Ce protocole présente une technique simplifiée d’anastomose de suture de bout en côté pour la transplantation de cœur cervical murin, fournissant un modèle robuste et reproductible pour l’étude de l’immunologie de la transplantation.
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Article de méthode
Transplantation cardiaque hétérotope cervicale de souris utilisant la technique d’anastomose de bout en côté pour étudier l’immunologie de la transplantation
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Dans cet article
Résumé
Résumé
La transplantation cardiaque hétérotopique murine est un modèle préclinique essentiel dans la recherche sur la transplantation. La transplantation cardiaque hétérotope cervicale chez la souris offre des avantages distincts, notamment un suivi visuel direct et palpable de la viabilité du greffon, une réduction des traumatismes chirurgicaux et une récupération postopératoire plus rapide. Elle est donc devenue une plateforme de plus en plus précieuse pour l’étude de l’immunologie de la transplantation, particulièrement précieuse pour les animaux souffrant de troubles physiologiques défavorisés par la modification génétique ou l’induction de médicaments, et pour les expériences nécessitant une transplantation d’organes secondaires ou combinées, la région cervicale devient souvent le seul site faisable. Les techniques conventionnelles de transplantation cervicale, qu’elles utilisent des sutures de bout en bout ou des méthodes à manche, nécessitent une ligature permanente de l’artère carotide commune et de la veine jugulaire externe du receveur, ce qui peut compromettre la perfusion cérébrale et introduire des matériaux étrangers ou des troubles hémodynamiques. Pour remédier à ces limites, cet article détaille une technique affinée de transplantation du cœur cervical utilisant une anastomose vasculaire de bout en côté. La méthode préserve l’artère carotide commune et la veine jugulaire externe du receveur, maintenant une perfusion cérébrale normale et évitant les complications liées à la ligature permanente des vaisseaux. Ce protocole détaille les étapes allant de la prélèvement du cœur par donneur à l’anastomose du receveur et aux soins postopératoires. Les résultats représentatifs montrent un taux de réussite chirurgical élevé (96,7 %) et l’efficacité du modèle dans l’étude du rejet des allogreffes. Cette technique offre un modèle physiologiquement pertinent et techniquement accessible pour les chercheurs en immunologie de transplantation.
Introduction
Au cours du dernier demi-siècle, l’immunologie de la transplantation est restée un centre d’intérêt pour les immunologistes et les spécialistes de la transplantation. Aujourd’hui, la transplantation d’organes solides est largement réalisée et représente le traitement le plus efficace pour les maladies terminales des organes. Cependant, le rejet de greffon n’a pas été fondamentalement résolu et reste l’un des principaux obstacles à la transplantation ainsi qu’une cause majeure de perte degreffe 1. Par conséquent, dépasser ou atténuer le rejet tout en réduisant ou évitant l’immunosuppression systémique reste un défi important et un objectif clé de recherche dans ce domaine.
Les modèles de transplantation d’organes animaux vascularisés, en particulier les modèles murins, ont joué un rôle crucial dans l’avancement de l’immunologie de la transplantation et ont constitué une base scientifique essentielle pour la traductionclinique 2. Par exemple, de nombreux agents immunosuppresseurs utilisés cliniquement aujourd’hui — tels que la cyclosporine, le tacrolimus et la rapamycine — ont été validés avec succès pour la première fois dans des modèles de greffemurine 3,4.
Le modèle de transplantation cardiaque hétérotopique (TH) de souris est l’un des modèles précliniques les plus utilisés, privilégié en raison de l’abondance de souches génétiques disponibles et de réactifs de recherche, ainsi que de sa procédure relativement simple et de sa simple surveillance postopératoire. En tant que tel, il sert de plateforme clé pour étudier les mécanismes de rejet aigu, induire la tolérance immunitaire et évaluer de nouveaux immunosuppresseurs in vivo 5,6.
