Imagerie en temps réel de la réponse au stress induit par l’hôte dans les agrégats de Pseudomonas aeruginosa

Résumé

Les agrégats de Pseudomonas aeruginosa démontrent une tolérance accrue aux antibiotiques et aux cellules immunitaires. Le rôle de l’intégrité des membranes dans la survie des agrégats est actuellement sous-exploré. Cette étude démontre une méthode pour quantifier les changements dans la dynamique des membranes cellulaires au sein des agrégats de P. aeruginosa afin de comprendre comment l’intégrité cellulaire peut influencer la viabilité globale des agrégats.

Résumé

Les infections chroniques, telles que celles de la mucoviscidose kystique (FQ), sont entretenues par de petits agrégats hautement tolérants de Pseudomonas aeruginosa qui persistent malgré les pressions immunitaires et thérapeutiques. Contrairement aux biofilms classiques, ces agrégats représentent une unité pathogène distincte : des communautés à micro-échelle, spatialement organisées, qui maintiennent l’intégrité structurelle et l’homéostasie physiologique sous un stress induit par l’hôte. Cependant, les mécanismes qui permettent aux agrégats de rester intacts dans ces conditions, et la question de savoir si ces processus homéostatiques peuvent être perturbés sélectivement, restent mal définis. Un obstacle clé à la comblée de cette lacune a été l’absence d’outils capables de capturer en temps réel les processus dynamiques et spatialement résolus qui relient le stress physiologique à la stabilité structurelle et à l’effondrement. Cette étude propose un flux de travail intégré d’imagerie et d’analyse pour quantifier les réponses agrégées aux facteurs de stress liés à l’hôte. À l’aide du colorant sensible à la tension_{DiBAC 4}(5), la dédé-circulation membranaire a été surveillée comme un indicateur précoce de perturbation physiologique des agrégats formés dans le milieu chimique synthétique de la mucoviscidose (SCFM2). La microscopie confocale à accéléré en temps haute résolution permet la visualisation des agrégats dans des états stables et induits par la contrainte, tandis que la segmentation d’image et l’analyse basée sur les voxels fournissent une cartographie quantitative de l’hétérogénéité spatiale dans l’intégrité des membranes et le désassemblage des agrégats à résolution monocellulaire. Ce flux de travail établit une plateforme reproductible et adaptable pour relier le stress physiologique aux résultats structurels dans les agrégats bactériens multicellulaires. En permettant une analyse quantitative des processus qui préservent – ou compromettent – l’intégrité des agrégats, cette approche fournit une base essentielle pour identifier et cibler les mécanismes homéostatiques qui sous-tendent la résilience des agrégats, faisant progresser de nouvelles stratégies pour perturber ce mode cliniquement significatif de persistance bactérienne.

Introduction

Les infections bactériennes chroniques sont souvent entretenues non pas par de grands biofilms attachés à la surface, mais par de petits agrégats multicellulaires qui se forment dans les environnements associés à l’hôte. Dans la mucoviscidose (FQ) et d’autres maladies chroniques des voies respiratoires, Pseudomonas aeruginosa existe généralement sous forme d’agrégats en suspension intégrés dans le mucus ou les crachats, plutôt que sous forme de biofilms classiques fixés aux surfaces épithéliales. Ces agrégats représentent un mode de croissance distinct, caractérisé par une organisation spatiale à l’échelle microscopique, une hétérogénéité physiologique prononcée et une tolérance exceptionnelle aux facteurs de stress immunitaire ^{et antimicrobien} 1,2,3,4. Malgré leur pertinence clinique, les mécanismes régissant la stabilité des agrégats, qui dans ce protocole est définie comme la capacité à maintenir l’intégrité et l’organisation spatiale des membranes sous de tels stresseurs, restent mal compris, les études précédentes se concentrant davantage sur les composants matriciels qui soutiennent la formation de biofilms attachés^{à la surface 5,6}.

