Identification des candidats potentiels contre la tuberculose : guide étape par étape pour la synthèse, la détermination de la CMI et l’évaluation de la cytotoxicité chez les cellules de mammifères

Résumé

Ici, nous présentons un protocole permettant d’identifier les candidats potentiels à la tuberculose par dépistage phénotypique, englobant la synthèse chimique d’un composé de 4-aminoquinoline, la détermination de sa concentration inhibitrice minimale contre Mycobacterium tuberculosis, et l’évaluation de sa cytotoxicité dans les lignées cellulaires de mammifères.

Résumé

La tuberculose (TB) reste l’une des principales causes de décès dus à un seul agent infectieux dans le monde, avec une augmentation des taux de résistance aux médicaments qui fait du développement de nouveaux agents thérapeutiques une priorité mondiale pour la santé. Ce protocole décrit une approche phénotypique de dépistage permettant d’identifier les candidats médicament anti-tuberculeux potentiels à travers trois étapes intégrées. Tout d’abord, un composé de la classe des 4-aminoquinolines est synthétisé par une voie en trois étapes et entièrement caractérisé par la chromatographie liquide haute performance (HPLC), la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) et la spectrométrie de masse à haute résolution (HRMS). Deuxièmement, l’activité antimicrobienne du composé est évaluée contre Mycobacterium tuberculosis à l’aide du test de microplaque de réduction colorimétrique de la resazurine (REMA), qui détermine la concentration inhibitrice minimale (CMI) grâce à une simple lecture visuelle de changement de couleur. Troisièmement, la cytotoxicité du composé est évaluée dans deux lignées cellulaires de mammifères, Vero (rein du singe vert africain) et HepG2 (carcinome hépatocellulaire humain), à l’aide du test MTT (bromure 3-[4,5-diméthylthiazol-2-yl]-2,5-diphényl tétragolium) et du test d’absorption rouge neutre (NRU). Ces deux tests complémentaires mesurent des paramètres cellulaires distincts, permettant la validation croisée des résultats de cytotoxicité. Ensemble, les données de CMI et de cytotoxicité permettent de calculer un indice de sélectivité (SI) pour évaluer le potentiel thérapeutique de chaque composé. Ce protocole fournit un cadre reproductible, étape par étape, pour l’identification précoce des résultats anti-tuberculeux et l’évaluation préclinique.

Introduction

Principalement causée par le bacille Mycobacterium tuberculosis (Mtb), la tuberculose (TB) est une maladie respiratoire infectieuse chez l’humain qui vise principalement les poumons, bien que des variantes extrapulmonaires puissent également apparaître. La tuberculose se transmet par des bacilles de MTB aéroportés libérés par les personnes atteintes de la maladie^{active 1}. Selon la progression de la maladie, une personne infectée par la tuberculose peut immédiatement contracter une tuberculose active. Cependant, en général, un individu nouvellement infecté développera une tuberculose latente, où les cellules Mtb à faible activité métabolique survivent à l’intérieur des^{granulomes 1,2}. Une personne atteinte de tuberculose latente peut finalement développer la forme active de la maladie, manifestant des symptômes^{cliniques 3}. Actuellement, on estime qu’un quart de la population mondiale est infectée par la tuberculose^{latente 4}.

Malgré de nombreux progrès, la tuberculose reste un problème sérieux de santé publique dans le monde entier. Les données du plus récent Rapport mondial sur la tuberculose montrent que 10,7 millions de personnes ont développé la maladie en 2024. Au cours de la même année, 1,23 million de décès dus à la tuberculose ont été enregistrés dans le monde, faisant de la tuberculose la principale cause de décès par un seul agent^{infectieux 5}. Outre la pathologie et la biologie complexe du MTB, des aspects socio-économiques tels que la pauvreté et la malnutrition, ainsi que des facteurs liés à la santé tels que le tabagisme, le diabète et la co-infection par le VIH, rendent le contrôle des maladies encore plus^{difficile 5}. Cela contribue à la permanence de longue date de la tuberculose en tant que problème de santé mondiale.

De plus, les traitements actuels contre la tuberculose présentent des limites qui compliquent la lutte contre la maladie. Contre les souches sensibles de Mtb, le traitement standard consiste en une thérapie combinée de 4 médicaments : isoniazide (INH), rifampicine (RIF), éthambutol (EMB) et pyrazinamide (PZA). Ces antibiotiques sont administrés pendant un minimum de 6 mois, nécessitant une adhésion stricte tout au long du traitement. Ce traitement thérapeutique, bien qu’efficace dans la plupart des cas et avec un taux de réussite d’environ 85 %, rencontre encore de nombreux défis ^5,6. Parmi les plus gros problèmes figurent les effets secondaires et la durée prolongée, qui conduisent souvent à une interruption prématurée par le patient. Cette interruption, combinée à une mauvaise administration des antibiotiques, favorise le choix de souches de MTB résistantes, qui nécessitent des traitements plus toxiques, coûteux et plus^{étendus 7,8}.

Compte tenu de ce scénario, le développement de nouveaux médicaments anti-tuberculeux puissants est urgent. Ce protocole décrit les premières étapes de la recherche sur de nouveaux candidats médicaments à l’aide du dépistage phénotypique. Pour illustrer l’application de ce protocole, nous avons sélectionné un composé 4-aminoquinoline dérivé de LABIO-17 pour évaluation. LABIO-17 avait été identifié auparavant par notre groupe de recherche comme un inhibiteur de l’enzyme énnoyl-ACP-réductase (InhA) dans le Mtb, qui est la même cible moléculaire que l’isoniazide (INH^)9,10. L’InhA est impliqué dans la biosynthèse de l’acide mycolique chez M. tuberculosis et est essentiel à la survie du bacille, soulignant sa pertinence en tant que cible moléculaire^{prometteuse 11}

Protocole

1. Synthèse chimique et caractérisation

REMARQUE : La synthèse et la caractérisation du composé chimique sont effectuées comme décrit^{précédemment 10}. Toutes les étapes de 1.1 à 1.4 doivent être effectuées dans une hotte bien ventilée à l’aide de gants en nitrile.