Le premier modèle HT hétérotopique murin a été établi par Corry et al.7 en 1973. Dans ce modèle, le cœur du donneur est placé dans la cavité abdominale du receveur, tandis que l’aorte greffière et l’artère pulmonaire (PA) sont anastomosées d’un bout à l’autre de l’aorte abdominale et de la veine cave inférieure (VCI) du receveur, respectivement. Cette méthode est restée la technique standard pour la TH abdominale pendant des décennies. Motivé par la nécessité d’accueillir des allograftes tierces dans les études de tolérance, un second site pour la HT a été exploré. Cela a conduit au développement de modèles de TH cervicales chez la souris, qui offrent d’autres avantages tels qu’une évaluation visuelle directe de la viabilité du greffon, un moins de traumatismes chirurgicaux et un risque réduit d’infectionpostopératoire 5,8,9. En 1991, Chen et al.8 ont décrit pour la première fois un modèle hétérotope cervical HT chez la souris, impliquant une suture manuelle de bout en bout de l’aorte et une augmentation de la maladie de l’aorte du donneur et de l’PA à l’artère carotide commune (CCA) et à la veine jugulaire externe (EJV) du receveur, respectivement. Cependant, ce modèle n’a pas été largement adopté en raison du défi technique important posé par le grave décalage entre l’aorte du donneur et le CCA receveur, qui rendait l’anastomose vasculaire extrêmement difficile.
Toujours en 1991, Matsuura et al.9 ont introduit une technique de brassette non à suture pour l’anastomose vasculaire dans le modèle HT cervical. Cette méthode simplifie la procédure en éliminant la suture vasculaire manuelle, techniquement exigeante, ce qui facilite la maîtrise. Par la suite, de nombreux raffinements techniques de la technique du manchon ont étérapportés 10,11. Actuellement, la méthode du brassard est largement utilisée en TH cervicale, en particulier par des chercheurs sans expérience préalable en suture microvasculaire. Cependant, la technique du manchon introduit des matériaux artificiels, qui peuvent induire une inflammation locale et interférer avec les évaluations immunologiques, tout en posant des défis techniques dans les vaisseaux de petitcalibre 5,6. Récemment, Liao et al.12 ont proposé une technique de manchon sans manchon en TH cervicale, dans laquelle les vaisseaux donneur et receveur sont directement anastomosés à l’aide d’une méthode à manche. En évitant les matériaux artificiels et en accueillant de petits vaisseaux, cette approche offre une plateforme physiologique et reproductible pour la transplantation cardiaque secondaire.
Néanmoins, les techniques de suture de bout en bout et de brassard sans suture nécessitent une ligature permanente de la CCA unilatérale et de l’EJV du receveur. Cela compromet l’apport sanguin unilatéral au système nerveux central, ce qui peut entraîner des complications neurologiques, telles que le trouble directionnel et l’hémiplégie 13,14,15. De plus, ces approches de bout en bout peuvent entraîner des troubles de l’hémodynamique, comme des jets artériels à haute vitesse, et comportent un risque accru de thrombose et de sténose, qui sont préjudiciables à la survie à long terme des greffons. De plus, la technique du brassard comporte également un risque inhérent de thrombose en raison de la présence du bracelet.
Pour remédier à ces limites, nous avons adopté une technique de suture manuelle améliorée de bout en côté où l’aorte ascendante et la PA du donneur sont anastomosées respectivement à la CCA et à l’EJV du receveur. Cette méthode préserve l’intégrité et la continuité des principaux vaisseaux cervicales du receveur, maintenant ainsi une perfusion cérébrale normale et respectant le principe 3R (Remplacement, Réduction et Raffinement) de la recherche animale. Grâce à cette technique, nous avons obtenu un taux de réussite chirurgicale d’environ 96,7 % (29/30, avec une seule mortalité due à une hémorragie). Aucune complication liée à l’ischémie cérébrale n’a été observée chez les souris receveuses après l’opération. Cette méthode ressemble étroitement aux modèles abdominaux standards et convient particulièrement aux chirurgiens ayant une expérience en suture vasculaire pour établir des modèles de TH cervicale.
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Protocole
Les soins aux animaux ont respecté les directives internationales, et toutes les procédures ont été menées à l’Institut de Transplantation d’Organes, à l’hôpital Tongji, au Collège médical de Tongji, à l’Université des sciences et technologies de Huazhong, en Chine. L’approbation éthique de l’étude a été obtenue par le Comité d’éthique animale de l’hôpital Tongji (Numéro d’approbation : TJH-202310010). Les instruments appropriés utilisés pour l’étude sont listés dans le Tableau des Matériaux.