Un obstacle majeur à l’étude des événements contribuant à la déstabilisation des agrégats, tels que les changements dans la dépolarisation des membranes et l’architecture des agrégats, est l’absence de flux de travail expérimentaux capables de capturer en temps réel les changements physiologiques et structurels^{dynamiques 7,8}. Les tests en vrac traditionnels et les approches d’imagerie finale ne peuvent pas résoudre comment les réponses au stress émergent dans les agrégats, comment ces réponses sont réparties spatialement, ni comment l’affaiblissement physiologique, tel que la dépolarisation membranaire et la perte de l’homéostasie ionique, se traduit par des signes précoces de stress cellulaire et un effondrement physique éventuel. Bien que la microscopie confocale ait été largement appliquée aux biofilms fixés en surface, moins d’approches intègrent l’imagerie résolue dans le temps avec une analyse quantitative reliant directement la physiologie cellulaire à l’architecture agrégée et à l’activité membranaire.

Les modifications du potentiel de membrane bactérienne fournissent un indicateur précoce et sensible du stress cellulaire et de la perte d’homéostasie. Des colorants sensibles à la tension tels que l’acide bis-(1,3-dibutylbarbiturique) pentaméthine oxonol (DiBAC₄(5)) s’accumulent dans les cellules dépolarisées et offrent une lecture non destructive, basée sur la fluorescence, de l’intégrité de la membrane. Bien que les colorants DiBAC aient été utilisés pour évaluer la dédépolarisation membranaire dans les cultures planctoniques et les biofilms attachés à la surface ^9,10, leur application aux agrégats multicellulaires, en particulier dans des conditions de croissance physiologiquement pertinentes et l’imagerie en accéléré, a été limitée.

Ici, nous présentons un flux de travail intégré d’imagerie et d’analyse qui permet la visualisation et la quantification en temps réel de la dépolarisation membranaire et de la rupture structurelle dans les agrégats de P. aeruginosa. Les agrégats se forment dans un milieu chimique synthétique pour la mucoviscidose (SCFM2), un milieu chimiquement défini qui reproduit les caractéristiques nutritionnelles et ioniques clés des voies respiratoires de la fibrose kystique et soutient la formation spontanée d’agrégats sans surfaces imposées ni^{écoulement 11,12}. Dans ces conditions, P. aeruginosa forme des agrégats suspendus de tailles et d’hétérogénéité structurelle comparables à ceux observés dans les échantillons de putus et de voies respiratoires de la mucacovise, fournissant une plateforme physiologiquement pertinente pour étudier le comportement des^{agrégats 13}.

Grâce à une microscopie laser confocale à balayage en accéléré sous contrôle de température et d’humidité, ce flux de travail capture à la fois des états agrégats stables et des états induits par le stress caractérisés par une dédéposition membranaire accrue et une perte d’homéostasie cellulaire sur de longues périodes d’imagerie. En combinant le rapport du potentiel membranaire basé sur le DiBAC avec l’imagerie z-stack à haute résolution, cette méthode permet de quantifier la fluorescence de DiBAC₄(5) au niveau de la cellule unique, avec des valeurs cartographiées et analysées dans le contexte spatial des agrégats individuels. La segmentation d’image en aval et l’analyse de surface basée sur les voxels permettent de quantifier en parallèle les changements d’architecture des agrégats et la dédépolarization de la membrane.

Il est important de noter que, bien que ce protocole soit démontré à l’aide d’agrégats de P. aeruginosa formés dans SCFM2, le flux de travail est largement généralisable. La stratégie d’imagerie, la lecture physiologique basée sur le contraste et le cadre analytique peuvent être facilement adaptés à d’autres espèces bactériennes, des milieux favorisant les agrégats et des facteurs de stress, y compris les agents antimicrobiens, les effecteurs immunitaires ou les perturbations environnementales. Ainsi, cette approche offre une plateforme transférable et reproductible pour interroger la stabilité des communautés bactériennes à travers divers contextes expérimentaux.

