Évaluation de croissance non détectable basée sur la culture et profilage antioxydant de l’extrait frais de gel d’aloès vera

Résumé

Ce protocole décrit la préparation aseptique d’extrait frais d’Aloe vera en gel interne, la mesure potentiométrique du pH, l’évaluation totale de la capacité antioxydante par un test colorimétrique automatisé basé sur ABTS, une évaluation de croissance non détectable basée sur culture dans des conditions d’incubation définies, et un dépistage antimicrobien préliminaire d’un 70:30 (v/v) d’Aloe vera.Mélange test de N-acétyl-L-cystéine par diffusion de disque et dilution qualitative en tube double.

Résumé

L’aloe vera (Aloe barbadensis Miller) est largement utilisée dans les produits de médecine topiques et complémentaires. Cependant, les flux de travail standardisés en laboratoire pour l’évaluation simultanée de la capacité totale d’antioxydants (TAC), le comportement du pH, le statut de croissance non détectable en culture dans des conditions définies, et le dépistage antimicrobien préliminaire restent limités. Un extrait frais d’aloès en gel intérieur a été préparé aseptiquement et formulé à 5 %, 10 %, 15 % et 20 % (en mousse). Le pH a été mesuré par la potentiométrie, et le TAC a été déterminé par un test colorimétrique automatisé basé sur les radicaux cationiques ABTS. Une évaluation de croissance non détectable basée sur la culture a été réalisée en inoculant l’extrait sur l’agar sanguin, l’agar bleu de méthylène à l’éosine et le agar dextrose de Sabouraud, suivie d’une incubation aérobie et d’une inspection visuelle à 24h, 48h et 72h. Le criblage antimicrobien d’un mélange test 70:30 (v/v) d’aloès vera/N-acétyl-L-cystéine a été réalisé contre des souches de référence standard par diffusion de disque et par dilution qualitative à tubes doubles. La TAC différait significativement entre les groupes (Kruskal-Wallis, p = 0,014), avec les valeurs les plus élevées observées dans la formulation à 20 %. Aucune croissance bactérienne ou fongique visible n’a été observée dans les conditions de culture testées pendant la période d’observation de 72 heures. Le mélange test Aloe vera/N-acétyl-L-cystéine a produit des zones d’inhibition allant de 11 mm à 17 mm, la plus grande zone observée contre Pseudomonas aeruginosa. Ce flux de travail offre une approche pratique en laboratoire pour préparer et caractériser préliminairement l’Aloe vera frais.formulations basées sur des formulations pour la recherche en médecine complémentaire en phase précoce.

Introduction

L’aloès vera continue d’attirer une attention scientifique considérable en raison de son usage de longue date en médecine traditionnelle et de sa pertinence croissante dans la recherche pharmaceutique, biomédicale, cosmétique et^{alimentaire 1,2,3}. Cette plante médicinale contient une grande diversité de constituants biologiquement actifs, notamment des polysaccharides, des composés phénoliques, des anthraquinones, des vitamines, des minéraux, des enzymes et d’autres métabolites à faible poids moléculaire qui peuvent contribuer à ses propriétés thérapeutiques et ^{fonctionnelles 1,2,3}. Parmi ces composantes, l’acemannan a été mis en avant en raison de son potentiel biomatérial et de son rôle rapporté dans la réparation tissulaire, l’immunomodulation et les applications^{régénératrices 4,5}. Parallèlement, les composés phénoliques et autres antioxydants ont été associés aux effets éliminatoires, protecteurs et biologiquement favorisants de l’Aloe vera, provoquant des radicaux libres. Préparations ^2,3.