1. Préparation préopératoire
- Stérilisez la salle d’opération à l’aide d’une lampe ultraviolette pendant 30 minutes. Désinfectez la table d’opération avec 70 % d’éthanol et autoclave de tous les instruments chirurgicaux (121 °C pendant 20 minutes).
- Utilisez des mâles adultes C57BL/6 et des souris BALB/c (pesant 20–25 g ; âgées de 8 à 10 semaines). Pour la transplantation syngénique, utilisez des souris C57BL/6 comme donneuses et receveuses. Pour la transplantation allogénique, utilisez des souris BALB/c comme donneuses et des souris C57BL/6 comme receveuses.
- Administrez une analgésie préopératoire à la souris receveuse par injection sous-cutanée de buprénorphine (0,05 mg/kg) 1 heure avant l’opération.
REMARQUE : L’analgésie préopératoire n’est pas réalisée sur la souris du donneur, car le donneur est euthanasié immédiatement après la prélèvement cardiaque. - Préparez la solution anesthésiante contenant de la kétamine (20 mg/mL) et de la xylazine (2 mg/mL). Anesthésiez la souris avec une anesthésie à la kétamine préparée par injection intrapéritonéale avec un volume de dose de 5 μL/g. Confirmez l’efficacité de l’anesthésie en observant une respiration lente et régulière, la perte du réflexe de redressement et l’absence de réflexe pédal.
- Raser les poils des zones thoracique et abdominale. Fixez la souris en position couchée sur un coussin chauffant pour maintenir la température corporelle. Désinfectez le site chirurgical en alternant povidone-iode et 70 % d’éthanol pendant trois cycles. Allongez le cou du receveur en rétractant les incisives supérieures vers le haut avec un fil de soie 6-0 pour optimiser l’exposition.
- Portez des gants chirurgicaux stériles. Faites une ouverture ovale légèrement plus grande que le site de l’incision sur un drapeau stérile. Ensuite, utilisez-le pour couvrir la souris destinataire.
2. Prélèvement de cœur par donneur
- Réaliser une incision abdominale médiane suivie d’une incision transversale (cruciforme) pour exposer complètement la cavité péritonéale.
- Rétractez doucement l’intestin grêle vers la gauche à l’aide d’un coton tige-coton stérile humidifié à la solution saline pour exposer l’aorte abdominale et la cavité intraveineuse.
- Injectez 0,3 mL de solution physiologique héparinisée (300 UI/mL) dans la VCI et attendez 1 minute pour l’héparinisation systémique. Transsectez l’aorte abdominale et la VCI pour exsanguiner le donneur.
- Incisez le diaphragme ainsi que la paroi thoracique antérieure pour réaliser une incision en U à travers la cage thoracique à l’aide de ciseaux afin d’exposer la cavité thoracique.
- Injectez 2 mL de solution saline froide (4 °C) dans le cœur via la VCI intrathoracique pour éliminer le sang résiduel.
REMARQUE : Le but principal de cette étape est d’induire l’hypothermie et de faire cesser rapidement le cœur. Le second objectif est d’éliminer complètement le sang du cœur, en particulier des artères coronaires. - Couvrez le cœur d’une gaze stérile trempée dans une solution saline froide (4 °C). Une traction descendante douce sur cette gaze facilite une exposition optimale de l’aorte et de la PA. De plus, la gaze imbibée de solution saline froide permet de maintenir l’hypothermie du greffon lors de la dissection qui suit.
- Identifier et isoler la CCI intrathoracique. Ligatez-le avec une suture en soie 6-0 et transectez distalement à la ligature avec des microciseaux.
- Identifiez et retirez le thymus pour exposer l’arc aortique et la PA. Identifier et isoler la veine cave supérieure. Liguez-le avec une suture en soie 6-0. Coupez-le distalement à la ligature.
- Identifier et isoler l’aorte ascendante. Transsectez l’aorte proximal à l’artère innominate pour maximiser la longueur du vaisseau.
- Identifiez et isolez l’AP. Transectez-le juste à proximité de sa bifurcation. Ligature tous les vaisseaux situés en postérieur au cœur (les veines pulmonaires) avec une soie 6-0. Retirez soigneusement le cœur à l’aide de microciseaux.
- Déplacez doucement le cœur et immergez-le dans une solution saline froide (4 °C) posée sur de la glace pour la conservation jusqu’à la transplantation.