Protocole

Tous les travaux avec P. aeruginosa doivent être réalisés dans des conditions de confinement BSL-2 appropriées et des autorisations institutionnelles de biosécurité. Les réactifs et l’équipement utilisés dans cette étude sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Génération d’agrégats de Pseudomonas aeruginosa dans un milieu chimique synthétique pour la mucoviscidose (SCFM2)

REMARQUE : Cette étape décrit la préparation de cultures de P. aeruginosa et la formation d’agrégats multicellulaires suspendus dans des conditions physiologiquement pertinentes imitant l’environnement des voies respiratoires de la mucoviste.

1. Préparation des cultures bactériennes
   1. La veille de l’expérience, inoculez la Pseudomonas aeruginosa PAO1 de type sauvage transportant le plasmide pMRP9-1 (GFP⁾¹⁴ à partir de stocks de glycérol congelés dans un bouillon de lysogenèse de 5 mL (LB).
   2. Ajouter de la carbénicilline (300 μg/mL) pour maintenir la sélection des plasmides.
   3. Cultivez les cultures toute la nuit à 37 °C en secouant à 200 tr/min.
2. Rétrodilution et préparation à la formation des agrégats
   1. Le jour de l’expérience, diluer les cultures de nuit 1:5 (1 mL pendant la nuit : 4 mL LB). Les antibiotiques ne sont pas réinjectés à ce stade ; le transfert résiduel est minimal et n’affecte pas la croissance).
   2. Cultivez des cultures pendant ~2 heures à 37 °C avec secouage (200 tr/min) pour atteindre la phase logarithmique.
      REMARQUE : Les cellules sont généralement dans la phase exponentielle précoce après ~2 heures dans ces conditions. De plus, les cellules sont ensuite lavées avant l’inoculation dans SCFM2 afin de minimiser toute retransmission résiduelle d’antibiotiques.
3. Préparation et équilibrage de SCFM2
   1. Environ 30 minutes avant la fin de la période de rétro-dilution, l’aliquote pré-prépare SCFM2 dans des tubes stériles et chauffe à 37 °C.
   2. Pour l’imagerie dans une antenne optique à fond vitré à 4 puits, allouez 500 μL de SCFM2 par puits. Préparez un volume excédentaire pour compenser les erreurs de pipetage.
      REMARQUE : SCFM2 est stocké à 4 °C. Le pré-réchauffement minimise le choc thermique et améliore la reproductibilité de la formation des agrégats.
4. Lavage et standardisation de l’inoculum
   1. Cultivez les granulés par centrifugation à 4200 x g pendant 4 minutes à température ambiante.
      REMARQUE : Si des calculs jusqu’au régime par minute sont nécessaires, le rayon du rotor du seau oscillant est de 172 mm.
   2. Retirez le surnageant et remettez les granulés en suspension dans 3 mL de PBS stérile (pH 7,0).
   3. Répétez deux autres étapes de lavage (au total trois lavages).
   4. Mesurez OD₆₀₀ et calculez le volume nécessaire pour inoculer SCFM2 à un OD₆₀₀₀ de départ de 0,05.
   5. Vortex brièvement pour homogénéiser les cellules et inoculer chaque puits contenant 500 μL de SCFM2.
5. Formation d’agrégats en conditions statiques
   1. Incuber statiquement le SCFM2 inoculé à 37 °C pendant 4 heures pour permettre la formation des agrégats.
      REMARQUE : Une incubation de 4 heures produit de manière reproductible des granulats en suspension de tailles et d’hétérogénéité comparables à ceux observés dans les échantillons de crachats et de voies respiratoires de la FQ, tout en minimisant la maturation du biofilm à un stade avancé ^1,15.

2. Préparation d’un stresseur immuno-associé (élastase neutrophile humaine)

REMARQUE : Cette étape décrit la préparation d’un stresseur dérivé de l’hôte utilisé pour induire le stress cellulaire et la déstabilisation des agrégats bactériens.

