris dans chaque groupe.
      REMARQUE : Préparez LYXT comme suit : mélangez Pharbitis nil (L.) Choisy, Verbena officinalis L. et Zingiber officinale Roscoe powder dans un ratio massif de 5:3:2.  Mélangez la poudre avec de l’eau à 1:30 (g/mL) et reflux à 80 °C pendant 2 heures. Filtrez et concentrez la solution (30 °C, 0,01–0,08 MPa) puis dissoussez-la dans de l’eau pour préparer une solution de 2 g/mL. Le bêta-carotène, le bêta-sitostérol et le spathulénol ont été utilisés comme références pour la validation expérimentale. Administrez les médicaments à chaque groupe une fois par jour pendant 2 semaines, en commençant une semaine après le traitement LPS. Euthanasiez les animaux par une overdose de thiopental (100 mg/kg), selon Jin et ^al.12.
   2. Intubez le ventricule avec une canule n° 23. Ensuite, injectez lentement 10 mL de PBS dans le tissu pulmonaire sous une pression de 25 cm H₂O, puis répétez ce lavage environ 6 fois pour obtenir le liquide de lavage bronchoalvéolaire (BALF), suivant la méthode décrite par Pinheiro et ^al.13.
5. Analyse des leucocytes et cytokines dans le BALF et le sérum
   1. Centrifugez le BALF collecté à 500 × g pendant 10 minutes à 4 °C. Resuspendez la granule cellulaire dans 1 mL de PBS, diluez 1:10 avec du bleu de trypan, et comptez le total des leucocytes à l’aide d’un hémocytomètre sous un microscope optique à un grossissement de 400×.
   2. Prélever le surnageant BALF et les échantillons sérumiques par ponction cardiaque.
   3. Mesurez les concentrations de TNF-α, IL-1β et IL-18 à l’aide de kits ELISA commerciaux selon les instructions du fabricant, en lisant l’absorbance à 450 nm avec un lecteur de microplaques, et en calculant les concentrations à partir de courbes standard. Déterminez la concentration de protéines dans le BALF à l’aide du test BCA.
6. Validation des composantes actives par analyse HE et WB
   1. Pour identifier les composants actifs contribuant à l’efficacité de LYXT, rétablir le modèle d’inflammation pulmonaire induite par le LPS en suivant la section 6.3.
   2. Achetez 60 souris, acclimatez-vous pendant une semaine, puis divisez-les aléatoirement en cinq groupes (n = 12 chacun) : groupe modèle, groupe LYXT (200 mg·^kg-1·^d-1), groupe bêta-carotène (50 mg·^kg-1·^d-1), groupe spathulénol (50 mg·^kg-1·^d-1) et groupe combiné (25 mg·^kg-1·^d-1 chacun).
   3. Administrez le LPS au jour 0 et les traitements du jour 7 au jour 20 comme décrit à l’étape 6.3. Au jour 21, prélever le tissu^{pulmonaire 14}.
7. Analyse histologique
   1. Fixer le lobe supérieur du poumon gauche dans un paraformodéhyde à 4 % pendant 24 heures, l’insérer dans la paraffine, couper les sections de 5 μm, et effectuer la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (HE).
   2. Examinez les sections au microscope optique à 200× et 400× pour évaluer l’infiltration inflammatoire des cellules et l’épaississement de la paroi alvéolaire. Capturez des images représentatives.
8. Analyse du western blot
   1. Homogénéisez le tissu pulmonaire dans un tampon de radioimmunoprécipitation (RIPA) avec des inhibiteurs de protéase et de phosphatase. Centrifugez à 12 000 × g pendant 15 minutes à 4 °C et déterminez la concentration en protéines à l’aide du test d’acide bicinchoninique (BCA).
   2. Chargez 30 μg de protéines par puits sur des gels d’électrophorèse gel de dodécyle sulfate-polyacrylamide de sodium (SDS-PAGE), transférez dans des membranes de fluorure de polyvinylidène (PVDF), et bloquez avec 5 % de lait écrémé.
   3. Incuber avec des anticorps primaires contre p-p38, p38, TNF-α, IL-1β, IL-18 et β-actine pendant la nuit à 4 °C, puis avec des anticorps secondaires conjugués à HRP.
      REMARQUE : La dilution des anticorps est fournie dans le Tableau des matériaux.
   4. Visualisez les bandes avec le substrat ECL, capturez des images et quantifiez les intensités avec ImageJ. Normaliser l’expression des protéines cibles en β-actine ou p38 total.

Résultats

La base de données TCMSP a été utilisée pour collecter 409 ingrédients actifs de LYXT. Parmi eux, 58 ingrédients provenaient de Verbena officinalis L., 86 de Semen Pharbitidis, et 265 ingrédients actifs provenaient de Zingiber officinale Roscoe. Vingt-six ingrédients actifs clés ont été dépistés selon l’indice, OB ≥ 30,1 % et DL ≥ 0,12 pour Verbena officinalis L., OB ≥ 60 %, et DL ≥ 0,13 pour Zingiber officinale Roscoe, OB ≥ 16,93 %, et DL ≥ 0,50 pour ...