3. Opération bénéficiaire
- Isolement du récipient
- Réaliser une incision longitudinale de 1 cm sur le côté droit du cou, s’étendant du bord supérieur du point médian de la clavicule droite jusqu’au bord inférieur de la mandibule.
- Exciser le lobe droit de la glande sous-mandibulaire. Transpercez le muscle sternocléidomastoïdien droit pour créer une poche suffisante pour l’implantation du cœur par donneur.
- Identifier et isoler le bon EJV et le bon CCA. Mobiliser l’EJV en cautérisant ses branches. Ensuite, isoler le CCA des tissus environnants. Évitez d’endommager le nerf vague associé lors de la dissection du CCA.
- Anastomose artérielle
- Obstruez simultanément l’EJV et la CCA à l’aide de deux pinces microvasculaires, l’une étant appliquée aux extrémités crâniennes des deux vaisseaux et l’autre aux extrémités caudales. Appliquez d’abord la pince crânienne, puis la pince caudale.
REMARQUE : Les pinces microvasculaires sont de préférence introduites du côté droit de la souris vers la gauche, avec les poignées de pince positionnées du côté droit. Cette orientation facilite l’anastomose vasculaire ultérieure et aide à réduire la compression de la trachée. - Faites pivoter la souris de 90° dans le sens des aiguilles d’une montre. Réaliser une incision longitudinale sur le CCA, en veillant à ce que la longueur corresponde au diamètre de l’aorte ascendante du donneur. Rincez la lumière avec du sérum physiologique héparinisé pour éliminer complètement les caillots sanguins résiduels.
- Pour créer la fenêtre anastomotique, utilisez une suture 11-0. Faites passer l’aiguille à travers la paroi du vaisseau à une distance approximativement égale au diamètre du vaisseau donneur, soulevez doucement la paroi du vaisseau avec la suture puis excisez une petite portion avec des microciseaux.
- Placez le cœur donneur dans la poche cervicale. Ancrer l’aorte ascendante du donneur à la CCA receveuse en posant deux points de suture 11-0 avec des aiguilles aux extrémités proximale et distale. Placez le cœur donneur du côté droit du receveur et recouvrez-le d’une gaze humide stérile.
- À l’aide de la suture distale, effectuez une suture continue sur les parois postérieures dans une direction distale à proximale avec 6 à 8 points de suture.
- Après avoir terminé la suture de la paroi postérieure, faites pivoter la souris de 180°. Réfléchissez le cœur du donneur vers la gauche du receveur et recouvrez-le d’une gaze humide stérile. Compléter l’anastomose en suturant les parois antérieures des vaisseaux dans une direction proximale-distale avec 6 à 8 points de suture. Rincez la lumière avec du sérum physiologique avant de faire le nœud final pour éliminer les bulles d’air.
- Obstruez simultanément l’EJV et la CCA à l’aide de deux pinces microvasculaires, l’une étant appliquée aux extrémités crâniennes des deux vaisseaux et l’autre aux extrémités caudales. Appliquez d’abord la pince crânienne, puis la pince caudale.
- Anastomose veineuse
- Effectuer une incision longitudinale sur la VEJ, correspondant au diamètre du PA du donneur. Rincez la lumière avec du sérum physiologique héparinisé pour éliminer complètement les caillots sanguins résiduels.
- Ancrer le PA du donneur à l’EJV receveur en posant deux points de suture 11-0 avec aiguilles aux extrémités proximale et distale.
- À l’aide de la suture proximale, suturez continuellement les parois postérieures dans une direction proximale-distale avec 5 à 7 points de suture.
- Continuez avec la même suture pour fermer les parois antérieures de l’extérieur dans une direction distale à proximale avec 5 à 7 points de suture. Attachez la suture à l’apex proximal. Rincez la lumière avec du sérum physiologique avant de faire le nœud final pour éliminer les bulles d’air.
- Réperfusion
- Relâchez d’abord la pince distale, suivie de la pince proximale, pour initier la réperfusion. Lors de la réperfusion, le greffon cardiaque doit immédiatement devenir rouge. Le rythme normal et la contraction se récupèrent généralement en 1 à 2 minutes.
- Une fois l’hémostasie confirmée, positionnez soigneusement le greffon cardiaque dans la poche sous-cutanée, afin de veiller à l’absence de torsion des vaisseaux. Fermez l’incision cutanée avec des points 5-0.