1. Préparation des réactifs
   1. Préparation de MeOH/CH₃CN (1:1) avec 0,1 % d’acide formique
      1. Mesurez des volumes égaux de méthanol (MeOH) et d’acétonitrile (CH₃CN) pour préparer un mélange 1:1 (v/v) (grade HPLC).
      2. Mélangez les solvants dans un récipient propre et sec (par exemple, une fiole volumétrique). Ajoutez de l’acide formique pour obtenir une concentration finale de 0,1 % (v/v) (par exemple, ajoutez 1 mL d’acide formique à 1 L de mélange de solvant).
      3. Mélangez soigneusement en faisant doucement tourner ou en remuant. Conservez dans un récipient bien fermé à température ambiante, à l’abri de la lumière.
   2. Préparation d’acide acétique à 1 % (v/v) dans de l’eau ultrapure
      1. Rincez la fiole volumique avec de l’eau ultrapure, puis posez-la sur le banc. Ajoutez ~80 % du volume final d’eau ultrapure à la fiole (c’est-à-dire 80 mL pour une fiole de 100 mL ; 800 mL pour une fiole de 1 L).
      2. À l’aide d’une pipette calibrée, ajoutez de l’acide acétique glaciaire pour obtenir 1 % (v/v) : pour un volume final de 100 mL → ajoutez 1,0 mL d’acide acétique ; pour un volume final de 1 L, → ajouter 10,0 mL d’acide acétique.
      3. Mélangez soigneusement en faisant tourner ou en remuant. Remplissez la fiole jusqu’à la marque finale avec de l’eau ultrapure et mélangez.
      4. Dégazez la solution par sonication à l’aide d’un nettoyeur ultrasonique (fréquence du réservoir ~40 kHz) réglé en mode dégazage pendant 20 minutes à température ambiante.
      5. Transférez dans une bouteille ambrée étiquetée (étiquette : contenu, concentration, solvant, date, préparateur). Conservez bien fermé à température ambiante.
   3. Préparation de l’acétonitrile : méthanol (1:1, v/v), grade HPLC
      1. Mesurer des volumes égaux d’acétonitrile et de méthanol : pour un volume final de 100 mL → 50,0 mL d’acétonitrile + 50,0 mL de méthanol ; pour 1 L, volume final → 500 mL d’acétonitrule + 500 mL de méthanol.
      2. Mélangez les solvants dans une fiole ou une bouteille volumétrique propre et mélangez par inversion ou en remuant. Filtrez le mélange à travers un filtre de 0,45 μm dans un récipient propre pour éliminer les particules.
      3. Dégazez la solution par sonication à l’aide d’un nettoyeur ultrasonique (fréquence du réservoir ~40 kHz) réglé en mode dégazage pendant 20 minutes à température ambiante.
      4. Transférez dans une bouteille ambrée marquée (étiquette : composition, qualité solvant, date, préparateur). Conservez bien fermé à température ambiante, à l’abri de la chaleur et de la lumière.
   4. Préparation de solution d’Hexane/Acétate d’Éthyle 7:3 (v/v) pour la chromatographie en colonne
      1. Mesurez 70 % du volume final en hexane. Exemple : pour un volume final de 100 mL → 70 mL d’hexane.
      2. Mesurez 30 % du volume final dans l’acétate d’éthyle. Exemple : pour un volume final de 100 mL → 30 mL d’acétate d’éthyle.
      3. Mélangez les deux solvants dans un récipient propre et sec (par exemple, flasque volumétrique ou bouteille).
      4. Mélangez soigneusement en inversant ou en remuant jusqu’à ce que ce soit homogène. Étiquetez le contenant avec la composition, la date, le grade solvant et le préparateur.
   5. Préparation de solution 1:1 (v/v) d’hexane/acétate d’éthyle pour la chromatographie en colonne
      1. Mesurez 50 % du volume final en hexane. Exemple : pour un volume final de 100 mL → 50 mL d’hexane.
      2. Mesurez 50 % du volume final dans l’acétate d’éthyle. Exemple : pour un volume final de 100 mL → 50 mL d’acétate d’éthyle.
      3. Mélangez les deux solvants dans un récipient propre et sec (par exemple, flasque volumétrique ou bouteille). Mélangez soigneusement en inversant ou en remuant jusqu’à ce que ce soit homogène.
      4. Étiquetez le contenant avec la composition, la date, le grade solvant et le préparateur.
   6. Préparation d’une solution de bicarbonate saturé de sodium (NaHCO₃)
      1. Pèser une quantité excessive de bicarbonate de sodium (NaHCO₃) (environ 15 à 20 g pour chaque 100 mL d’eau).
      2. Ajoutez le bicarbonate de sodium à un bécher propre contenant un volume connu d’eau distillée (par exemple, 100 mL). Remuez le mélange en continu à température ambiante (20–25 °C) à l’aide d’un agitateur magnétique ou d’une tige en verre.
      3. Continuez à remuer jusqu’à ce qu’aucun autre solide ne se dissout et qu’il reste une petite quantité de bicarbonate de sodium non dissous au fond — cela indique que la solution est saturée.
      4. Laissez la suspension reposer pendant 10 à 15 minutes pour laisser le solide non dissous se stabiliser. Filtrez le mélange à travers un filtre en papier ou un entonnoir en verre fritté pour éliminer l’excès de bicarbonate non dissous.
      5. Prélever le filtrat transparent, qui est la solution saturée de bicarbonate de sodium.
      6. Conservez la solution dans un flacon bien fermé, correctement étiqueté avec le nom du composé, la concentration (saturée), la date de préparation et vos initiales.
      7. Gardez la solution à température ambiante et préparez la fraîcheur si nécessaire, car le_CO2 peut s’échapper lentement et modifier la concentration au fil du temps.
2. Synthèse du 6-bromo-2-méthylquinoline-4-ol (3)
   1. Préparez une solution contenant 4-bromoaniline (1,2 g, 7,3 mmol) et du sulfate de magnésium anhydre (1,08 g, 9,0 mmol) dans de l’éthanol (15 mL).
   2. Ajoutez de l’acide acétique glaciaire (0,33 mL) et de l’acésétate d’éthyle (1,8 mL, 14,1 mmol) à la solution. Remuez le mélange de réaction à 90 °C pendant 16 heures.
   3. Filtrez le mélange réactionnel à travers de la cellulose, une conservation de 11 μm, du papier filtre de qualité pour éliminer le sulfate de magnésium en suspension.
   4. Évaporez l’éthanol à l’aide d’un évaporateur rotatif pour obtenir l’intermédiaire acrylate.
   5. Chauffez l’intermédiaire à l’aide d’un bain d’huile approprié contenant un fluide de transfert de chaleur synthétique haute performance (voir Tableau des matériaux) (15 mL) à 230–250 °C pendant 15 minutes pour compléter la réaction.
   6. Refroidissez le mélange à température ambiante. Filtrez le précipité formé et lavez-le avec de l’hexane et du chloroforme.