1. Reconstitution et stockage de l’élastase neutrophile humaine (HNE)
   1. Reconstituez l’élastase neutrophile humaine selon les recommandations du fabricant en utilisant 50 mM d’acétate de sodium, 200 mM de NaCl et de l’eau stérile.
   2. Préparez une solution de 50 μg/L et stérilisez par filtre à l’aide d’un filtre de 0,2 μm.
   3. Alyquote en volumes de 50 mL et stockés à −20 °C.
   4. La veille de l’utilisation, décongelez une aliquote à 4 °C.
      REMARQUE : L’aliquotation minimise les cycles de gel-dégel, ce qui peut réduire l’activité enzymatique et introduire une variabilité. Les aliquotes sont stables à 4 °C pendant environ 1 mois.

3. Préparation et application de DiBAC₄(5) pour signaler la dépolarization membranaire

REMARQUE : Cette étape décrit la préparation et l’utilisation d’un colorant sensible à la tension pour visualiser la dédévergonisation membranaire à l’intérieur des agrégats.

1. Préparation et stockage de DiBAC₄(5)
   1. Commencez par préparer une solution standard de DiBAC₄(5). Reconstituez la poudre de DiBAC₄(5) dans un DMSO anhydre à 1 mg/mL.
      REMARQUE : La reconstitution du DiBAC₄(5) dans le DMSO suit les recommandations standard du fabricant.
   2. Aliquote en volumes de 100 μL et stocke à −20 °C protégée de la lumière.
   3. Utilisez chaque aliquote au maximum deux fois.
      REMARQUE : DiBAC₄(5) est fonctionnellement équivalent à DiBAC₄(3) mais sélectionné ici pour correspondre aux spectres d’excitation/émission GFP. Dans ce protocole, DiBAC₄(3) est utilisé uniquement pour une coloration supplémentaire discutée dans la section résultats. Le colorant principal utilisé tout au long de ce protocole est le DiBAC₄(5).

4. Imagerie confocale en accéléré de la dépolarization membranaire dans les agrégats de P. aeruginosa

REMARQUE : Cette étape décrit l’acquisition d’images confocales à haute résolution et résolues dans le temps afin de capturer des changements physiologiques et structurels dynamiques dans les agrégats.