Ces dernières années, l’intérêt pour l’intégration de l’aloès vera dans des systèmes de formulation avancés et des matériaux bioactifs a augmenté ces dernières années. Les hydrogels à base d’aloe vera, les encres biomatériaux, les nanocomposites et les échafaudages imprimés en trois dimensions ont été étudiés pour des applications de cicatrisation des plaies et de soutien tissulaire en raison de leur grande capacité d’hydratation, de leur biocompatibilité et de leurs propriétés biologiques^{multifonctionnelles} 4,6,8,9,10,11. Des études expérimentales ont montré que les matériaux contenant de l’aloe vera peuvent soutenir la prise en charge des plaies en contribuant à un environnement humide, en améliorant les propriétés physicochimiques de la formulation et en fournissant un soutien antioxydant ou antimicrobien dans certaines conditions in vitro, in vivo et dépendantes de la^formulation 4,7,8,9,10,11. De plus, l’aloès vera a été exploré dans les applications de conservation et de formulation alimentaire, où les revêtements à base de gel et les systèmes associés ont été associés à une meilleure stabilité oxydative, une meilleure qualité sensorielle et une performance microbiologique^{accrue 12,13}. Ces développements indiquent que l’Aloe vera. est de plus en plus considéré non seulement comme un produit à base de plantes traditionnelle, mais aussi comme un matériau naturel multifonctionnel avec un potentiel de formulation large 2,3,12,13.

La pertinence biologique de l’aloès vera s’étend également aux applications à orientation antimicrobienne et microbiologique. Des études récentes ont décrit les effets inhibiteurs de préparations contenant de l’aloe vera ou des préparations contenant de l’aloe vera contre des micro-organismes cliniquement importants, notamment Propionibacterium acnes, Enterococcus faecalis, des espèces de Candida, ainsi que des isolats cliniques isolés d’infections de plaies 14,15,16,17. Des preuves in vitro antérieures ont également montré une activité d’Aloe vera en gel interne contre des souches et isolés cliniques de référence d’Helicobacter ^{pylori 18}. De plus, des systèmes hybrides contenant de l’aloe vera ont été rapportés comme présentant des capacités combinées antimicrobiennes, antioxydantes et cicatrisantes, ce qui soutient davantage la nature multifonctionnelle de ce matériau d’origine^{végétale 19}. Cependant, la performance biologique de l’aloe vera est influencée par plusieurs variables méthodologiques, notamment la fraction végétale utilisée, la procédure d’extraction, la concentration, les conditions de manipulation, la fraîcheur du gel, et si la préparation testée ne contient que du gel interne ou des composants associés au^{latex 2,20}. Ces facteurs sont particulièrement importants car les fractions du gel interne et des feuilles externes diffèrent à la fois par leur composition et leur profil^{toxicologique 20}.

Malgré la croissance de la littérature, d’importantes lacunes méthodologiques subsistent. Dans de nombreuses études publiées, le comportement antioxydant, les propriétés physicochimiques, l’évaluation microbiologique et la performance antimicrobienne sont souvent évalués séparément plutôt que dans un flux de travail intégré unique. Pour la recherche axée sur la formulation, cependant, ces paramètres sont étroitement liés. Une préparation peut présenter une activité antioxydante favorable tout en nécessitant une évaluation microbiologique rigoureuse et une caractérisation physicochimique avant de pouvoir être jugée adaptée à un développement expérimental ultérieur. Ainsi, des flux de travail en laboratoire combinant l’évaluation liée au redox, l’évaluation du pH, les tests de croissance non détectable à base de cultures dans des conditions définies, et le dépistage préliminaire des antimicrobiens pourraient fournir une base plus pratique et informative pour la caractérisation précoce des formulations fraîches d’Aloe vera .

En conséquence, cette étude visait à évaluer les formulations fraîches d’extraits d’Aloe vera en gel interne préparées à différentes concentrations en termes de caractéristiques de pH, de capacité totale d’antioxydants, de statut de croissance non détectable en culture dans des conditions de laboratoire définies, et de dépistage antimicrobien préliminaire par diffusion disque et dilution qualitative en tube double. En intégrant ces évaluations dans un seul flux de travail expérimental, l’étude a été conçue pour fournir une approche de base pratique pour la caractérisation préliminaire de l’Aloe vera.formulations à base de formules destinées à la recherche en médecine complémentaire.