   7. Concentrez le produit final à pression réduite à l’aide d’un évaporateur rotatif jusqu’à ce que tous les solvants résiduels soient éliminés (voir Tableau des matériaux).
3. Synthèse de 6-bromo-4-chloro-2-méthylquinoline (4)
   1. Préparez une solution de 6-bromo-2-méthylquinoline-4-ol (0,65 g, 2,8 mmol) dans du toluène (10 mL). Ajoutez de l’oxychlorure de phosphore(V) (0,65 mL, 6,9 mmol) à la solution.
   2. Remuez le mélange de réaction à 110 °C pendant 2 heures. Retirez l’excès d’oxychlorure de phosphore(V) à l’aide d’un évaporateur rotatif.
   3. Refroidissez les résidus dans un bain de glace. Neutralisez le mélange réactionnel avec une solution saturée de bicarbonate de sodium.
   4. Extraire le produit avec de l’acétate d’éthyle (3 x 50 mL). Combinez les phases organiques et séchez-les sur du sulfate de sodium anhydre.
   5. Évaporez le solvant à l’aide d’un évaporateur rotatif pour obtenir un résidu solide. Séchez le solide obtenu à l’aide d’un évaporateur rotatif pour obtenir le produit brut.
   6. Purifiez le composé par chromatographie flash sur gel de silice (maillage 35–70) en utilisant l’hexane :acétate d’éthyle (7:3) comme éluent.
4. Synthèse de 6-Bromo-2-méthyl-N-(4-(pipéridin-1-yl)phényl)quinoline-4-amine (6)
   1. Préparez un mélange réactionnel contenant 6-bromo-4-chloro-2-méthylquinoline (0,53 g, 2 mmol), 4-(pipéridin-1-yl)aniline (0,57 g, 3 mmol), pyridine (0,24 mL) et HCl à 37 % (0,2 mL) d’isopropanol (20 mL).
   2. Remuez le mélange de réaction à 85 °C pendant 16 heures. Retirez le solvant à l’aide d’un évaporateur rotatif.
   3. Traitez le résidu avec une solution saturée de bicarbonate de sodium.
   4. Filtrez le solide résultant à travers un papier filtre qualitatif de rétention de 11 μm à cellulose et dissoudrez-le dans du chloroforme (50 mL).
   5. Lavez la solution de chloroforme à l’eau (3 x 15 mL). Sécher la phase organique sur du sulfate de sodium anhydre.
   6. Évaporez le solvant à l’aide d’un évaporateur rotatif pour obtenir un solide vert. Purifiez le produit par des lavages successifs avec de l’hexane chaud (4 x 10 mL).
   7. Effectuer la purification finale par chromatographie flash sur gel de silice (maille 35–70) en utilisant l’hexane :acétate d’éthyle (1:1) comme éluent.
5. Chromatographie en couche mince (TLC)
   1. Suivez l’évolution de la réaction à l’aide de chromatographie en couche fine (TLC) sur des plaques de gel de silice TLC 60 F254.
   2. Utilisez le matériau de départ 4 comme référence pour surveiller la réaction et évaluer sa consommation.
6. Point de fusion (m.p.)
   1. Ajoutez une pointe spatule du composé à l’appareil de point de fusion. Notez la plage du point de fusion.
   2. N’appliquez aucune correction aux valeurs mesurées. Réalisez l’expérience en triple exemplaire.
7. Chromatographie liquide haute performance (HPLC)
   1. Pèser 1 à 2 mg de composé 6. Préparez une solution d’origine du composé à 1,0 mg/mL dans de l’acétonitrile/méthanol (1:1, v/v).
   2. Diluez la solution d’origine à 0,5 mg/mL pour analyse. Analysez les échantillons à l’aide d’un système HPLC (voir Tableau des matériaux) équipé d’une double pompe, d’un injecteur automatique et d’un détecteur UV.
   3. Acquérir et traiter les données à l’aide d’un logiciel d’acquisition de données chromatographiques (voir Tableau des matériaux).
   4. Définir les conditions chromatographiques comme suit : utiliser une colonne C18 à phase inverse, 5 μm (250 x 4,6 mm) (voir Tableau des matériaux). Réglez le débit à 1,5 mL/min et surveillez la détection UV à 254 nm. Maintenir la phase mobile à 100 % d’eau (0,1 % d’acide acétique) de 0 à 7 minutes ; appliquer un gradient linéaire de 100 % d’eau (0,1 % acide acétique) à 90 % d’acétonitrile/méthanol (1:1, v/v) de 7 à 15 minutes ; Revenez à 100 % d’eau (0,1 % acide acétique) pendant 5 minutes et maintenez encore 10 minutes.
8. Résonance magnétique nucléaire (¹H, ¹³C)
   1. Pèse 15 à 20 mg de composé 6 dans un tube RMN. Ajoutez_{DMSO-d 6} comme solvant.
   2. Acquérir des spectres RMN ^{de 1}H et ¹³C sur un spectromètre RMN (voir Tableau des matériaux) en utilisant des séquences d’impulsions standard.
   3. Faites fonctionner l’instrument à 400 ^{MHz pour 1}noyau H et à 100 MHz pour ¹³noyaux C. Utilisez le tétraméthylsilane (TMS) comme référence interne.
   4. Exprimer les décalages chimiques (δ) en parties par million (ppm). Utilisez le fichier FID obtenu lors de l’expérience pour visualiser et traiter les données RMN.
9. Spectrométrie de masse haute résolution (SGRH)
   1. Pèser 1 à 2 mg de composé 6. Préparez l’échantillon dans un mélange 1:1 de MeOH/CH₃CN contenant 0,1 % d’acide formique.
   2. Effectuer l’analyse avec un spectromètre de masse Orbitrap haute résolution (voir Tableau des matériaux), qui combine un spectromètre de masse linéaire à piège ionique avec un analyseur de masse Orbitrap.
   3. Introduisez l’échantillon par infusion directe à un débit de 10 μL/min en mode ion positif en utilisant l’ionisation par électropulvérisation (ESI).
   4. Déterminez la composition élémentaire à l’aide de l’outil de composition élémentaire dans le logiciel d’analyse des données de spectrométrie de masse (voir Tableau des matériaux).
10. Cromatographie en colonne – Composé 4
    1. Préparez une colonne de gel de silice à l’aide de gel de silice de 60 Å (maille 70–230, 0,063–0,200 mm). Remplissez la colonne de façon appropriée avec le gel de silice.
    2. Utilisez l’hexane/acétate d’éthyle (7:3, v/v) comme phase mobile. Chargez le composé brut 4 sur la colonne. Éluez le composé et collectez les fractions.
    3. Surveillez les fractions par TLC et combinez celles contenant le produit pur.
11. Chromatographie en colonne – Composé 6
    1. Préparez une colonne de gel de silice à l’aide de gel de silice de 60 Å (maille 70–230, 0,063–0,200 mm). Remplissez la colonne de façon appropriée avec le gel de silice.
    2. Utilisez l’hexane/acétate d’éthyle (1:1, v/v) comme phase mobile. Chargez le composé brut 6 sur la colonne. Éluez le composé et collectez les fractions.
    3. Surveillez les fractions par TLC et combinez celles contenant le produit pur.