1. Préparation au microscope et à la chambre environnementale
   1. Installez un insert chauffant ou une chambre d’environnement sur l’étage confocal du microscope.
   2. Activez le contrôle de température et d’humidité au moins 1 h avant l’imagerie et réglez à 37 °C.
   3. Dans l’onglet Acquisition , localisez l’onglet Laser et, environ 1 heure avant utilisation, allumez les lasers nécessaires pour permettre un échauffement adéquat (laser argon pour GFP ; DPSS 561-10 pour DiBAC₄(5)) (Figure supplémentaire 1A).
      REMARQUE : Un contrôle environnemental stable réduit la dérive de la focalisation et préserve l’intégrité des agrégats lors des expériences en accéléré prolongé.
2. Application du facteur de stress immunitaire
   1. Après 4 h de formation des granulats, ajouter de l’HNE aux puits expérimentaux jusqu’à une concentration finale de 20 μg/L¹⁶.
   2. Laissez les puits de contrôle non traités.
   3. Transférez l’antenne à 4 puits sur l’étage du microscope.
      REMARQUE : L’HNE a été préparée à des concentrations physiologiquement pertinentes (μg/L), sur la base des niveaux rapportés dans les crachats induits, plutôt qu’en tant que stock concentré. Les concentrations utilisées pour cette étude se trouvent chez McGarvey et ^al.16 sous IS (crachats induits), NE-AAT (complexe NE/a1-anti-trypsine) HV (volontaire sain).
3. Identification des régions agrégées d’intérêt
   1. À l’aide de l’onglet Localiser et d’un objectif de 20×, activez la Lumière Transmise pour identifier les régions riches en agrégats à l’aide de l’imagerie en champ clair (Figure supplémentaire 1B).
   2. Tout en utilisant toujours l’imagerie en champ clair, allez à l’onglet Acquisition et enregistrez les coordonnées x, y et z à l’aide du module Positions (Figure supplémentaire 1C).
   3. Répétez pour plusieurs réplications techniques par puits.
4. Acquisition par pile z haute résolution et série temporelle
   1. Passez à une position enregistrée et passez à un objectif d’immersion à l’huile à 63×.
   2. Appliquez de l’huile d’immersion avant de positionner la plaque.
   3. Dans l’onglet Acquisition , configurez les canaux en utilisant Smart Setup (Figure supplémentaire 1D) : GFP (488/509 nm) – assigner vert, DiBAC₄(5) (591/615 nm) – attribuer rouge.
   4. Naviguez jusqu’à la vue en direct , puis à l’aide du module Z-stack , identifiez le bas du couvert en ajustant la mise au point fine, puis définissez-la comme première position z en cliquant sur Définir d’abord (Figure supplémentaire 1E).
   5. Montez jusqu’à ce que la plage indique 60 μm et fixez la position z finale en cliquant sur Définir en dernier (Figure supplémentaire 1E).
   6. Désactivez la vue en direct et activez la mise au point définie. Sélectionnez Trouver la surface, puis sélectionnez Stocker la mise au point seulement une fois que l’état indique Réflexe trouvé (Figure supplémentaire 1F).
   7. Répétez la calibration de la mise au point pour chaque position enregistrée en utilisant les modules Z-stack et Definite Focus .
   8. Configurez l’acquisition par série temporelle pour imager chaque position toutes les 3 minutes pendant 6 heures (Figure supplémentaire 1G).
      REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici pour décongeler, ajouter et incuber le colorant DiBAC₄(5), et peut être repris après la période d’incubation.
   9. Sélectionne Démarrer l’expérience.
      REMARQUE : Les intervalles de trois minutes équilibrent la résolution temporelle avec la phototoxicité et les considérations de photoblanchiment.
5. Ajout et incubation de DiBAC₄(5)
   1. Ajouter du DiBAC₄(5) à chaque puits jusqu’à une concentration finale de 5 μg/mL⁹.
   2. Incubez dans le noir pendant 30 minutes avant d’initier l’imagerie en accéléré.
      REMARQUE : Cette incubation permet l’équilibre des colorants tout en minimisant la fluorescence de fond.

5. Analyse quantitative de l’image de la structure des agrégats et co-localisation de_{DiBAC 4}(5)

REMARQUE : Cette étape décrit un flux de travail quantitatif pour relier la dépolarisation membranaire à l’architecture des agrégats et à la déstabilisation.

