Transduction lentivirale double pour générer des cellules souches neurales mutantes pour la recherche sur le gliome

Résumé

Ce protocole décrit la génération de cellules souches neurales murines mutantes (CSN) pour la recherche sur le gliome à l’aide de transductions lentivirales séquentielles. Les mutations oncogènes sont d’abord introduites dans les CSN, suivies par un lentivirus bicistronique contenant des gènes rapporteurs. Après une double sélection antibiotique, les CSN mutants permettent l’imagerie en temps réel de la croissance tumorale et de la réponse au traitement.

Résumé

Les gliomes sont les tumeurs cérébrales primaires les plus répandues chez l’adulte, et la modélisation murine suggère qu’ils peuvent résulter de mutations oncogéniques dans les CSN ou dans les progéniteurs différenciateurs précoces. Les modèles de transplantation orthotopique dérivés de CSN mutants ont ainsi le potentiel de fournir des informations précliniques précieuses sur la pathogenèse du gliome, les résultats et la réponse au traitement. Ces modèles nécessitent l’introduction d’une mutation oncogénique dans les CSN, préférentiellement associée à des rapporteurs pour aider à déterminer l’efficacité de la transfection/transduction et pour surveiller la croissance tumorale in vivo. Ce protocole présente une méthodologie basée sur la double transduction pour générer des CSN mutants adaptés à la surveillance in vivo des tumeurs. Dans cette technique, les CSN isolés sont d’abord transduits avec des lentivirus contenant un gène d’intérêt (mutation oncogénique ou contrôle de la protéine fluorescente verte [GFP]) en plus d’un élément de résistance à la blasticidine. Après la sélection de la blasticidine, les cellules sont secondairement transduites par un vecteur lentiviral bicistronique exprimant la luciférase et la protéine fluorescente rouge (RFP), ainsi qu’un élément de résistance à la puromycine. Après la sélection de la puromycine, les cellules peuvent être développées pour des tests de prolifération, une transplantation orthotopique ou d’autres applications en aval. Cette approche de double transduction permet d’estimer l’efficacité de la transduction aux deux stades de l’infection ainsi que de surveiller in vivo l’établissement, la croissance et la réponse à la thérapie par imagerie bioluminescente non invasive (BLI). Ce système représente un outil utile pour la recherche sur le gliome, combinant la pertinence biologique de la modélisation tumorale dérivée des cellules souches neuronales adultes avec l’avantage pratique de la capacité d’imagerie en temps réel, enrichissant ainsi la compréhension de la biologie du gliome et l’avancement de nouvelles approches thérapeutiques.

Introduction

Les gliomes sont la forme la plus répandue de tumeurs cérébrales primaires chez les adultes, représentant environ 80 % de toutes les néoplases cérébrales malignes dans cette^{population 1}. La majorité de ces éléments sont des gliomes de haut^{grade 2}, généralement très invasifs et présentant un pronostic défavorable ^3,4 malgré des avancées significatives dans les techniques neurochirurgicales, la radiothérapie et les approches chimiothérapeutiques⁵. Le taux de mortalité élevé chez les patients atteints de ces tumeurs souligne la nécessité de recherches continues sur la formation et la progression du gliome.

La gliomagenèse dans le système nerveux central peut être déclenchée par l’introduction de mutations oncogéniques dans les^CSN 6,7,8,9 ou leur progéniture différenciante ^précoce 10,11,12 dans les études de modélisation murine. Notamment, ces études ont montré que les mêmes mutations oncogènes ne produisent souvent pas de tumeurs lorsqu’elles sont introduites dans des cellules plus^{différenciées 13}, établissant une hiérarchie des cellules d’origine où une restriction accrue liée à une faible susceptibilité à la transformation¹⁴. Les CSN génétiquement modifiés sont donc couramment utilisés pour générer des modèles de gliome biologiquement pertinents et polyvalents, en utilisant soit des techniques transgéniques, soit des méthodes de transplantation^{orthotopique 15}. Les deux approches permettent d’étudier la formation de tumeurs de novo dans l’environnement cérébral naturel à partir d’une cellule non transformée. Des modèles génétiquement modifiés permettent cette étude chez des animaux dotés d’un système immunitaire intact, imitant souvent mieux l’histologie et l’hétérogénéité cellulaire observées chez les tumeurs^{humaines 16}. Cependant, la génération de ces modèles est laborieuse et coûteuse, et ils présentent souvent de longues latences et de faibles fréquences de formation^{tumorale 16}. En revanche, les modèles orthotopiques de CSN sont plus facilement manipulables et rentables. Les CSN mutants peuvent être générés à partir de cellules primaires ou immortalisées de souris ou d’humains, selon les besoins expérimentaux, et sont également adaptés à l’expérimentation in vitro. ^16,17. De plus, ces modèles offrent la possibilité d’ajuster précisément le stade de développement des CSN et des souris recevrices, ainsi que la localisation spatiale à partir de laquelle les CSN sont dérivés et à laquelle ils sont introduits. Cela permet aux chercheurs d’étudier comment l’âge et des régions cérébrales spécifiques influencent la tumorigenèse provoquée par des mutations^{particulières 17}.