Figure 1. Réactifs et conditions : i = MgSO₄, AcOH, EtOH, 90 °C, 16 h ; ii = C₁₂H₁₀, C_{12H 10}O, 230-250 °C, 15 min ; iii =_{POCl 3}, Toluène, 110 °C, 2 h ; iv = Pyridine, HCl, (CH₃)₂CHOH, 85 °C, 16 h. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

2. Détermination de la concentration inhibitrice minimale

1. Conception expérimentale et disposition des plaques
   1. Évaluer la capacité des composés à inhiber la croissance de M. tuberculosis à l’aide du test de microplaque de réduction colorimétrique de la resazurine (REMA) pour déterminer la concentration inhibitrice minimale (CMI), comme décrit^{précédemment 11,12,13}.
   2. Réaliser trois expériences indépendantes (trois réplications biologiques) pour chaque composé testé sans réplication technique (une rangée par composé et une plaque par expérience).
   3. Évaluez les composés agissant comme témoins positifs ainsi que comme composés testés afin de garantir que les conditions d’analyse permettent l’inhibition de la croissance.
   4. Analyse de l’isoniazide (INH) et de la rifampicine (RIF) comme témoins positifs.
   5. Attribuer les lignes A et B pour les composés de contrôle (INH et RIF, respectivement).
   6. Attribuez les lignes suivantes pour les composés d’essai (composés A à F dans la Figure 2).
   7. Préparez les colonnes 1 à 10 avec des dilutions en série doubles des composés témoins et tests, chaque composé occupant une ligne, la concentration la plus élevée à la colonne 10 et la plus faible à la colonne 1.
   8. Préparez la colonne 11 comme témoin de viabilité contenant un milieu de croissance et des bactéries à une concentration finale de DMSO de 2,5 %, sans ajout de produit témoin ou de test.
   9. Préparez la colonne 12 comme contrôle de la stérilité en ajoutant des composés de contrôle ou de test à la concentration plus élevée de la dilution en série (identique à la colonne 10) dans un milieu de croissance sans cellules bactériennes.
   10. Voir la Figure 2 pour une disposition représentative d’une plaque MIC.
2. Préparation des réactifs
   1. Préparation du bouillon Middlebrook 7H9 complété d’acide oléique, d’albumine, de dextrose et de catalase (OADC).
      1. Dans une bouteille en verre de 200 mL contenant 90 mL d’eau ultrapure, ajoutez 0,47 g de poudre 7H9, 0,24 mL de glycérol à 85 % et 0,5 mL de 10 % de préadolescents-80.
      2. Autoclave du milieu pendant 10 minutes à 121 °C et 98,07 kPa.
      3. Laissez refroidir le milieu jusqu’à ce qu’il soit chaud au toucher (environ 45–50 °C).
      4. Ajoutez 10 mL d’OADC (nous utilisons l’OADC disponible dans le commerce ; voir le tableau des matériaux pour plus de détails).
      5. Conserver à 4 °C.
         REMARQUE : Préparez la quantité appropriée pour l’expérience, en tenant compte des proportions des réactifs.
   2. Préparation du bouillon Middlebrook 7H9 avec ADC
      1. Dans une bouteille en verre de 200 mL contenant 90 mL d’eau ultrapure, ajoutez 0,47 g de poudre 7H9. Autoclave du milieu pendant 10 minutes à 121 °C et 98,07 kPa.
      2. Laissez refroidir le milieu jusqu’à ce qu’il soit chaud au toucher (environ 45–50 °C). Ajoutez 10 mL d’ADC. Conserver à 4 °C.
         REMARQUE : Préparez la quantité appropriée pour l’expérience, en maintenant les proportions des réactifs.
   3. Préparation de solutions de stocks composés
      1. Préparez une solution de base de chaque composé à 2 mg/mL dissous dans du DMSO.
      2. Conserver à –20 °C.
         REMARQUE : Avant l’expérience, la concentration maximale d’essai est définie sur la base d’une évaluation de solubilité. Pour déterminer la limite de solubilité, inspectez visuellement les solutions à la recherche de cristaux. Si des cristaux sont observés, diluez encore l’aliquote à la moitié de la concentration précédente. Effectuez cette évaluation en utilisant 5 % de DMSO.
   4. Préparation de solutions de travail composé
      REMARQUE : Les solutions de travail doivent être fraîchement préparées au moment de l’expérience en diluant les composés d’origine dans un bouillon 7H9 complété par 10 % d’ADC. La concentration finale de DMSO dans la solution de travail doit être de 5 %, et la concentration du composé doit être deux fois supérieure à la concentration de test la plus élevée prévue. Notamment, la concentration finale de DMSO à laquelle les bactéries sont exposées pendant le test est de 2,5 %, car le volume est doublé après l’ajout de la suspension bactérienne (voir section 2.3, étape 2.3.8).
      REMARQUE : Le DMSO 2,5 % est toléré par les souches bactériennes utilisées dans notre laboratoire (M. tuberculosis , H37Ra, H37Rv et isolats cliniques). Si vous travaillez avec d’autres souches ou espèces bactériennes, réalisez une expérience préliminaire de CMI en utilisant le DMSO comme composé test pour déterminer les concentrations les plus élevées de DMSO pouvant être utilisées sans favoriser l’inhibition de la croissance.
   5. Préparation de la solution de resazurine
      1. Préparez une solution de resazurine à 0,01 % en dissolvant 1 mg de resazurine dans 10 mL d’eau ultrapure.
      2. Stérilisez la solution à l’aide d’un filtre de 0,22 μm.
         REMARQUE : La resazurine stérilisée au filtre peut être conservée à 4 °C pendant 1 semaine¹⁴. Cependant, préparez cette solution immédiatement avant utilisation, conformément à la pratique standard.
3. Préparation des mycobactéries
   1. Inoculez une seule colonie de M. tuberculosis dans un tube centrifuge de 50 mL contenant 10 mL de bouillon 7H9 complétés avec 10 % d’OADC, 0,2 % de glycérol et 0,05 % de préadolescents-80.
   2. Incubez avec un secouement constant (100 tr/min) à 37 °C jusqu’à ce que la culture atteigne une densité optique à 600 nm (OD₆₀₀) de 0,6 à 0,8 (environ 3 à 4 semaines).
      ATTENTION : M. tuberculosis H37Rv est classé comme un agent pathogène du groupe de risque 3, capable de transmission aérienne et de provoquer des maladies potentiellement mortelles chez l’humain. Effectuer toutes les manipulations dans une armoire de biosécurité certifiée au sein d’un laboratoire de biosécurité niveau 3 (BSL-3), en utilisant un équipement de protection individuelle (EPI) approprié.
   3. Homogénéisez la culture bactérienne en faisant un vortex avec des billes de verre stériles (1 mm) pendant 3 minutes.
   4. Laissez la suspension reposer 15 minutes pour que les amas se déposent.
   5. Mesurez le OD₆₀₀ du surnageant et stockez les aliquotes à −80 °C.
      REMARQUE : Pour les expériences, diluez la suspension bactérienne à un OD_{théorique de 600} de 0,006 dans un bouillon 7H9 frais complété par 10 % d’ADC. Distribuez 100 μL par puits dans des plaques à 96 puits pendant l’analyse.
4. Préparation des plaques à 96 puits
   1. Ajoutez 100 μL de bouillon 7H9 complétés par un ADC à 10 % dans la colonne 12.
   2. Ajoutez 100 μL de bouillon 7H9 complété avec un ADC à 10 % (contenant 5 % de DMSO) dans les colonnes 11 et 9 à 1.
   3. Ajoutez 200 μL de la solution composée (préparée à deux fois la concentration d’essai la plus élevée) à la colonne 10 (attribuez une ligne par composé).
   4. Ajoutez 100 μL de la solution composée à la colonne 12. Effectuer une dilution en série double : transférer 100 μL de la colonne 10 à la colonne 9 et bien mélanger par pipetage.
   5. Poursuivez la dilution en série de la colonne 9 à la colonne 1. On défait les derniers 100 μL de la colonne 1.
   6. Ajoutez 100 μL de la suspension bactérienne (OD théorique₆₀₀ de 0,006) aux colonnes 11 à 1.
   7. Couvrez la plaque, scellez avec du parafilm et éclovez à 37 °C pendant 7 jours.
      REMARQUE : La figure 2 est une disposition représentative d’une plaque MIC. Référez-vous à cette figure pour interpréter les étapes 2.3.1 à 2.3.9.
5. Ajout de la Resazurine et de l’analyse des données
   1. Ajoutez 60 μL de solution de resazurine à 0,01 % dans chaque puits de la plaque. Couvrir la plaque, sceller avec du parafilm et incuber à 37 °C pendant 48 heures.
   2. Observez le changement de couleur du bleu (inhibition de la croissance) au rose (croissance bactérienne).
      REMARQUE : Dans certaines expériences, un changement de couleur incomplet donne un puits violet. Interprétez cela comme une croissance bactérienne.