Protocole

1. Préparation de l’Aloe vera. Série d’extraits et de dilution

1. Récoltez les feuilles matures d’un plant d’aloès vera cultivé à température ambiante et rincez-les soigneusement sous l’eau courante pour éliminer tout résidu.
2. Dans un cabinet de biosécurité niveau 2 (BSL-2), désinfectez la surface foliaire avec 70 % d’éthanol à l’aide de gants stériles. Après avoir appliqué 70 % d’éthanol, laissez la surface de la feuille sécher complètement à l’air libre pendant au moins 2 minutes avant l’incision aseptique.
3. À l’aide d’un scalpel stérile, retirez la pointe distale et les bords de la feuille, laissez l’exsudat de latex jaune s’écouler complètement pendant environ 30 minutes, puis filetez la feuille longitudinalement. Séparez soigneusement et ne recueillez que le gel interne transparent en évitant la couche externe de la raccourci et les résidus de latex.
4. Transférez soigneusement le gel interne d’aloe vera dans un récipient stérile et homogénéisez par vortex intermittent pendant environ 5 à 10 minutes à environ 2 500 tr/ min (ou un réglage équivalent moyen-élevé) ; effectuez la procédure à température ambiante, sauf si un contrôle de température est nécessaire pour l’instrument spécifique.
5. En conditions aseptiques, préparez des formulations d’extraits d’Aloe vera frais à 5 %, 10 %, 15 % et 20 % (en semaine) à l’aide d’eau distillée stérile ; par exemple, préparer 5 % (p/v) sous forme de gel de 5 g porté à un volume final de 100 mL, et ajuster les concentrations restantes de manière analogique.

2. Mesure du pH

1. Effectuer un étalonnage de mesure de pH à trois points en utilisant des solutions tampons de pH standard 4,01, 7,00 et 10,01 avec traçabilité NIST avant chaque série de mesures.
2. Mesurer le pH pour chaque concentration à température ambiante (20–25 °C) ; Enregistrez au moins trois réplications techniques par concentration.

3. Mesure de la capacité totale d’antioxydants (TAC)

1. Utilisez les formulations d’extraits d’aloe vera préparées à l’étape 1 (5 %, 10 %, 15 % et 20 %) pour la mesure du TAC.
2. Amenez tous les réactifs et échantillons à température ambiante (20–25 °C) avant l’analyse afin d’assurer la cohérence analytique.
3. Calibrez l’analyseur biochimique automatisé (Rel Assay, Turquie) selon les procédures opérationnelles standard du fabricant avant d’initier l’analyse.
4. Chargez les réactifs à capacité totale d’antioxydants (TAC) basés sur la méthode Erel dans les compartiments des réactifs de l’analyseur.
5. Pipettez l’aloe vera. Extraire les échantillons dans les gobelets ou puits de réaction appropriés à l’aide de micropipettes calibrées. (Volume d’échantillon : 5 μL)
6. Lancer l’exécution du test TAC en utilisant le protocole programmé par l’analyseur pour la méthode basée sur les radicaux cationiques ABTS, en suivant les volumes de réactifs et les réglages d’incubation spécifiés par le fabricant.
7. Laissez la réaction se dérouler automatiquement, période durant laquelle les antioxydants présents dans l’échantillon réduisent le cation radical ABTS coloré, entraînant une diminution de l’absorbance.
8. Mesurez le changement d’absorption spectrophotométriquement à la longueur d’onde spécifiée définie par la méthode TAC. (Longueur d’onde : 660 nm)
9. Calculez les valeurs totales de capacité antioxydante à l’aide du logiciel de l’analyseur en comparant les variations d’absorption de l’échantillon à la courbe d’étalonnage équivalente à Trolox.
10. Exprimez les résultats TAC en équivalents MMOL Trolox / L par unité de volume d’extract.
11. Effectuez toutes les mesures en double afin d’assurer la fiabilité analytique.