Ce protocole décrit la méthodologie pour générer des CSN murins mutants à partir de cultures primaires, adaptés à des applications expérimentales in vitro et in vivo (Figure 1). Le protocole se compose de deux phases de transduction distinctes qui se produisent dans une séquence temporelle spécifique. Lors de la phase initiale de transduction, les CSN murins isolés sont infectés par des lentivirus recombinants portant la construction génétique cible, soit une mutation oncogénique soit un contrôle de protéine fluorescente verte (GFP), ainsi qu’une cassette de résistance à la blasticide. Ensuite, une pression de sélection antibiotique est appliquée à l’aide de blasticidine, permettant uniquement aux cellules transduites survivantes de passer à un événement de transduction secondaire. Cet événement secondaire utilise une construction lentivirale bicistronique qui code à la fois les gènes rapporteurs luciférase luciole et la protéine fluorescente rouge (RFP), couplés avec des éléments de résistance à la puromycine pour une sélection ultérieure. Après la sélection avec la puromycine, les populations de CSN dualement transduits sont développées in vitro avant d’expérimentations ultérieures. Cette approche de transduction séquentielle offre plusieurs avantages méthodologiques : (1) elle facilite une évaluation quantitative de l’efficacité de la transduction à chaque^{étape 18}, (2) elle établit des lignées cellulaires rapporteures stables adaptées au suivi longitudinal, et (3) elle permet un suivi non invasif de l’initiation tumorale, de la cinétique de progression et des réponses thérapeutiques via les méthodologies^{BLI 18,19,20}. Il peut également être utilisé avec les CSN primaires ou^{immortalisées 21, 22, 23}.

Le protocole présenté ici répond au besoin pressant d’une approche standardisée, efficace et biologiquement pertinente pour générer des modèles de gliome dérivés des NSC à partir d’animaux adultes dotés de capacités d’imagerie intégrées. Les modèles résultants devraient fournir des informations cliniquement pertinentes concernant la pathogenèse du gliome, faciliter l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques et présenter des bases solides pour l’évaluation préclinique des stratégies thérapeutiques émergentes.

Protocole

Cette étude a été menée conformément aux normes éthiques et aux directives réglementaires établies par l’Université Washington à St. Louis. Pour ce protocole, le cortex des souris adultes a été micro-disséqué selon la technique²⁴ précédemment décrite par le laboratoire Brossier et utilisé pour isoler les CSN murins primaires en vue d’une expansion ultérieure en culture non adhérente selon le protocole^établi 24,25,26. Tous les réactifs utilisés en culture sont soit sous forme stérile, soit passés à travers un filtre à membrane de 0,2 μM pour garantir la stérilité. Les réactifs et l’équipement utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Isolation de cellules souches neuronales à partir de tissu microdisséqué

1. Préparez les médias de dissociation (DM) et le médium de digestion de la trypsine (TDM), comme indiqué dans les recettes de la Figure 2.
   1. Ajoutez 200 μL de milieu de digestion à la trypsine dans des tubes microcentrifuge de 1,5 mL et laissez sur la glace pendant au moins 20 minutes avant utilisation. La DM peut être laissée à température ambiante pour les étapes ultérieures du protocole.
   2. Pendant que les tubes sont pré-refroidis, préparez un milieu de cellules souches neurales (NSC ; recette illustrée à la Figure 2) et placez le NSC et le sérum bovin fœtal (FBS) à 37 °C dans un bain d’eau ou de perles pour préchauffer. Placez des aliquotes de compléments (B27, N2) et des facteurs de croissance (EGF, FGF) dans un seau à glace pour les décongeler lentement.
      REMARQUE : Le TDM doit être préparé frais à chaque fois avant utilisation, bien que le NSC et le DM puissent être stockés à 4 °C entre les utilisations ; Les recettes sont présentées à la Figure 2. Les stocks de N2, B27, EGF et FGF doivent être alicotés et stockés à -20 °C jusqu’à leur utilisation ; éviter les gels-dégel répétés des stocks reconstitués (voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur la préparation des stocks de l’EGF et du FGF).
2. Après que les tubes microcentrifuges contenant du TDM ont été suffisamment refroidis, micro-disséque le tissu comme décrit précédemment²⁴. Après chaque micro-dissection, placez le tissu dans un tube de microcentrifuge. Reposez le tube sur la glace jusqu’à ce que toutes les dissections soient terminées, car tout réchauffement des tissus pourrait commencer le processus de digestion enzymatique plus tôt et entraîner une surdigestion.
3. Incubez le(s) tube(s) de la microcentrifuge à 37 °C dans un bain d’eau ou de perles pendant 15 minutes pour initier la digestion enzymatique. Pendant l’incubation, préparez 10 % de FBS dans le NSC en ajoutant 0,5 mL FBS à 4,5 mL de NSC.
   1. Après l’incubation, on pipetterait doucement 5 à 10 fois avec une micropipette de 1 mL pour dissocier davantage les cellules, puis neutraliser la trypsine en ajoutant 200 μL de 10 % de FBS en NSC à chaque échantillon. Faites doucement une pipette de haut en bas pour mélanger.
      REMARQUE : Il est crucial de respecter le temps d’incubation recommandé à 37 °C. La sur-trypsinisation peut entraîner la mort cellulaire, tandis qu’une sous-trypsinisation peut rendre l’échantillon difficile à dissocier (voir Tableau 1, Points 1–2 pour ce conseil et d’autres conseils de dépannage).
      REMARQUE : Un bain-marie ou un bain de perles peut être utilisé pour incuber des échantillons ; ce dernier risque peut réduire le risque de contamination²⁷, mais cela peut s’accompagner d’un risque de transfert de chaleur^{moins efficace 28}.
4. Centrifugez les cellules primaires isolées à 630 × g pendant 5 minutes à 4 °C. Aspirez le surnageant, en faisant attention à ne pas déranger les cellules au fond du puits. Lavez les cellules en ajoutant 2,5 mL de DM à la pellete cellulaire et en les resuspendant en pipettant doucement 3 à 4 fois. Faites redescendre à 630 × g pendant 5 minutes à 4 °C, puis aspirez soigneusement le surnageant.
5. Répétez l’étape 1.3 pour effectuer un second lavage. Lors du lavage final, ajoutez B27, N2, FGF et EGF à un milieu NSC de base pré-chauffé pour créer un milieu NSC complet (recette illustrée à la Figure 2).
6. Aspirez le surnageant. Ajoutez 2 mL de milieu CSN complet tiède à chaque pellet cellulaire, puis resuspendez en pipettant doucement 3 à 4 fois. Placez les cellules en suspension dans un puits d’une plaque d’attache basse à 6 puits et incubez à 37 °C.
   REMARQUE : Bien que le milieu NSC de base puisse être stocké à 4 °C entre les utilisations, les compléments et facteurs de croissance peuvent subir une dégradation à cette température. Ainsi, B27, N2, FGF et EGF doivent être ajoutés au support NSC pour créer un support NSC complet immédiatement avant utilisation.