- Soins postopératoires
- Placez la souris dans une cage propre et placez-la dans un incubateur pour nourrissons réglé à 34 °C pour faciliter la récupération. Surveillez la souris toutes les 1 à 2 heures jusqu’à ce qu’elle se réveille spontanément, puis remettez-la dans la cage de logement.
REMARQUE : Le réchauffement est nécessaire pour prévenir la dépression respiratoire induite par l’hypothermie et faciliter la récupération après l’anesthésie. - Administrez une analgésie postopératoire par injection sous-cutanée de buprénorphine (0,05 mg/kg) toutes les 12 heures pendant les 48 premières heures suivant l’opération.
- Surveillez quotidiennement les pulsations de la greffe cardiaque et enregistrez le statut de survie de la greffe.
- Placez la souris dans une cage propre et placez-la dans un incubateur pour nourrissons réglé à 34 °C pour faciliter la récupération. Surveillez la souris toutes les 1 à 2 heures jusqu’à ce qu’elle se réveille spontanément, puis remettez-la dans la cage de logement.
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Résultats
Trente cas ont été réalisés avec ce modèle modifié ; Le taux de réussite des opérations était de 96,7 % (29/30). Une seule mortalité est survenue à cause d’une hémorragie intraopératoire. Les 29 cas restants ont été inclus pour l’analyse des temps opératoires et des résultats de greffe. Aucune complication liée à l’ischémie cérébrale n’a été observée chez un receveur après l’opération. La prélèvement du cœur du donneur a été réalisé en 6,4 ± 0,7 min, et l’opération du receveur en 28,7 ± ...
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Discussion
Le modèle de TH cervicale utilisant la technique d’anastomose de bout en côté offre plusieurs avantages. Comparée à la suture de bout en bout ou à la méthode du manchet, cette approche préserve complètement la continuité de la CCA et de la VEJ, maintenant ainsi une hémodynamique cérébrale normale et évitant efficacement les complications liées à l’ischémie cérébrale. L’anastomose de bout en côté évite également les difficultés techniques causées par un décalage des diamètres des vaisseau...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (81700571).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 1mL Syring | Becton Dickinson Medical Devices Co., Ltd | B309628 | |
| 11-0 sutures with needles | Jinhuan Medical Products Co., Ltd. | H1101 | Pour l'anastomose vasculaire |
| 3mL Syring | Becton Dickinson Medical Devices Co., Ltd | B309657 | |
| 5-0 sutures with needles | Jinhuan Medical Products Co., Ltd. | CR537 | Pour la fermeture cutanée |
| 6-0 silk suture | Jinhuan Medical Products Co., Ltd. | 2650182 | |
| Blood Stop Cautery | Ningbo Shunye Medical Co., Ltd. | BDD-YE-DT-1 | |
| Buprenorphine | Tianjin Institute of Pharmaceutical Research Pharmaceutical Co., Ltd | H12020275 | Analgésique |
| Cotton swabs | Fuqing Health & Integral Medical | 20230R | |
| Curved micro forceps | RWD life Science Co. | F11031-11 | Instrument chirurgical |
| Curved micro scissors | 66 Vision Tech Co., Ltd. | 54108B | Instrument chirurgical |
| Gauze swabs | Yubei Medical Materials Co., LTD | 21080274 | |
| Heparin sodium injection | North China Pharmaceutical Co., LTD | 2101131-2 | |
| Micro needle holder | World Precision Instruments Co., Ltd. | 555408NT | Instrument chirurgical |
| Micro vessel clip | Roboz Surgical Instrument Co | RS-5481T | |
| Micro Vessel clip applicator | Roboz Surgical Instrument Co | RS-5480 | |
| Needle holder | RWD life Science Co. | F31025-13 | Fermeture abdominale |
| Saline | Zhejiang Tianrui Pharmaceutical Co.,Ltd | 716092103 | |
| Straight micro forceps | RWD life Science Co. | F11029-11 | Instrument chirurgical |
| Surgical microscope | Leica | M650 | |
| Surgical platform | Personnalisé, magnétique | ||
| Tissue forceps | RWD life Science Co. | F12002-12 | Instrument chirurgical |
| Tissue scissor | RWD life Science Co. | S12003-09 | Instrument chirurgical |
Références
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Réimpressions et autorisations