1. Importation d’image et séparation des canaux
   1. Téléchargez les fichiers image (.czi ou équivalent) dans le logiciel Imaris x64 version 10.2.0 ou supérieure.
   2. Vérifiez l’étalonnage des voxels en vérifiant que les dimensions des pixels x, y et z (taille des voxels) dans les métadonnées de l’image reflètent fidèlement les paramètres d’acquisition confocaux (objectif, zoom, taille z-pas). Un étalonnage incorrect entraînera des erreurs dans les mesures spatiales et volumétriques.
2. Rendu de surface des agrégats bactériens et signal DiBAC₄(5)
   1. Utilisez le module Surfaces pour rendre les agrégats de P. aeruginosa :
      1. Dans la section Configuration de segmentation, sélectionnez le canal GFP (Figure supplémentaire 2A).
      2. Sélectionnez activer la division des objets en contact (région croissante) et ajustez le seuil d’intensité pour capturer entièrement les agrégats (Figure supplémentaire 2B).
      3. Dans le module Points de Graine de Filtre , changez le type de filtre en Nombre de voxels Img = 1 et réglez à 90 % (Figure supplémentaire 2C).
      4. Après le traitement du rendu, réglez les surfaces à 100 % (Figure supplémentaire 2D).
   2. Complétez le rendu et attribuez une coloration verte aux surfaces bactériennes (Figure supplémentaire 2E).
   3. Répétez le rendu pour le canal DiBAC₄(5) et attribuez la couleur rouge.
3. Co-localisation et quantification basée sur le volume
   1. Sélectionnez le rendu de surface_{DiBAC 4}(5) (Figure supplémentaire 3A) et déterminez à quel point temporel l’analyse de co-localisation sera effectuée.
   2. Naviguez dans Statistiques >onglet Détaillé > Valeurs spécifiques (Figure 3B supplémentaire).
   3. Définir la co-localisation en sélectionnant des objets ayant une distance la plus courte aux surfaces bactériennes de 0,00 (Figure complémentaire 3B).
   4. Localiser Éditer, puis dupliquer ces objets pour générer une surface DiBAC chevauchant avec les cellules (Figure supplémentaire 3C). Veillez à renommer cette surface pour indiquer ses qualités de chevauchement.
   5. Dans l’onglet Détaillé sous Valeurs moyennes, enregistrez les valeurs sommées des volumes à chaque ou plusieurs moment(s) sélectionné pour : (1) le signal total DiBAC₄(5) (Figure supplémentaire 3D) ; (2) Signal DiBAC₄(5) co-localisé (Figure complémentaire 3E).
   6. Calculer le pourcentage de chevauchement comme suit :
      
      REMARQUE : Le pourcentage de chevauchement reflète la proportion de signal DiBAC₄(5) associé aux cellules au sein des agrégats, réfléchissant la dédéposition membranaire à un moment donné.
      REMARQUE : Bien que démontré avec des agrégats de P. aeruginosa dans SCFM2 et stressé avec HNE, ce flux de travail est largement adaptable à d’autres espèces bactériennes, milieux favorisant les agrégats, rapporteurs fluorescents et facteurs de stress, y compris des agents antimicrobiens ou des perturbations environnementales.

Résultats

Le protocole décrit ci-dessus propose une méthode permettant de suivre les changements dans la dynamique membranaire des agrégats de P. aeruginosa, modélisés dans un environnement pulmonaire avec mucoviscidose kystique (Figure 1). En utilisant une souche de type sauvage de PAO1 transportant un plasmide pMRP9-1 (GFP) (Figure 1A), HNE pour simuler le stress immunitaire, et un colorant membranaire_DiBA...