2. Établissement et expansion de la culture de la neurosphère

1. Administrez 0,5 à 1 mL de milieu nourrissant frais de CSN (recette illustrée à la Figure 2) à chaque puits des cultures de CSN tous les 3 jours.
2. Surveillez la formation de la neurosphère. Lorsque de petites sphères entièrement formées sont visibles, la culture est prête à être lancée (généralement 5 à 10 jours après le plaquage initial).
   REMARQUE : Les cellules se développent mieux lorsqu’elles sont fréquemment transmises et encore en phase de croissance logarithmique. Les neurosphères plus grandes sont plus difficiles à dissocier et plus sujettes à la mort cellulaire durant ce processus. Ainsi, un passage plus précoce et plus fréquent est recommandé pour favoriser la santé cellulaire. Lorsqu’elles sont prêtes à être traversées, les neurosphères isolées mesurent environ ~100 à 200 μm de diamètre, avec des cellules fortement compactées et des bordures lisses et bien définies sous microscopie en champ clair. Les neurospheres n’affichent pas de projections irrégulières ni d’extensions. Le centre des neurosphères sera légèrement plus foncé que les bords extérieurs, mais pas de façon excessive ; des noyaux excessivement foncés résultent souvent de la nécrose des cellules centrales due à une privation de nutriments lorsque les neurosphères ont été envahies. Le passage de neurosphères surdimensionnées entraîne souvent une forte mortalité cellulaire, ce qui peut affecter les applications en aval. Voir le tableau 1, points 3 à 4, pour ce conseil et d’autres conseils de dépannage.
3. Préchauffez le milieu NSC, DM, 0,05 % de trypsine-EDTA et la solution saline tamponnée phosphate (PBS) à 37 °C à l’aide d’un bain d’eau ou de perles. Mettez les stocks de B27, N2, FGF, EGF et FBS sur glace jusqu’à ce que ce soit nécessaire.
4. Pour les laisser passer, transférer des neurosphères bien cultivées dans un tube conique stérile de 15 mL à l’aide d’une pipette sérologique. Centrifugez à 630 × g pendant 1 minute à 4 °C pour stabiliser les neurosphères. Aspirez le surnageant, en faisant attention à ne pas perturber les neurosphères granulées. Lavez les cellules en les resuspendant dans un PBS stérile 1x, puis centrifugez à nouveau à 630 × g pendant 5 minutes à 4 °C et aspirez le surnageant.
5. Ajoutez 1 mL de trypsine à 0,05 % de Trypsine/EDTA à la granule cellulaire. Pipiquez 3 à 5 fois avec une micropipette de 1 mL pour mélanger, puis faites couver à 37 °C dans un bain d’eau ou de perles pendant 5 à 6 minutes.
   1. Après l’incubation, pipettez doucement 5 à 10 fois avec une micropipette de 1 mL pour briser les neurosphères. Neutraliser la trypsine en ajoutant 1 mL de 10 % de FBS dans un milieu NSC ; Pipette doucement pour mélanger.
      REMARQUE : Évitez la sur-trypsinisation et/ou la pipetage trop vigoureuse des neurosphères, car cela pourrait endommager les CSN et affecter la viabilité cellulaire.
6. Ajoutez 2,5 mL de DM et centrifugez à 630 × g pendant 5 minutes à 4 °C. Aspirez le surnageant. Répétez l’étape de lavage avec une autre dose de 2,5 mL de DM, suivie de centrifugation et d’aspiration de surnageant, pour éliminer les traces de FBS dans le milieu.
7. Resuspendez les cellules dans 1 mL de milieu NSC complet et frais. Suspension de cellules filtrantes en plaçant un filtre stérile de 40 μm dans un tube microcentrifuge de 50 mL, puis en ajoutant la solution de la cellule au dessus du filtre et en laissant la gravité drainer la solution dans le tube. Les cellules non dissociées restantes seront capturées par le filtre, tandis que les cellules individuelles passeront vers la solution en dessous.
8. À partir des cellules remises et filtrées, on prend 10 μL pour le comptage cellulaire et mélange-les avec 10 μL de bleu de trypan. À l’aide d’un hémocytomètre manuel, chargez 10 μL de l’échantillon et comptez les cellules viables (c’est-à-dire celles qui ne sont pas bleues) selon la pratique^{standard 29}. Alternativement, un compteur de cellules automatisé peut être utilisé, bien qu’il puisse être moins précis en présence de débris cellulaires ou d’agrégats^30,31.
   REMARQUE : En général, moins de 10 % à 15 % du total des cellules devrait présenter des signes de mort cellulaire (par exemple, l’impossibilité d’exclure le bleu de trypan). Des taux plus élevés de mort cellulaire peuvent résulter d’une sur-trypsinisation, d’une force mécanique excessive dans la séparation des cellules, ou d’une mauvaise santé globale de la culture avant la trypsinisation (voir Tableau 1, points 1–3). Comme cela peut avoir un impact négatif sur les applications en aval, il est recommandé de replacer les cellules (Étape 2.9) puis d’élargir à nouveau (par exemple, répéter les Étapes 2.1–2.9) si des taux élevés de mortalité cellulaire sont observés plutôt que de procéder à la transduction.
9. Diluez 5 x 10 cellules⁵ dans 2 mL de milieu NSC complet et frais et placez dans un puits d’une plaque à 6 puits à attachement ultra-faible. Administrez 0,5 à 1 mL d’alimentation de NSC frais à chaque puits tous les trois jours afin d’assurer une santé optimale en culture. Lorsque les sphères en bonne santé sont complètement formées (voir Tableau 1, Point numéro 4), la culture est prête à être utilisée à l’étape 3 ou 4.
   REMARQUE : Des CSN supplémentaires peuvent être stockés à ce stade en resuspendant un million de CSN dans 1 mL de milieu de congélation cellulaire sans sérum dans un cryovial de 1,5 mL et en les stockant à -80 °C. Les CSN peuvent également être davantage étendus si nécessaire en plaquant des cellules supplémentaires dans des puits supplémentaires de la plaque à 6 puits ou en les plaquant dans des flasques T-25.