Figure 2. Représentation schématique d’une plaque de microdilution à bouillon utilisée pour déterminer la concentration inhibitrice minimale (CMI). Les dilutions en série en double des composés testés ont été réparties sur les colonnes 1 à 10, les dilutions suivantes sont effectuées séquentiellement de la colonne 10 à la colonne 1, avec la concentration de composé la plus élevée dans la colonne 10. Les lignes A et B correspondent à des contrôles positifs contenant respectivement les médicaments de référence isoniazide et rifampicine. Les rangées C–H correspondent aux composés testés. La colonne 11 représente le contrôle de viabilité (milieu contenant 2,5 % de DMSO et un inocule bactérien), tandis que la colonne 12 correspond au contrôle de la stérilité (milieu contenant les composés en l’absence d’inocule bactérien). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

3. Évaluation de la cytotoxicité dans les lignées cellulaires de mammifères

REMARQUE : Effectuer toutes les manipulations de cultures cellulaires dans des conditions stériles dans un cabinet de sécurité biologique certifié de classe II.

1. Préparation des lignées cellulaires de mammifères
   1. Culture de lignées cellulaires du carcinome hépatique humain (HepG2) et de rein du singe vert africain (Vero) dans le milieu modifié pour aigles (DMEM) de Dulbecco.
   2. Compléter le milieu avec 1,8 g/L de bicarbonate de sodium, 10 % de sérum bovin fœtal (FBS), 1 % de pénicilline/streptomycine et 0,1 % d’amphotéricine B (appelée milieu complet).
   3. Incubez les cultures cellulaires à 37 °C dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO₂.
   4. Prélever les cellules sub-confluentes (70 %–80 %) en les traitant avec une solution de trypsine-EDTA à 0,25 % pendant 5 à 10 minutes.
   5. Neutralisez la trypsine en ajoutant un volume équivalent de milieu complet. Transférez la suspension de la cellule dans un tube conique de 15 mL et centrifugez à 200 x g pendant 5 minutes.
   6. Jetez le surnageant et remettez la pellete cellulaire en suspension dans 10 mL de milieu complet frais.
   7. Déterminez la concentration et la viabilité cellulaires à l’aide d’un compteur cellulaire automatisé ou d’un hémocytomètre avec exclusion du bleu de trypan.
      REMARQUE : Pour l’exclusion du bleu de trypan, mélangez 10 μL de suspension cellulaire avec 10 μL de solution bleue de trypan à 0,4 % et chargez sur l’hémocytomètre (ou la lame de comptage). Les cellules mortes ou compromises par la membrane paraissent bleues, tandis que les cellules viables restent intactes. Calculer la viabilité en % = (cellules non colorées / cellules totales) x 100. Ne procédez au semis que si la viabilité est ≥ 90 %.
   8. Diluez la suspension de la cellule à la densité de semis cible. Semez 100 μL de suspension de cellules dans chaque puits des colonnes 2 à 12 d’une plaque à fond plat de 96 puits.
      Densités d’ensemencement : 4 000 cellules/puits pour les cellules Vero ; 5 000 cellules/puits pour les cellules HepG2.
      REMARQUE : Optimisez ces densités afin de garantir que les cellules restent dans la phase de croissance logarithmique et n’atteignent pas 100 % de confluence avant la limite du test en 48 heures.
   9. Remplir la colonne 1 avec 100 μL de milieu complet (sans cellules) pour servir de blanc pour les mesures d’absorption.
   10. Préparez quatre plaques identiques pour chaque lignée cellulaire : deux pour le test MTT et deux pour le test NRU.
   11. Incubez les plaques pendant 24 heures à 37 °C, 5 % de CO₂ pour permettre l’attachement cellulaire.
2. Dilution des composés et traitement cellulaire
   1. Préparez des solutions d’origine pour chaque composé testé dans le sérum tampon phosphaté (DPBS) de Dulbecco ou un solvant approprié (par exemple, sulfoxyde de diméthyle ; DMSO).
      REMARQUE : Vérifiez que le composé est soluble dans le milieu de culture cellulaire et que la concentration de solvant est non toxique (par exemple, <0,1 % v/v pour le DMSO) avant le test.
   2. Concevez la disposition des plaques pour inclure des éléments blancs, des commandes appropriées et des répliques techniques. Une mise en page représentative pour tester jusqu’à 9 composés sur 8 concentrations est présentée à la Figure 3.
   3. Préparez des dilutions en série du ou des composés d’essai dans un milieu complet pour couvrir la plage de concentration prévue. Assurez-vous que le volume suffisant est préparé pour toutes les plaques répliquées.
      REMARQUE : Si vous utilisez un solvant (par exemple, DMSO), compléter le milieu de dilution afin que la concentration finale de solvant reste constante sur toute la série de dilution en série.
      REMARQUE : Les puits traités au solvant (contrôle du véhicule) servent de contrôle fonctionnel négatif, définissant la viabilité cellulaire à 100 % contre laquelle les puits traités par composés sont normalisés. Pour la validation du test, inclure un composé de référence cytotoxique (par exemple, 0,1 % de Triton X-100 ou 1 mM de dodécyle sulfate de sodium) à une concentration connue pour produire une mort cellulaire complète (0 % de viabilité). Les valeurs d’absorbance dans ces puits témoins positifs ne devraient pas différer significativement de celles des puits blancs, confirmant ainsi une viabilité de 0 %.
   4. Après la période d’attache des cellules de 24 h, inspectez visuellement les plaques au microscope inversé pour confirmer que les cellules sont attachées, dispersées et couvrent environ 70 % à 80 % de la surface du puits par une confluence homogène. Plaques de défausse montrant une contamination ou un attachement insuffisant.
   5. Aspirez soigneusement le milieu de culture à l’aide d’une pointe de pipette, en inclinant la pointe vers le côté de chaque puits pour éviter de perturber la monocouche cellulaire. Traiter les plaques en sections pour éviter la dessiccation.
   6. Ajoutez immédiatement 100 μL des dilutions ou des milieux de contrôle appropriés dans les puits correspondants.
   7. Incubez les plaques traitées pendant 48 heures à 37 °C, 5 % de CO₂.
3. Protocole d’analyse MTT
   1. Préparez une solution de MTT à 0,5 mg/mL dans un DMEM sans sérum. Filtrez à travers un filtre à seringue de 0,22 μm et protégez-le de la lumière.
   2. Après le traitement de 48 heures, inspectez visuellement les cellules pour confirmer les effets thérapeutiques attendus.
   3. Aspirez soigneusement le milieu à partir des plaques MTT. Ajoutez 50 μL de la solution de travail MTT de 0,5 mg/mL dans chaque puits.
   4. Incuber pendant 3 heures à 37 °C, 5 % de CO₂, protégé de la lumière.
      REMARQUE : Bien que 2 à 4 heures soit courant, une incubation de 3 heures est généralement suffisante pour les cellules Vero et HepG2. Optimisez si nécessaire.
   5. Ajoutez 100 μL de DMSO à 100 % dans chaque puits pour dissoudre les cristaux de formazan. Placez les plaques sur un vibrateur orbital à 100 tr/min pendant 15 minutes, protégées de la lumière. Inspectez les puits de contrôle pour garantir la dissolution complète des cristaux. Lisez l’absorbance à 570 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques. Si disponible, fixez une longueur d’onde de référence de 630–690 nm.
4. Protocole d’analyse de captation rouge neutre (NRU)
   1. Préparez une solution neutre rouge (NR) de 40 μg/mL dans du DMEM sans sérum et filtre. Préparez la solution de désorption NR : 1 % (v/v) d’acide acétique glaciaire, 49 % (v/v) d’éthanol et 50 % (v/v) d’eau ultrapure.
      ATTENTION : L’acide acétique glaciaire est corrosif ; Poignée dans une hotte à fumée.
   2. Après le traitement de 48 heures, inspectez visuellement les cellules. Aspirez soigneusement le milieu à partir des plaques NRU.
   3. Ajoutez 100 μL de la solution de travail de 40 μg/mL NR dans chaque puits. Incubez pendant 2 heures à 37 °C, 5 % de CO₂.
      REMARQUE : Une incubation de 2 h suffit pour une absorption maximale de colorants dans ces lignées cellulaires.
   4. Aspirez la solution fonctionnelle NR. Rincez doucement chaque puits une fois avec 150 μL de PBS stérile.
   5. Ajoutez 150 μL de la solution de désorption NR à chaque puits. Placez sur un shaker orbital à 150 tr/min pendant 15 minutes pour extraire le colorant.
   6. Inspectez les puits de contrôle pour garantir une extraction complète du colorant. Lisez l’absorbance à 540 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques.
5. Analyse des données
   1. Effectuez la soustraction de fond en calculant l’absorption moyenne des colonnes vierges et en soustrayant cette valeur de tous les puits.
   2. Effectuer une vérification de la toxicité des solvants en comparant les puits de contrôle des solvants à ceux non traités. Si la viabilité est inférieure à un seuil défini (par exemple, 80 %), considérez la cytotoxicité du solvant.
   3. Calculer le pourcentage de viabilité par rapport aux puits de contrôle des solvants :
      % de viabilité = (absorbance du puits traité / absorbance moyenne du solvant contrôlé) x 100.
   4. Tracez le pourcentage de viabilité (axe des y) par rapport au log₁₀ de la concentration de composé (axe x). Utilisez un modèle de régression non linéaire (dose-réponse sigmoïde, pente variable) pour déterminer le CC₅₀.
   5. Calculez l’Indice de Sélectivité (SI) en divisant CC₅₀ par MIC.