4. Évaluation de croissance non détectable basée sur la culture d’aloe vera. Gel interne

1. Inoculez 10 μL de chaque extrait sur l’agare sanguin, l’agar bleu de méthylène à l’éosine et l’agar dextrose Sabouraud à l’aide d’une boucle calibrée (10 μL) (méthode de comptage des colonies).
2. Pour une évaluation de croissance non détectable basée sur la culture, il faut dispenser aseptiquement une aliquote standardisée de 50 μL à l’aide d’une micropipette calibrée sur des plaques d’agar sanguin, d’agar, de méthylène bleu d’éosine et d’agar Sabouraud, puis l’étaler doucement à l’aide d’une boucle jetable stérile (10 μL) (évaluation de la reproduction basée sur culture utilisant la méthode du goutte-à-goutte direct).
3. Incubez les plaques d’agar sanguin et d’éosine méthylène bleu aérobie à 37 °C et les plaques d’agar dextrose Sabouraud aérobies à 25–28 °C, puis inspectez visuellement les plaques pour détecter la croissance à 24, 48 et 72 h. Incubez une plaque non inoculée de chaque milieu en parallèle comme témoin négatif.

5. Évaluation de l’activité antimicrobienne du mélange test d’aloès vera

1. Dans des conditions stériles, préparez une solution test homogène en mélangeant un extrait de gel interne stérile d’aloès vera à 70 % avec une solution à 30 % de N-acétyl-L-cystéine (10 % en mousse/v dans de l’eau stérile).
   REMARQUE : Ce mélange réduit la forte viscosité du gel extrait de la feuille et obtient une consistance plus fluide. Considérez cette formulation composite comme un mélange de dépistage préliminaire. Par conséquent, interprétez les résultats antimicrobiens pour refléter l’activité combinée des deux composants.
2. Manipulez soigneusement le mélange homogénéisé jusqu’à obtenir une solution uniforme.
3. Sous-culture des stocks bactériens standard précédemment cryopréservés d’Enterococcus faecalis ATCC 29212, Staphylococcus aureus ATCC 29213, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 et Escherichia coli. ATCC 25922, stocké à -80 °C, sur de l’agar sanguin standard (pour les bactéries Gram-positives) et de l’agar éosine méthylène bleu standard (pour les bactéries Gram-négatives), et incubé à 37 °C pendant 18 à 24 heures.
4. À la fin de l’incubation, préparez des suspensions bactériennes ajustées à 0,5 de turbidité McFarland à l’aide de solution saline stérile provenant des colonies cultivées, suivant les recommandations standard de préparation de l’inocule pour le test de susceptibilité^{aux antimicrobiens 38}.
5. Inoculez uniformément les plaques d’agar Mueller-Hinton avec chaque suspension bactérienne standardisée à l’aide d’un prélèvement stérile.
6. Appliquez un volume standardisé de 15 μL du mélange stérile d’Aloe vera/NAC sur chaque disque antimicrobien stérile de 6 mm à l’aide d’une micropipette calibrée. Le même volume de chargement, le même temps d’absorption (au moins 2 min) et le même temps de séchage à l’air (environ 5 min) ont été appliqués à tous les disques entre les réplications afin d’assurer la cohérence procédurale. Ce volume a été choisi comme quantité de charge pratique pour les disques de 6 mm dans le criblage de diffusion de disque à base d’extrait végétal et a été maintenu constant pour toutes les expériences.
7. Placez les disques imprégnés d’extrait sur la surface des plaques d’agar inoculées à l’aide de pinces stériles.
8. Incuber les plaques à 37 °C pendant 18 à 24 heures en conditions aérobies.
9. Après l’incubation, mesurez manuellement le diamètre de chaque zone d’inhibition, y compris le diamètre du disque, au millimètre le plus proche à l’aide d’une règle. Effectuer l’expérience comme une seule mesure descriptive, rapportant les diamètres de zone enregistrés comme des valeurs observées individuellement. Effectuez des mesures en inspectant visuellement les plaques conformément aux recommandations standard de lecture de diffusion^{discale 38}.
10. Préparez des dilutions en série doubles (1/2, 1/4, 1/8 et 1/16) du mélange test 70:30 (v/v) Aloe vera/NAC dans un bouillon Mueller-Hinton.
11. Inoculez chaque tube avec 500 μL de la suspension bactérienne standardisée McFarland de 0,5 préparée dans une solution saline stérile. Préparez une série de dilution distincte pour chaque souche de référence et incubez les tubes inoculés dans les conditions spécifiées ci-dessous.
12. Incubez les tubes inoculés à 37 °C pendant 18 à 24 heures.
13. Évaluer visuellement la croissance microbienne par turbidité par rapport au bouillon de contrôle ; interpréter l’essai de manière qualitative plutôt que comme une détermination formelle de la CIM.
14. Utilisez un disque de ciprofloxacine (5 μg) comme contrôle positif en parallèle avec des disques imprégnés d’aloe vera/NAC. Appliquer le même disque témoin positif pour Enterococcus faecalis ATCC 29212, Staphylococcus aureus ATCC 29213, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 et Escherichia coli ATCC 25922 afin de confirmer la susceptibilité en conditions de diffusion du disque.
    REMARQUE : Effectuer toutes les procédures microbiologiques en conditions BSL-2 et enregistrer toutes les observations de diamètre de zone et de turbidité immédiatement après l’incubation pour une analyse descriptive ultérieure. Ce protocole combine une préparation aseptique d’A. vera.extrait avec des tests biochimiques et microbiologiques complémentaires pour soutenir le développement de formulations végétales destinées à la médecine topique et complémentaire. Le flux de travail est conçu pour être pratique dans les laboratoires de routine : le dépistage du pH et du rédox (TAC) peut être réalisé parallèlement à la culture de stérilité et à deux tests antimicrobiens couramment utilisés (diffusion du disque et dilution par tube).