3. Courbe de mort de blasticidine dans les cellules mères

REMARQUE : Une fois que les CSN passés forment des neurosphères saines, les cellules sont prêtes pour des expérimentations ultérieures. Avant la transduction, il est crucial de déterminer la concentration optimale de l’antibiotique de sélection (la blasticidine, dans ce cas). Cela doit être réalisé empiriquement, car différentes populations de CSN peuvent avoir une sensibilité différente à l’antibiotique. Si cela a déjà été déterminé pour le type de cellule donné, passez à l’étape 4.

1. Préchauffez le milieu NSC de base, la DM, 0,05 % de Trypsine-EDTA et PBS à 37 °C. Stocks de dégel de B27, N2, FGF, EGF, FBS et blasticidine. Avant de commencer, ou pendant les étapes d’incubation ci-dessous, préparez un milieu NSC complet et frais et 10 % de FBS dans un milieu NSC décrit ci-dessus.
2. En utilisant des neurosphères fraîchement développées (après culture de l’étape 2.9 ci-dessus), trypsinez puis séparez selon les étapes 2,5 à 2,6, puis resuspendez dans 1 mL de NSC frais pour le comptage. Filtrez les cellules à travers un filtre stérile de 40 μm comme décrit ci-dessus pour éliminer les cellules non dissociées, puis comptez les cellules comme décrit à l’étape 2.8.
3. Resuspendez 25 000 cellules viables dans 2,5 mL aliquotes de NSC frais complet dans 15 mL coniques, avec 1 aliquote préparée par concentration d’antibiotique à tester. Prévoyez de tester au moins 4 à 6 concentrations différentes, bien que davantage puissent être testées si désiré.
4. Ajoutez la quantité appropriée de blasticidine à chaque aliquote de 2,5 mL pour atteindre la concentration finale souhaitée (voir les calculs d’échantillons dans le tableau 2). Plaque de 500 μL de cellules en suspension (5 000 cellules) par puits dans une plaque d’attache ultra-faible à 24 puits, chaque concentration étant placée en quadruplicate.
   REMARQUE : Pour obtenir la bonne concentration finale, il peut être nécessaire de diluer le stock de blasticidine avant d’être ajouté au milieu. La blasticidine peut être diluée dans un milieu NSC ou PBS ; pour un fond dilué à 1:1000 (10 mg/mL), ajoutez 1 mL de bouillon de blasticidine non dilué (10 mg/mL) à 999 mL de NSC ou PBS. Il est recommandé aux chercheurs d’effectuer tous les calculs nécessaires pour atteindre les concentrations souhaitées pendant le réchauffement des matériaux à l’étape 3.1 ; exemples de calculs présentés dans le tableau 2.
5. Incubez les cellules à 37 °C. Vérifiez attentivement les cellules à l’aide de la microscopie à champ clair toutes les 24 heures pour détecter des changements de morphologie et de mort cellulaire/neurosphère. Alimentez les cellules tous les 3 jours en ajoutant 0,5 à 1 mL de milieu nourrissant NSC frais complété avec la bonne concentration de blasticidine.
6. Déterminez la concentration appropriée pour la sélection ultérieure de blasticidine en identifiant la concentration la plus basse qui tue les cellules non transduites entre 72 et 120 h après le plaquetage.
   REMARQUE : Pour les CSN murins adultes, 1000 ng/mL (1 mg/mL) de blasticidine a été identifiée comme la meilleure concentration pour le choix des antibiotiques (Figure 3). Les étapes suivantes sont effectuées à l’aide de blasticidine à cette concentration. Il convient de noter que la concentration optimale de blasticidine peut varier considérablement selon les préparations cellulaires, généralement entre 0,5 et 10 μg/mL selon le type d’échantillon, le nombre de passages et les conditions de culture^32,33 ; Les courbes de destruction empiriques sont donc essentielles plutôt qu’optionnelles pour chaque nouveau type de cellule. Voir le tableau 1, point numéro 5 pour des conseils supplémentaires de dépannage.

4. Première transduction lentivirale

REMARQUE : Avant de procéder à la transduction, il est essentiel de connaître la multiplicité optimale de l’infection (MOI) à laquelle transduire les particules lentivirales (LVP). Cela doit être déterminé empiriquement pour différents types cellulaires ; Les méthodes pour y parvenir ont déjà été bien^{décrites 34,35}. Dans les résultats illustratifs illustrés, un MOI de 20 a été utilisé basé sur l’expérience préalable de transduction de CSN murin primaire.