Figure 3. Exemple de conception de plaques pour un test de viabilité cellulaire MTT/NRU, installation précoce de dépistage pour tester la cytotoxicité de jusqu’à 9 composés. (A) Schéma de conception des plaques. La colonne 1 est assignée « vide », sans cellules, et remplie de DPBS ou de support complet. Les colonnes 2 et 12 sont ensemencées de cellules et traitées avec un milieu complet (« contrôle non traité ») ou un milieu complet avec solvant (« contrôle par solvant »). Les colonnes 3 à 11 sont ensemencées de cellules et traitées par des dilutions en série des composés testés, jusqu’à 9 composés avec un réplicatif par concentration testée par composé. (B) Photographies représentatives d’une plaque Vero NRU (ci-dessus) et d’une plaque Vero MTT (ci-dessous) après le traitement de 48 heures et les étapes finales du test. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Résultats

La synthèse a donné le composé cible 6 sous forme de solide vert clair (0,53 g, rendement de 67 %). Le composé présente un point de fusion de 227–229 °C et une pureté UHPLC de 99 % (t_R = 14,11 min) (Figure 4). La structure chimique a été confirmée par spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) et spectrométrie de masse à haute résolution (SRH). Le spectre RMN ^{à 1}H (Figure 5) montrait des signaux correspondant à la moitié pipéridine entre 1,50 et 3,13 ppm. Le groupe méthyle à la position 2 est apparu comme un singlet typique à 2,38 ppm. L’hydrogène à la position 3 apparaissait comme un débardeur à 6,56 ppm. L’anneau phényle affichait deux doublets à 6,97 et 7,17 ppm, avec une constante de couplage de 8,9 Hz. Les hydrogènes aux positions 7 et 8 généraient un multiplet à 7,63–7,75 ppm, tandis que l’hydrogène à la position 5 du noyau quinoline produisait un doublet à 8,59 ppm (J = 2,0 Hz). L’hydrogène aminique a été observé comme un singulet à 8,66 ppm. Le spectre RMN ^{à 13}°C (Figure 6) présentait un signal à 23,81 ppm attribué au groupe méthyle en position 2, tandis que des signaux entre 24,85 et 49,70 ppm correspondaient à la moitié pipéridine. Le carbone à la position 3 était à 100,52 ppm. Les signaux restants en profondeur ont été attribués au noyau de quinoline et aux carbones de l’anneau phénylique. La HRMS a confirmé la formule moléculaire du composé 6, montrant un ion [M+H^]+ à m/z 396,1063 (calcul pour C₂₁H_{23BrN 3} : 396,1070).

Figure 4. Chromatogramme HPLC et spectres UV du composé 6. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 5. ¹Spectres RMN H (400 MHz, DMSO-d6) du composé 6. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 6. ^{Spectres RMN de 13}C (101 MHz, DMSO-d6) du composé 6. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

L’activité inhibitrice du composé contre M. tuberculosis a été évaluée en déterminant la CMI, définie comme la concentration la plus faible d’un composé qui empêche complètement la croissance bactérienne visible. Dans le test REMA, l’absence de changement de couleur (le bleu restant) indique une inhibition de la croissance, tandis qu’un passage au rose indique la croissance bactérienne. L’isoniazide (INH) et la rifampicine (RIF) servaient de contrôles aux drogues. Les résultats sont présentés à la Figure 7. Chaque plaque comprenait un contrôle de croissance (colonne 11, sans médicaments) et un contrôle de stérilité (colonne 12, sans mycobactéries). Les composés ont été dilués en série de la colonne 10 (concentration la plus élevée) à la colonne 1 (concentration la plus basse). Comme montré à la Figure 7, la valeur de CMI pour le composé de la rangée A (isoniazide) est observée dans la colonne 4, tandis que les valeurs de CIM pour les composés des lignes B (rifampicine) et C (composé synthétisé) sont observées dans la colonne 5. Entre nos mains, les valeurs de CMI pour l’INH sont de 0,31 μg/mL pour la déformation H37Rv et 0,16 μg/mL pour H37Ra, tandis que pour le RIF nous obtenons 0,08 μg/mL pour H37Rv et 0,01 μg/mL pour la déformation H37Ra.