Discussion

Cet article a identifié avec succès 26 ingrédients actifs et 207 cibles potentielles de LYXT, une décoction de médecine traditionnelle Dong utilisée pour la fièvre et la toux. Les principales conclusions incluent l’identification de CYP3A4 comme protéine cible critique par analyse de topologie de réseau, ainsi que la validation expérimentale de LYXT, bêta-carotène et spathulénol comme composés actifs ayant des effets anti-inflammatoires significatifs dans un modèle d’inflammation pulmona...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Anti-IL-18	Proteintech, Wuhan, Chine	27095-1-AP	Polyclonal de lapin, 1:500
Anti-IL-1 et bêta ;	Proteintech, Wuhan, Chine	66737-1-IG	Souris monoclonale, 1:500
Anti-p38	Proteintech, Wuhan, Chine	14064-1-AP	Polyclonal de lapin, 1:1000
Anti-p-p38	Proteintech, Wuhan, Chine	28796-1-AP	Polyclonal de lapin, 1:1000
Anti-TNF-& alpha ;	Proteintech, Wuhan, Chine	80258-6-RR	Monoclonal de lapin, 1:500
Anti-&bêta ;-actine	Proteintech, Wuhan, Chine	66009-1-IG	Monoclonale de souris, 1:2000
AutoDock Vina	https://vina.scripps.edu/	Version 1.5.6	Logiciel d’amarrage moléculaire
AutoDockTools	https://autodock.scripps.edu/	Version 1.5.6	Outil de préparation au docking moléculaire
Kit de test protéique BCA	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis	23225	Pour la détermination de la concentration en protéines
Bêta-carotène	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis	83-46-5	Norme de haute pureté, >95 %
Bêta-sitostérol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis	83-46-5	Norme de haute pureté, >95 %
C57BL/6 souris	Centre médical pour animaux de l’Université de Lanzhou &NBSP ;	-	Homme adulte, 25 ans et plus ; 4 g
Cytoscape	https://cytoscape.org/	Version 3.8.1	Logiciels de visualisation et d’analyse de réseaux
Dexaméthasone	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis	D4902	Contrôle positif
Substrat ECL	MilliporeSigma, Burlington, MA, États-Unis	WBKLS0500	Pour la détection des Western blots
ELISA Kits
GraphPad Prism	https://www.graphpad.com/	Version 8.0 ou supérieure	Logiciels d’analyse statistique et de graphiques
Hématoxyline et éosine (H& ; E) Kit de teinture	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd, Pékin, Chine	G1120	Pour la coloration des tissus pulmonaires
Histologie
Anti-souris conjugué HRP	Proteintech, Wuhan, Chine	SA00001-7G	Anticorps secondaire, 1:5000
Anti-lapin conjugué HRP	Proteintech, Wuhan, Chine	SA00001-7H	Anticorps secondaire, 1:5000
IL-18 ELISA Kit	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd, Pékin, Chine	SEKH-0016	Pour mesurer l’IL-18 dans le BALF et le sérum
IL-1 & bêta ; ELISA Kit	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd, Pékin, Chine	SEKM-0004	Pour mesurer IL-1 et bêta ; dans le BALF et le sérum
ImageJ	https://imagej.nih.gov/ij/	Version 1.53	Logiciels d’analyse d’images
Lipopolysaccharide (LPS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis	L2630	From  ; Escherichia coli  ; O111 :B4
LYXT Matières Premières	Université Huaihua	-	Mélange en poudre de   ; Pharbitis nil  ; (L.) Choisy,   ; Verbena officinalis  ;L., and  ; Zingiber officinale  ; Roscoe (5:3:2, c/w/w)
Autres matériaux
Pentobarbital sodium	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis	P3761	Solution à 2 % pour l’anesthésie
PLIP	https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/	-	Profileur d’interaction protéine-ligand
Membranes PVDF	MilliporeSigma, Burlington, MA, États-Unis	IPVH00010	Pour le transfert de Western blot
PyMOL	https://pymol.org/	Version 2.5	Logiciels de visualisation moléculaire
R	https://www.r-project.org/	Version 4.0 ou supérieure	Logiciels de calcul statistique et graphiques
Spathulenol	MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, États-Unis	HY-N1205	Norme de haute pureté, >95 %
STRING	https://stringdb.org/	-	Outil de recherche pour la récupération de gènes/protéines en interaction
TCMSP	https://tcmsp-e.com/	-	Base de données des systèmes de pharmacologie de la médecine traditionnelle chinoise
Thiopental	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis	T102	Pour l’euthanasie
TNF-& alpha ; ELISA Kit	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd, Pékin, Chine	SEKM-0034	Pour mesurer TNF-& alpha ; dans le BALF et le sérum
UniProt	https://www.uniprot.org/	-	Base de données de séquences et d’annotations protéiques