1. Commencez par des CSN étendus et non transduits formant des neurosphères saines (générées après expansion cellulaire à l’étape 2.9 ci-dessus). Séparer, resuspendre, filtrer et compter les cellules selon les étapes 2.3–2.8 ci-dessus, puis placer les cellules à une densité de 1,5 x 10⁶ cellules par puits dans deux puits (un pour le virus oncogène, un pour le contrôle) d’une plaque à 6 puits à ultra faible adhérence. Incubez les plaques toute la nuit à 37 °C.
2. Le lendemain, examinez les cellules. Les CSN seront prêts à être infectés s’ils forment de petits amas de groupes.
3. Avant d’infecter les cellules, décongelez soigneusement l’aliquote lentivirale sur de la glace, permettant ainsi une dégel graduelle. Il est essentiel de ne pas précipiter ce processus.
   REMARQUE : À titre illustratif, ce protocole décrit la transduction lentivirale à l’aide de deux constructions représentatives : (1) un vecteur de contrôle exprimant la GFP sous le promoteur EF1-α avec une résistance à la blasticidine, et (2) un vecteur expérimental exprimant un mutant oncogénique BRAF V600E marqué N-terminal HA sous le promoteur EF1-α, également avec une résistance à la blasticidine. La génération de lentivirus dépasse le cadre de ce protocole mais a déjà été bien^{décrite 36,37}.
4. Après dégel, réchauffez brièvement le virus à 37 °C juste avant l’infection. Déterminez le volume de LVP à ajouter à chaque puits, en utilisant la formule MOI x nombre de cellules/titer du virus. En utilisant une micropipette réglée au volume calculé, ajoutez lentement les LVP goutte par goutte sur les cellules cultivées. Faites tourner doucement la plaque pour la répartir, en faisant attention à ne pas déverser le substrat dans les puits adjacents. Incubez les cellules à 37 °C pendant 24 heures.
   REMARQUE : Une fois l’aliquote virale décongelée à température ambiante, elle ne peut plus être recongelée et doit être utilisée dans les 24 heures. Une fois l’aliquote réchauffée à 37 °C, elle doit être utilisée dans un délai de 30 minutes.
5. Après cette période d’incubation, centrifugez les neurosphères à 630 × g pendant 5 minutes à 4 °C, puis aspirez le surnageant. Resuspendez dans 2 mL de CSN complet et frais, sans virus ni antibiotique, puis placez dans un puits frais d’une plaque à faible attachement à 6 puits.
6. Le lendemain, évaluez l’efficacité de transduction dans les cellules témoins GFP en déterminant la proportion de cellules/amas marqués fluorescentement par rapport au total des cellules/amas par microscopie à fluorescence dans plusieurs champs. L’expression attendue du rapporteur (GFP) devrait dépasser 80 % pour une transduction réussie.
   REMARQUE : Si une efficacité de transduction sous-optimale est observée, une seconde vague d’infection (répétition des étapes 4.4–4.6) peut être effectuée. Si l’efficacité ne s’améliore pas, envisagez une réoptimisation du MOI ou un essai d’une autre préparation du lentivirus. Voir le tableau 1, point numéro 6 pour ces conseils et d’autres conseils de dépannage.
7. Après avoir observé que les neurosphères en développement paraissent saines et que des preuves d’infection sont présentes (GFP positif ; ~80 %), procédez à la division des cellules selon les étapes 2.3 à 2,6 ci-dessus. Resuspendez les cellules dans 5 mL frais de milieu NSC complet contenant la concentration appropriée de blasticidine (1000 ng/mL), puis filtrez à travers des filtres stériles de 40 μm pour éliminer les amas cellulaires. Compter les cellules, puis plaquer à environ 5 x 10⁴ cellules/mL dans des flasques T-25 à ultra faible attachement.
   REMARQUE : Après l’ajout initial d’un antibiotique, un taux élevé de mortalité cellulaire peut être élevé lorsque les cellules non transduites meurent ; C’est attendu, et cela devrait s’améliorer avec la sélection continue.
8. Faites évoluer les cellules en les nourrissant tous les 3 jours avec un complément alimentaire contenant de la blasticidine. Lorsque les sphères en bonne santé sont complètement formées, généralement 5 à 10 jours après la séparation, la culture est prête à être utilisée à l’étape 5 ou 6.
   REMARQUE : Après une expansion supplémentaire des clones résistants, des cellules peuvent être collectées pour un Western blot (décrit à l’étape 7) afin de valider que la construction oncogénique marquée par l’eau HA et non fluorescente est exprimée de manière appropriée. Si un Western blot est pratiqué à cette étape, il est toujours recommandé de vérifier l’expression après la^2e transduction (à l’étape 7), afin d’assurer une expression continue appropriée.

5. Courbe de tuée de la puromycine dans les CSN résistants à la blasticidine

REMARQUE : La concentration optimale de sélection pour la seconde transduction doit également être déterminée empiriquement. Des CSN transduits résistants à la blasticidine sont utilisés à cette étape, et les cellules sont maintenues sous sélection de blasticidine (1000 ng/mL) tout au long de la durée, car la transduction et la sélection simultanée de blasticidine peuvent modifier la sensibilité à la puromycine.