Figure 7. Détermination de la concentration inhibitrice minimale (CMI) dans Mycobacterium tuberculosis à l’aide du test de microplaques de resazurine (REMA). Lignes A–C, colonnes 1–10 : dilutions en série doubles de l’isoniazide (ligne A), de la rifampicine (ligne B) et du composé synthétisé (ligne C). Colonne 11 : Contrôle de viabilité (milieu contenant 2,5 % de DMSO + bactéries). Colonne 12 : Contrôle de la stérilité (milieu + composé). Une couleur bleue indique l’inhibition de la croissance bactérienne, tandis qu’une couleur rose indique la viabilité bactérienne due à la réduction de la resazurine en résorufine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Une plaque représentative à 96 puits pour les tests NRU (Vero, en haut) et MTT (Vero, en bas) est représentée à la Figure 3B. Dans la plaque MTT, un dégradé de couleur clair est visible, passant du translucide (pas de cellules viables) à de fortes concentrations composées à un violet profond (haute viabilité cellulaire) à de faibles concentrations. De même, la plaque NRU présente un gradient du translucide au rose profond, indiquant l’absorption du colorant rouge neutre dans les lysosomes des cellules viables.

La microscopie fournit une confirmation visuelle de l’état du test après le temps d’incubation de 48 h (Figure 8). La figure 8A compare les cellules témoins saines et non traitées (Vero et HepG2) avec celles traitées avec une concentration cytotoxique du composé. Les cellules traitées apparaissent arrondies, détachées et non viables. La figure 8B fournit un point de contrôle visuel critique avant l’étape finale de solubilisation. Il montre la formation attendue de cristaux de formazan violet foncé à l’intérieur des cellules viables (test MTT) et l’accumulation de colorant rouge dans les lysosomes (test NRU) dans les deux types cellulaires.

Les données brutes d’absorbance ont été normalisées au contrôle du véhicule et analysées par régression non linéaire afin de générer des courbes dose-réponse comme détaillé à l’étape 3.5 du protocole. Pour le composé cible 6 (dérivé de LABIO-17), cette analyse a donné un CC₅₀ de 12,2 μM (Vero) et 18,3 μM (HepG2) dans le test NRU, ainsi qu’un CC₅₀ >20 μM pour les deux lignées cellulaires du test MTT. Cela a donné un indice de sélectivité (IS) allant de 30,5 à >50, comme indiqué^{précédemment 10}.

Figure 8. Images microscopiques représentatives des tests de cytotoxicité dans les cellules Vero et HepG2. Toutes les images ont été prises à un grossissement de 100x. (A) Comparaison de la morphologie cellulaire après 48 heures de traitement. Les puits de contrôle non traités pour les cellules Vero (en haut) et HepG2 (en bas) montrent une monocouche saine et confluente. En revanche, les cellules traitées avec une concentration cytotoxique d’un composé apparaissent arrondies, rétrécies et détachées de la surface de la plaque. (B) Points de contrôle visuels critiques après l’ajout du réactif et avant la solubilisation. Dans le test MTT (panneaux de gauche pour chaque lignée cellulaire), les cellules viables contiennent des cristaux de formazan violet foncé visibles. Dans le test NRU (panneaux droits pour chaque lignée cellulaire), les cellules viables présentent une accumulation de colorant rouge dans les lysosomes intacts. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Discussion

Une approche phénotypique de dépistage, qui repose sur l’activité des cellules entières plutôt que sur des enzymes isolées, est une stratégie efficace pour identifier les composés actifs contre M. tuberculosis. Nous avons ici décrit les premières étapes de cette approche, incluant la synthèse chimique d’un composé candidat, l’évaluation de son activité inhibitrice via la détermination de la concentration inhibitrice minimale (CMI), ainsi que l’évaluation de sa cytotoxicité dans les cellules de mammifères (Vero et HepG2) à l’aide des tests MTT et NRU.

La voie synthétique se composait de trois étapes principales (Figure 1), qui fournissent le composé cible en haute pureté grâce à des transformations opérationnellement simples. Plusieurs étapes critiques ont été identifiées comme déterminant la reproductibilité et l’efficacité. La condensation initiale nécessite un contrôle stœchiométrique précis et un reflux soutenu pour assurer une formation intermédiaire complète. Un retrait incomplet du solvant avant la cyclisation thermique peut affecter négativement l’efficacité de la fermeture du cycle. L’étape de cyclisation elle-même exige un contrôle strict de la température, car un chauffage insuffisant entraîne une aromatisation incomplète, tandis qu’un chauffage excessif ou prolongé peut favoriser la formation de sous-produits. Pendant la chloration, un contrôle attentif de la température de réaction et l’ajout progressif de chlorure de phosphoryle sont recommandés afin de minimiser les réactions secondaires et d’assurer une activation sélective à la position 4. Lors de l’optimisation de la méthode, de petits ajustements procéduraux amélioraient la robustesse. En cas de précipitations incomplètes après cyclisation, le refroidissement progressif plutôt que la trempe rapide a favorisé la récupération des solides. Si des rendements réduits ont été observés à l’étape de substitution nucléophile, prolonger le temps de réaction ou vérifier la pureté des amines s’est avéré bénéfique.

Les principales limites de la méthode sont la nécessité de la cyclisation à haute température et des réactifs chlorants corrosifs comme le chlorure de phosphore, nécessitant une infrastructure de laboratoire spécifique et une sécurité spécifique. Les effets électroniques substituants peuvent nécessiter une ré-optimisation pour différentes anilines ou amines, limitant ainsi une large diversification de l’échafaudage sans adaptation. Cependant, l’approche Conrad–Limpach est opérationnellement plus simple que les synthèses de type Skraup (oxydants agressifs) ou les protocoles catalysés par métaux de transition (catalyseurs spécialisés/atmosphères inertes). Cette stratégie sans métaux permet efficacement d’obtenir des intermédiaires de quinoline fonctionnalisés pour la chimie médicinale.

Le protocole utilisé pour déterminer la CIM est un test colorimétrique qui repose sur une inspection visuelle. Un défi potentiel avec cette méthode est un changement de couleur incomplet, qui aboutit à un puits violet au lieu d’un bleu distinct (inhibition) ou rose (croissance). Si cela se produit, cela doit être interprété comme un échec à inhiber la croissance des mycobactéries. De plus, lorsque le composé est évalué par dilution sérieuse, la concentration maximale testable est dictée par la solubilité du composé. En conséquence, dans certains cas, le résultat peut être non concluant si aucune inhibition n’est observée à la concentration soluble maximale. De plus, il est important de reconnaître que d’autres laboratoires peuvent adapter certaines étapes du protocole à leurs conditions spécifiques, ce qui peut entraîner des variations dans les résultats obtenus. Pour augmenter le débit, ce protocole peut être adapté à l’automatisation. La mise en œuvre de systèmes de manipulation des liquides pour la préparation des plaques à 96 puits réduirait les erreurs de pipetage, améliorant ainsi la précision et la reproductibilité.

Le protocole d’évaluation de la cytotoxicité utilise deux lignées cellulaires de mammifères distinctes (Vero et HepG2) et deux tests de viabilité complémentaires (MTT et NRU). Plusieurs étapes de ce protocole sont cruciales pour garantir la reproductibilité et la précision des données, et chaque laboratoire doit effectuer sa propre validation. Par exemple, la densité initiale d’ensemencement cellulaire doit être soigneusement optimisée, car la surconfluence peut entraîner une inhibition du contact et des états métaboliques modifiés, confondant les résultats, tandis qu’une sous-semis peut rendre les cellules plus vulnérables à des insultes mineures, surestimant potentiellement la^{toxicité 15}. De plus, la concentration la plus élevée testée est souvent limitée par la solubilité du composé, et les précipitations peuvent conduire à des résultats inexacts. De plus, la disposition suggérée des plaques (Figure 3A) est conçue pour le criblage primaire, maximisant le nombre de composés testés en évitant les réplications techniques et en ignorant les effets de contour au profit d’une validation par des réplications biologiques indépendantes.