Discussion

Le potentiel membranaire sert de lecture sensible et précoce du stress cellulaire et de l’homéostasie perturbée. Dans les agrégats bactériens multicellulaires, ces changements physiologiques se produisent avant et peuvent entraîner une déstabilisation structurelle ultérieure. Ici, nous présentons un flux de travail basé sur l’imagerie qui utilise le colorant pentaméthine oxonol bis-(1,3-dibutylbarbiturique) à réponse lente et sensible au potentiel (DiBAC₄(5)) pour suivre la dé...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
acide 1,3-dibutylbarbiturique) pentaméthine oxonol (DiBAC4(3))	AAT Bioquest	21411	; molécule lipophilique, anionique   ;
acide 1,3-dibutylbarbiturique) pentaméthine oxonol (DiBAC4(5))	AAT Bioquest	21410	; molécule lipophilique, anionique   ;
Carbénicilline   ;	Produits de recherche internationaux & nbsp ;	C46000-5.0	utilisé pour la sélection des souches exprimant la GFP de PAO1
Antenne en verre Cellvis 4 chambres de 35 mm	Fisher	NC0600518	la boîte à chambre à fond de verre permet la permanence des agrégats en suspension dans le milieu de croissance lors de l’imagerie   ;
Centrifugeuse	Beckman Coulter Life Sciences & nbsp ;	B06320	associé au rotor à seau oscillant Beckman Coulter Life Sciences SX4400 (pièce n° B01425)
Microscope laser confocal à balayage (CLSM)	Zeiss	LSM 880	le modèle de CLSM utilisé pour les expériences décrites dans ce protocole n’est plus disponible, mais le LSM 900 est une option équivalente mise à jour   ;
Culture Tubes	Genesee	21-130	stérile ; polypropylène & nbsp ;
DAPI	Thermo Fisher	62248	utilisé pour des applications futures proposées de coloration des neutrophiles avec DiBAC4(5)
Cuvettes jetables   ;	Technologie de marque	759086D	1,5 mL, semi-micro
DMSO	Millipore-Sigma	276855-100ML	utilisé pour la reconstitution de DiBAC4(3,5)
DRAQ5	Thermo Fisher	65-0880-92	utilisé pour des applications futures proposées de coloration des neutrophiles avec DiBAC4(3)
Chambre environnementale pour le CLSM	PECON	LSM 880	ce système a été conçu exclusivement pour les produits Zeiss et est généralement appelé « Système d’incubation S » ; tous les composants peuvent être commandés via Zeiss en complément du système LSM 880 (ou similaire)
Sulfate de gentamycine & nbsp ;	Fisher	BP918-1	utilisé pour la sélection des souches exprimant la demande de propositions de PA1633
Glycérol   ;	Genesee	18-205	utilisé pour congeler les souches pour un stockage à long terme à -80  ; ° ; C
Élastase neutrophile humaine (HNE)	Millipore-Sigma	324681-50UG	une fois reconstitué, il reste stable pendant 1 mois à 4  ; ° ; C ou 1 an à 20 % ; ° ; C
Logiciel Imaris x64	Oxford Instruments & nbsp ;		Version 10.2.0
Huile d’immersion & nbsp ;	Sciences de la microscopie électronique ;	16919-12	non séchant ; standardisé à 37&NBSP ; ° ; C
Incubateur  ;	Benchmark Scientific	H1001-M	capable de trembler
Bouillon de lysogenèse (LB)	Genesee	11-118	Mélange Miller
plasmide de cerises  ;			obtenu à partir d’un collaboorateur   ;
PA1633 souche mutante transposon   ;			obtenu à partir d’un collaboorateur   ;
Solution physiologique tamponnée au phosphate (PBS)	Thermo Fisher	3002	pH 7,0
Acétate de sodium	Thermo Fisher	AM9740	3 ans ; pH 5,5 ; Sans RNase
Chlorure de sodium	Fisher  ;	S271-500	utilisé pour la reconstitution de l’HNE
Spectrophotomètre & nbsp ;	VWR	634-0882	utilisé pour mesurer la densité cellulaire pour l’inoculation de PAO1/PA1633 dans SCFM2
Stérile .22µ ; Filtre m	Genesee	25-244	utilisé pour purifier l’HNE reconstitué
Tubes microcentrifuges stériles	Genesee	24-272LR	0,6 mL
Seringue stérile	Fisher	14955459	utilisé pour purifier l’HNE reconstitué
SX4400 Rotor à seau pivotante   ;	Beckman Coulter Life Sciences & nbsp ;	B01425	associé à la centrifugeuse Beckman Coulter Life Sciences (pièce n° B06320)
Milieu chimique pour la mucoviscidose synthétique (SCFM2)	SyntheBiome	10002-500	Série # : 001-CF2-0724
Eau ultra pure	Genesee	18-195	utilisé pour la reconstitution de l’HNE
Pseudomonas aeruginosa de type sauvage PAO1 avec plasmide pMRP9-1   ;			Ce plasmide pMRP9-1 contient de la GFP et exprime une résistance à la carbénicilline   ;
ZEN Black Edition 2.3 Zeiss Imaging software & nbsp ;	Zeiss		compatible avec le LSM 880