1. Préchauffez le milieu NSC de base, la DM, 0,05 % de Trypsine-EDTA et PBS à 37 °C. Dégelez des stocks de B27, N2, FGF, EGF, FBS, blasticidine et puromycine. Avant de commencer, ou pendant les étapes d’incubation ci-dessous, préparez un milieu NSC complet et frais et 10 % de FBS dans un milieu NSC décrit ci-dessus.
2. À l’aide de neurosphères résistantes à la blasticidina, trypsinisez puis séparez selon les étapes 2.5–2,7, puis en resuspendant 1 mL de NSC frais pour compter et filtrer afin d’éliminer les amas de masse. Compter les cellules comme décrit à l’étape 2.8, puis resuspendre 25 000 cellules viables dans 2,5 mL aliquotes de NSC complet frais dans 15 mL coniques, avec 1 aliquote préparée par concentration d’antibiotique à tester. Prévoyez de tester au moins 4 à 6 concentrations différentes, bien que davantage puissent être testées si désiré.
3. Ajoutez de la blasticidine pour obtenir la concentration précédemment optimisée (1000 ng/mL = 0,25 mL de stock non dilué / 2,5 mL aliquote). Ensuite, ajoutez la quantité appropriée de puromycine à chaque tube pour atteindre la concentration finale souhaitée (voir les calculs exemples dans le tableau 2).
4. Plaque de 500 μL de cellules en suspension (5 000 cellules) par puits dans une plaque d’attache ultra-faible à 24 puits, chaque concentration étant placée en quadruplicate.
5. Incubez les cellules à 37 °C. Vérifiez attentivement les cellules à l’aide de la microscopie à champ clair toutes les 24 heures pour détecter des changements de morphologie et de mort cellulaire/neurosphère. Nourrissez les cellules tous les 3 jours en ajoutant 0,25 mL de milieu nourrissant NSC frais complété avec de la blasticidine et la bonne concentration de puromycine.
6. Déterminez la concentration appropriée pour la sélection ultérieure de puromycine en identifiant la concentration la plus basse qui tue les cellules entre 72 et 120 heures après le plaquetage.
   REMARQUE : Pour les CSN murins adultes transduits avec des lentivirus illustratifs GFP et/ou BRAF-V600E, 100 ng/mL de puromycine a été empiriquement déterminée comme la meilleure concentration pour la sélection des antibiotiques (Figure 4). Pour les transductions par exemple, les étapes suivantes ont été effectuées en utilisant 1000 ng/mL de blasticidine (à l’étape 3 ci-dessus) et 100 ng/mL de puromycine (à l’étape 5 ci-dessus). Voir le Tableau 1, point numéro 5, pour des conseils de dépannage.

6. Deuxième transduction lentivirale

REMARQUE : Les cellules restent dans des milieux contenant de la blasticidine pendant la deuxième phase de transduction afin de garantir que la construction oncogénique ou le contrôle GFP introduit lors de la première phase de transduction soit maintenu dans les cellules.

1. Initiez la procédure en utilisant des NSC résistants à la blasticidine en prolifération active et transduits de manière stable (générés à l’étape 4). Commencez par dissocier les NSC en une suspension à cellule unique (étapes 2.3–2.7) afin d’assurer l’uniformité lors du placage.
2. Cellules de plaque à une densité de 1,5 x 10,⁶ cellules par puits dans un milieu NSC complet avec blasticidine (1000 ng/mL, comme déterminé à l’étape 3) dans une plaque à 6 puits à ultra faible adhérence. Incubez les plaques toute la nuit à 37 °C.
3. Le lendemain, les cellules seront prêtes à être transductues si elles forment de petits amas de groupes. Décongelez le lentivirus bicistronique (contenant la luciférase et la RFP) sur de la glace, puis réchauffez brièvement à 37 °C juste avant l’infection. Déterminer le volume de LVP à ajouter à chaque puits, en utilisant la formule MOI x nombre de cellules/titer du virus ; un MOI de 20 est utilisé ici.
   1. En utilisant une micropipette réglée au volume calculé, ajoutez lentement les LVP goutte par goutte sur les cellules cultivées. Faites tourner doucement la plaque pour la répartir, en faisant attention à ne pas déverser le substrat dans les puits adjacents. Incubez les cellules à 37 °C pendant 24 heures.
4. Le lendemain, centrifugez les neurospheres à 630 × g pendant 5 minutes à 4 °C et replaquez-les dans un NSC complet frais contenant de la blasticidine (1000 ng/mL, comme indiqué à l’étape 3).
5. Le lendemain, évaluez l’efficacité de la deuxième étape de transduction en déterminant la proportion de cellules/amas positifs à la RFP par rapport au total des cellules/amas par microscopie à fluorescence dans plusieurs champs, avec une efficacité optimale de ~60 %.
6. En observant que les neurosphères paraissent saines et que la deuxième étape de transduction était efficace (par exemple, la majorité des amas cellulaires sont RFP+), les cellules sont prêtes à la double sélection. Commencez par dissocier les CSN en une suspension unicellulaire (étapes 2.3–2,7), puis replacez à environ 5 x 10⁴ cellules/mL dans des flasques T-25 à très faible attachement dans un NSC complet contenant de la blasticidine (1000 ng/mL) et de la puromycine (100 ng/mL).
   REMARQUE : Comme à l’étape 4.6 ci-dessus, si une efficacité de transduction sous-optimale est observée, une seconde vague d’infection (répétition des étapes 6.3–6.6) peut être effectuée. Voir le tableau 1 pour d’autres conseils de dépannage.
7. Nourrissez les cellules tous les 3 jours avec un complément alimentaire contenant de la blasticidine et de la puromycine.
   REMARQUE : Une surveillance vigilante des cultures est essentielle pour identifier les clones doublement résistants, qui se caractériseront par leur survie sous ces deux pressions sélectives. Lorsque les sphères saines et pleinement formées sont visibles, généralement 5 à 10 jours après la scission, la culture est prête pour une validation supplémentaire (Étape 7).

7. Validation et caractérisation des CSN à double transduction

REMARQUE : Avant d’effectuer d’autres expérimentations in vitro ou in vivo. une validation supplémentaire est recommandée afin de s’assurer que les constructions marquées HA et la luciférase sont exprimées de manière appropriée.