Résultats

Valeurs de pH de l’Aloe Vera. Extrait à différentes concentrations

Le profil pH montrait un schéma non monotone sur plusieurs concentrations. Les valeurs moyennes de pH étaient de 6,47, 6,60, 6,26 et 6,28 pour les formulations à 5 %, 10 %, 15 % et 20 %, respectivement. Les différences globales entre groupes étaient significatives (p = 0,024). Les formulations à 5 % et 10 % présentaient des valeurs de pH relativement plus élevées, tand...

Discussion

La présente étude propose un flux de travail intégré en laboratoire pour la caractérisation préliminaire des formulations fraîches d’extraits d’Aloe vera en gel interne, combinant la mesure du pH, l’analyse de la capacité totale d’antioxydants (TAC), une évaluation de croissance non détectable basée sur des cultures et un dépistage descriptif antimicrobien. Des concentrations croissantes d’Aloe vera interne fraîche étaient associées à des valeurs TAC plus élevées, tandi...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
(-)80 C Deep Freezer	Thermofisher/USA	Stockage des échantillons	TSX40086A
Vortex	Thermofisher/USA	Préparation des échantillons	88882010
Blood Agar	RTA/Turquie	Inoculation de la culture	2001
Eosine Methilene Blue Agar	RTA/Turquie	Inoculation de la culture	2010
SDA Agar	RTA/Turquie	Inoculation de la culture	2036
Müller Hinton Agar	RTA/Turquie	Inoculation de la culture	2022
Müller Hinton Broth	RTA/Turquie	Dilution de la culture	1018
Pipettes	Thermofisher/USA	Préparation des échantillons	4642090N
Hanna pH Meters	Hitachi/JAPON	Analyses d'échantillons	HI2211-02
Rel Assay Plate Reader	Rel Assay(Turquie)	Analyses TAC d'échantillons	M201 (Smart Model)
TAC Kits	Rel Assay(Turquie)	Kit	RL0017