Une force clé de ce protocole est la mise en œuvre parallèle des tests MTT et NRU. Bien que les deux soient bien établis, ils mesurent des paramètres cellulaires différents. Le test MTT quantifie l’activité métabolique des déshydrogénases mitochondriales, ce qui est généralement corrélé à la viabilité cellulaire¹⁶. Cependant, ce test est susceptible d’être interféré par des composés aux propriétés réductrices ou oxydantes, ou par ceux qui perturbent la respiration mitochondriale, conduisant à des résultats potentiellement faux¹⁵. Effectuer le test NRU en parallèle aide à dépanner de tels artefacts. Le test NRU mesure la capacité des cellules viables à maintenir l’intégrité lysosomale et les gradients de pH nécessaires à l’absorption du^{colorant 17}. Les divergences entre les résultats de la MTT et de la NRU peuvent révéler des mécanismes spécifiques de toxicité, tels que des dysfonctions mitochondriales, nécessitant une investigation plus approfondie.

En résumé, ce protocole décrit les étapes fondamentales pour identifier les candidats médicament antituberculeux potentiels. Les composés démontrant une sélectivité et une puissance prometteuses peuvent ensuite être développés vers des modèles d’infection plus complexes, tels que les études in vivo .

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
LIGNEES CELLULAIRES
HepG2 (carcinome hépatocellulaire humain)	ATCC	HB-8065	Ligne cellulaire de carcinome hépatique humain
Mycobacterium tuberculosis H37Ra	ATCC	25177
Mycobacterium tuberculosis H37Rv	ATCC	27294
Vero (rein de singe vert africain)	ATCC	CCL-81	Ligne cellulaire épithéliale de rein de primate
PRODUITS CHIMIQUES – SYNTHÈSE
4-(Piperidin-1-yl)aniline	Sigma-Aldrich	TCI: P0887	Amine précurseur du composé 5/6
4-Bromoaniline	Sigma-Aldrich	108-67-8	Matière première pour la synthèse de la quinoléine
Acide acétique (glaciaire)	Sigma-Aldrich	695092	Réactif dans la synthèse et la préparation de la phase mobile
Acétonitrile (grade HPLC)	Sigma-Aldrich	34967	Composant de la phase mobile HPLC et solvant NMR
Chloroforme	Sigma-Aldrich	C2432	Solvant pour l'extraction du produit
DMSO-d6 (deutérié)	Sigma-Aldrich	175641	Solvant NMR
Dowtherm A (fluide caloporteur)	Sigma-Aldrich / Solutia	TBD	Solvant à point d'ébullition élevé pour la cyclisation thermique (230–250 °C); autrefois listé comme Dowtherm® A
Ethanol (absolu)	Sigma-Aldrich	459836	Solvant de réaction pour l'étape Conrad–Limpach
Acétate d'éthyle (grade HPLC)	Sigma-Aldrich	270989	Composant de l'éluant de la colonne
Acétate d'éthyle	Sigma-Aldrich	E12806	Réactif β-cétoester pour la formation du noyau quinoléine
Acide formique (grade HPLC)	Sigma-Aldrich	F0507	Additif à 0,1% dans la phase mobile pour HPLC et HRMS
Billes de verre (1 mm, stériles)	Sigma-Aldrich	G8772	Pour l'homogénéisation de la culture de M. tuberculosis
HCl (acide chlorhydrique, 37%)	Sigma-Aldrich	320331	Catalyseur acide dans la substitution nucléophile
Hexane (grade HPLC)	Sigma-Aldrich	34859	Éluant non polaire pour la chromatographie sur colonne
Isopropanol	Sigma-Aldrich	278475	Solvant de réaction pour la synthèse du composé 6
Sulfate de magnésium (MgSO4, anhydre)	Sigma-Aldrich	M7506	Agent de séchage et catalyseur de réaction
Méthanol (grade HPLC)	Sigma-Aldrich	34860	Phase mobile HPLC et composant de solvant NMR
Oxychlorure de phosphore(V) (POCl3)	Sigma-Aldrich	201170	Réactif de chloration pour l'intermédiaire 4
Pyridine	Sigma-Aldrich	270970	Catalyseur basique dans la substitution nucléophile
Gel de silice (35–70 mesh) pour la chromatographie flash	Macherey-Nagel	815349	Phase stationnaire pour les étapes de chromatographie flash
Gel de silice 60 Å (70–230 mesh) pour la chromatographie sur colonne	Macherey-Nagel	815381	Phase stationnaire pour la chromatographie sur colonne
Sulfate de sodium (Na2SO4, anhydre)	Sigma-Aldrich	239313	Agent de séchage pour la phase organique
Plaque de gel de silice TLC 60 F254	Merck	1.05554	Surveillance par chromatographie sur couche mince
Toluène	Sigma-Aldrich	244511	Solvant pour l'étape de chloration
Eau ultrapure	Millipore / équivalent	N/A	Utilisée dans la préparation de la phase mobile; autrefois référencée comme eau Milli-Q dans le texte
ÉQUIPEMENT & INSTRUMENTS
Filtre à seringue de 0,22 µm	Millipore / n'importe quel	SLGP033RS	Stérilisation de la solution de résazurin (2.1.4); filtration de la solution de travail MTT (3.3); filtration de la solution de travail de Neutral Red (3.4)
Filtre à seringue de 0,45 µm	Millipore / n'importe quel	SLHA033SS	Filtration des solutions de phase mobile
Tube conique de 15 mL (stérile)	Falcon / n'importe quel	352097 ou équivalent	Collecte et centrifugation de la suspension cellulaire après trypsinisation
Plaque de 96 puits (fond plat, traité pour la culture cellulaire)	Corning / n'importe quel	3596	Pour les tests de cytotoxicité et de CMI
Papier aluminium	N'importe quel	—	Protection contre la lumière des plaques pendant les étapes d'incubation et d'agitation MTT et NRU
Autoclave	N'importe quel	—	Stérilisation des milieux (121 °C, 98,07 kPa, 10 min)
Cabine de sécurité biologique (Classe II, certifiée)	N'importe quel (certifié BSL-3)	—	Requis pour les manipulations de M. tuberculosis (BSL-3)
Compteur de cellules (automatisé) ou hématimètre	Par exemple, Bio-Rad TC20 / Neubauer	TBD	Pour la détermination de la concentration cellulaire et de la viabilité
Centrifugeuse (capable de 200 × g)	N'importe quel	—	Étape de pelletage cellulaire
Incubateur CO2 (37 °C, 5% CO2, humidifié)	N'importe quel	—	Incubation de la culture cellulaire et du traitement
Manchon chauffant	Fisotom	12M	Manchon chauffant à température contrôlée avec Dowtherm® A
Système HPLC (Dionex UltiMate 3000)	Thermo Fisher Scientific	5035.9200	Double pompe, injecteur automatique, détecteur UV; pour l'analyse de pureté du composé 6
Microscope inversé (ou équivalent)