1. Western blotting pour valider l’expression du construct marqué HA
   1. Culture des NSC (contrôle GFP et BRAF marqué HA). V600E, dans l’exemple fourni) dans des flasques à ultra-faible adhésion T-25 jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à être divisées (comme indiqué à l’étape 2.2).
      REMARQUE : Avant de passer à l’étape suivante, il est recommandé de vérifier deux fois les cultures pour l’expression continue de la GFP (dans les cellules témoins) et l’expression RFP (dans toutes les cellules).
   2. Retirez la moitié de la culture et séparez comme indiqué aux étapes 2.2–2.7, puis replacez dans un milieu NSC complet frais avec de la blasticidine (1000 ng/mL) et de la puromycine (100 ng/mL) pour une expansion continue de la culture. Faites tourner le reste des neurospheres à 630 × g à 4 °C, puis aspirez le surnageant.
   3. Ensuite, lavez deux fois les NSC en granules avec du PBS glacé, en centrifugant à 630 × g à 4 °C et en aspirant le surnageant après chaque lavage. Ajouter environ 200 μL de tampon de lyse RIPA glacé, complété par des inhibiteurs de protéase et de phosphatase, à chaque échantillon.
   4. Laissez les lysats incuber sur la glace pendant 30 minutes, en assurant un vortex intermittent toutes les 10 minutes. Centrifugez les échantillons à 14 000 × g pendant 15 minutes à 4 °C. Transférez soigneusement le surnageant, désigné comme lysat dégagé, dans un tube pré-refroidi frais. Conservez les lysats à -80 °C dans un congélateur profond.
   5. Le lysate peut ensuite être utilisé pour le Western blotting (pour valider l’expression des constructions) selon les protocoles³⁸ établis précédemment.
      REMARQUE : Si vous ne l’utilisez pas immédiatement, conservez les lysats à -80 °C jusqu’à utilisation. Éviter les cycles répétés de gel-dégel afin de maintenir l’intégrité de l’échantillon ( voir Tableau 1, Point n° 7).
2. Intensité de bioluminescence (BLI) pour valider l’expression appropriée de la luciférase luciole
   REMARQUE : Ce protocole valide l’expression de la luciférase en utilisant la surveillance BLI des cellules vivantes à l’aide de matériel et de logiciel spécifiques (voir Tableau des matériaux pour plus de détails). Si vous utilisez un système différent pour la détection et la quantification de BLI, la méthodologie peut varier.
   1. Séparez les CSN et quantifiez selon les étapes 2.2 à 2,8 ci-dessus, puis diluez les cellules dans un milieu et une plaque NSC complets à différentes concentrations (par exemple, 2,5 x 10^{cellules de 4} cellules, 1 x 10^{cellules de 5} cellules/puits) dans une plaque d’adhérence ultra-basse à 24 puits (500 mL/puits), chaque concentration de cellule étant placée en quadruplicate. Les cellules sont maintenues dans un milieu complet de NSC contenant de la blasticidine (1000 ng/mL) et de la puromycine (100 ng/mL).
      REMARQUE : Pour éviter que l’intensité de luminescence sécrétée par luciférase d’un puits ne déborde dans les puits adjacents lors de la mesure, évitez de plaquer les CSN dans les puits adjacents.
   2. Allumez le système d’imagerie au moins 30 minutes à l’avance pour permettre à la caméra du dispositif à charge couplée de refroidir à sa température de fonctionnement optimale (environ -90 °C). Lancez le logiciel de quantification et désinfectez la chambre d’imagerie avec 70 % d’éthanol, la laissant sécher complètement avant utilisation.
      REMARQUE : Maintenez la température de la chambre d’imagerie à 37 °C pour assurer la viabilité cellulaire lors de longues séances d’imagerie.
   3. Décongelez les aliquotes d’origine de D-luciférine, en veillant à ce qu’elles soient protégées de l’exposition à la lumière. Ajouter un volume de 5 μL de solution active de D-luciférine à 15 mg/mL délicatement sur chaque cellule contenant un puits pour atteindre une concentration finale de 150 mg/mL. Faites légèrement tourner la plaque pour assurer une répartition uniforme de la solution.
   4. Incubez la plaque à 37 °C pendant 10 minutes pour faciliter la diffusion du substrat dans les cellules, favorisant ainsi une production maximale de lumière.
   5. Positionnez la plaque dans le système d’imagerie bioluminescence sensible. Placez une grille sur la plaque. Sélectionnez le mode d’imagerie luminescence , en commençant par l’exposition automatique pendant la durée d’exposition. Réglez le binning à moyen, puis ajustez le fil à 1 pour optimiser la collecte de lumière.
      1. Réglez le champ de vision sur « D » pour les plaques à 24 puits, et fixez la hauteur du sujet à 1,5 cm. Acquérez des images avec le logiciel d’imagerie. Si le signal semble faible, le temps d’exposition peut être ajusté manuellement (voir le tableau de dépannage n° 8).
   6. Effectuer une correction de fond par rapport aux puits de contrôle et quantifier les unités lumineuses relatives selon les besoins pour une analyse ultérieure à l’aide du logiciel d’imagerie.
      REMARQUE : Après validation de la BLI, les cellules peuvent être transplantées orthotopicement dans le cerveau de souris syngéniques ou immunodéprimées, conformément aux protocoles¹⁹ précédemment établis.

Résultats

Les CSN adultes ont été isolés du cortex de souris adultes C57BL/6 et cultivés en culture³⁹ non adhérente, ce qui a entraîné la formation de neurosphères primaires (20 – 250 μm) en 7 à 10 jours (Figure 1). Les cellules ont ensuite été dilatées in vitro. L’optimisation de la sélection de blasticidine a ensuite été réalisée dans les CSN non transduits (Étape 3). Après 24 heures de sélection, des concentrations égales o...

Discussion

Cette méthode de transduction lentivirale en deux étapes a permis de générer avec succès des CSN génétiquement modifiés adaptés à la recherche en oncologie. Ici, l’intégration efficace de la mutation oncogénique BRAF V600E (trouvée dans un sous-ensemble de gliomes adultes de haut grade et utilisée ici comme preuve de concept) ou du contrôle GFP avec des systèmes à double rapporteur pour l’imagerie par bioluminescence (luciférase) et la détection par microscopie à fluorescence (R...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
& beta;-mercaptoéthanol (BME)	Sigma	M3148-25ML	Utiliser à l'intérieur d'une hotte de sécurité biologique. Préparer des stocks à 50 mM en ajoutant 35 mL de BME à 10 mL de DMEM à faible teneur en glucose, filtrer de manière stérile et répartir en aliquots de 500 mL à utiliser dans la préparation des milieux.
Anticorps IgG anti-souris, liés à la HRP	Cell Signal Technology	7076	Utilisé à une dilution de 1: 2000 dans 1 % de lait écrémé
Supplément B-27 (50X),	Gibco	17504-044	À la première utilisation, décongeler et préparer des aliquots de 1 ml pour une utilisation future ; conserver les aliquots à -20 °C. Garder les suppléments sur de la glace après la décongélation jusqu'à ce qu'ils soient prêts à être ajoutés au milieu
Blasticidin S HCl (10 mg/mL)	Gibco	A1113903	Préparer des aliquots du stock à 10 mg/mL ; placer dans des petits tubes de 200 mL et conserver à -20 °C jusqu'à utilisation.
Albumine sérique bovine (BSA)	Millipore-Sigma	A1470-10G	Utilisée comme 10% BSA poids/volume dans du PBS 1x. La BSA est collante ; veillez à la peser correctement et à ajouter un volume approprié de diluant pour obtenir la solution exacte.
Filtre cellulaire (40 µm)	Midsci	40ICS	Prédésinfecté et emballé individuellement. Doit être ouvert à l'intérieur de la hotte de sécurité biologique. Ne pas toucher avec les mains nues
D-Luciférine, sel de potassium	Gold Biotechnology	eLUCK-100	Préparer une solution de travail à 15 mg/mL (diluée dans de l'eau de qualité moléculaire) et filtrer de manière stérile avant utilisation. Préparer un stock frais à chaque fois et ajouter directement au milieu pour atteindre une concentration de travail finale de 150 mg/mL (par exemple, 5 mL de solution de travail par 500 mL de culture)
DMEM, à faible teneur en glucose	Gibco	11885-084	Utilisé pour préparer le milieu de base NSC
Facteur de croissance épidermique (EGF)	Corning	354001	Fourni sous forme de poudre lyophilisée stérile ; pour reconstituer le stock 1000X, ajouter 4,95 mL de PBS et 50 µL de 10% BSA (dans du PBS 1x) à 100 µg de poudre EGF lyophilisée, et pipeter pour combiner.  Préparer des aliquots de 500 µL ou plus petits dans de petits tubes et conserver à -20° C jusqu'à utilisation pour le milieu NSC complet et le supplément d'alimentation NSC. Éviter les décongélations répétées.
Facteur de croissance des fibroblastes, basique (FGF)	R&D systems	233-FB	Fourni sous forme de poudre lyophilisée stérile ; pour reconstituer le stock 1000X, ajouter 1,24 mL de PBS et 12,5  µL de 10% BSA (dans du PBS 1x) à 25 µg de poudre FGF lyophilisée, et pipeter pour combiner.  Préparer des aliquots de 500 µL ou plus petits dans de petits tubes et conserver à -20° C jusqu'à utilisation pour le milieu NSC complet et le supplément d'alimentation NSC. Éviter les décongélations répétées.
Glucose, 45%	Corning	25-037-CI	Fourni sous forme de solution stérile. Ne pas ouvrir en dehors de la hotte de sécurité biologique
Anticorps monoclonal de lapin HA-Tag (C29F4)	Cell Signal Technology	3724	Utilisé à une dilution de 1: 1000 dans 3 % d'albumine sérique bovine (Western blotting, pour vérifier l'expression de l'étiquette HA)
HBSS, 10x	Gibco	14185-052	Fourni sous forme de solution stérile. Ne pas ouvrir en dehors de la hotte de sécurité biologique
HEPES, 1 M	Corning	25-060-CI	Fourni sous forme de solution stérile. Ne pas ouvrir en dehors de la hotte de sécurité biologique
IVIS 50	PerkinElmer		L'instrument doit être allumé 30 min avant utilisation pour permettre au caméra de refroidir à une température optimale. Le logiciel Living Image (version 4.3.1) est utilisé pour la quantification.
Lentivirus-Luciférase (Firefly)-2A-RFP	AMSBio	LVP324-PBS	LVP doit être réparti en aliquots et conservé au réfrigérateur à -80 °C
L-Glutamine, 200 mM	Corning	25-005-CI	Fourni sous forme de solution stérile. Ne pas ouvrir en dehors de la hotte de sécurité biologique
Eau de qualité moléculaire	Corning	46-000-CM	Fourni sous forme de solution stérile. Ne pas ouvrir en dehors de la hotte de sécurité biologique
Supplément N-2 (100x)	Gibco	17502-048	À la première utilisation, décongeler et préparer des aliquots de 1 ml pour une utilisation future ; conserver les aliquots à -20 °C. Garder les suppléments sur de la glace après la décongélation jusqu'à ce qu'ils soient prêts à être ajoutés au milieu
Anticorps monoclonal de lapin Nestin (E5C7I)	Cell Signal Technology	89529	Utilisé à une dilution de 1: 1000 dans 3 % d'albumine sérique bovine (Western blotting, pour vérifier l'expression du marqueur NSC)
Milieu Neurobasal	Gibco	21103-049	Utilisé pour préparer le milieu de base NSC
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)	Gibco	15140-122	Fourni sous forme de solution stérile ; répartir en aliquots et conserver à -20°C jusqu'à utilisation.
Tampon phosphate, 1x (PBS)	Corning	MT21040CV	Fourni sous forme de solution stérile. Ne pas ouvrir en dehors de la hotte de sécurité biologique
Inhibiteur de protéase/phosphatase	Cell Signal Technology	5872S	Doit être conservé à -20 °C
Dihydrochlorure de puromycine	Gibco	A1113803	Préparer des aliquots du stock à 10mg/ml ; placer dans des petits tubes de 200